一种拟蕈状芽孢杆菌的制作方法

本发明涉及生物学及基因工程技术领域，特别是涉及一种拟蕈状芽孢杆菌。

背景技术：

近年来，我国家禽养殖产业迅猛发展，羽毛可占肉鸡体重的5％-7％，每年产量超过100万吨，大部分却并未得到利用，通常会被填埋或焚烧，不仅造成资源的巨大浪费，而且严重污染环境，甚至传播疾病，引起鸡新城疫、气囊炎和角膜结膜炎等，除此之外，焚烧还会释放出有害气体，而排放的氨、恶臭硫化氢导致头痛、恶心、腹泻等健康问题。羽毛中富含角蛋白，粗蛋白的含量可达85％以上，且氨基酸组成比较齐全，其中半胱氨酸的含量更是所有天然饲料之最。但角蛋白是一类富含二硫键结构稳定的“不溶于水的硬性蛋白”。目前，通常采用高温高压、强酸强碱和挤压膨化等物理化学方法对羽毛进行处理，工艺复杂、耗能多，且易引起环境污染。目前分离得到的多数羽毛降解菌降解羽毛效果不理想，且大部分微生物降解羽毛尚需要一定的前处理，筛选能够高效降解天然羽毛的微生物菌株更具有应用性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种拟蕈状芽孢杆菌，用来高效降解羽毛的菌株，提高羽毛降解效率。

首先，本发明公开一种拟蕈状芽孢杆菌，其核苷酸序列为如seqidno.1所示，该菌种还能用来降解羽毛。

本发明的技术方案为：

1材料和方法

1.1实验材料

北海养海鸭场内废弃羽毛堆积处采土样。家禽市场收集的鸡羽毛，用水洗净，烘干至衡重。

1.2培养基

lb营养培养基(g/l)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，琼脂20g，ph7.2～7.5

富集培养基(g/l)：酵母粉1g，nacl0.5g，k2hpo41g，mgso40.1g，未剪碎的羽毛少量，ph7.0

初筛培养基(g/l)：酪蛋白(脱脂奶粉)30g，k2hpo41.4g，kh2po40.7g，nacl0.5g，mgso40.1g，琼脂20g，ph7.0

种子培养基(g/l):牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，ph7.2

发酵培养基(g/l):整根羽毛10g，k2hpo41.4g，kh2po40.7g，nacl0.5g，mgso40.1g，ph7.0。

1.3拟蕈状芽孢杆菌的分离及筛选

1.3.1富集：10g土样加入80ml的无菌水中，震荡静止后取上清10ml于100ml富集培养基，37℃180r/min培养48h。

1.3.2初筛：取富集培养液，用无菌水做梯度稀释(10-1～10-7)并混匀，每个稀释梯度的菌液取100ul均匀涂布于脱脂奶粉平板上，置于30℃恒温培养箱中倒置培养72h(时间不定，定期观察)，挑选蛋白水解透明圈较大而明显的单菌落多次划线纯化，接斜面培养基保存备用。

1.3.3复筛：挑取初筛单菌落至种子培养基，30℃，200r/min的摇床培养15h，将培养好的种子按照1％(v/v)的接种量接种到羽毛发酵培养基，30℃，200r/min的摇床培养，发酵48h，离心发酵液，取上清液测定角蛋白酶活性和蛋白含量进行菌种筛选。

1.4菌株(拟蕈状芽孢杆菌)鉴定方法

1.4.1菌株(拟蕈状芽孢杆菌)形态学及生理生化特性

显微镜观察，革兰氏染色，生理生化实验参考细菌系统鉴定手册。

1.4.2产角蛋白酶菌株(拟蕈状芽孢杆菌)的分子鉴定

16srdna鉴定，用牙签从平板挑少量菌体加入30ul10％(ph7.0)chelex-100试剂，使用pcr仪设定好的程序裂解15min(100℃)冷却至室温。迷你离心机离心8min，吸取1ul作为pcr扩增模板。采用16srdna基因的通用引物配成25ul体系进行pcr反应。上游引物(1492r):5’-ggttaccttgttacgactt-3’,下游引物(27f)5’--3’。1％的琼脂糖电泳，测序，序列比对blast，该核苷酸序列如seqidno.1所示。该一种拟蕈状芽孢杆菌保藏编号为gdmcc60687，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2019年6月13日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类类别为bacillusparamycoides。

1.5菌株降解、利用羽毛角蛋白能力的检测

1.5.1菌株降解羽毛的定性测定

直接观察法：将所分离的菌株(拟蕈状芽孢杆菌)接入含完整羽毛的液体发酵培养基中发酵培养，测培养液中羽毛的降解程度。

1.5.2菌株降解羽毛的定量测定

1.5.2.1可溶性蛋白的测定

a蛋白质含量标准曲线的绘制：以牛血清蛋白(bsa)作为标准蛋白，精确配制成200ug/ml的稀释液，取7个2.0ml的无菌离心管，分别向其中加入成梯度浓度的标准蛋白稀释液，再加去离子水补足到200ul，配制成7个不同浓度梯度的标准蛋白(0、5、10、15、20、25、30ug/ml)，分别从上述标线蛋白溶液中取30ul注入96孔板中，每个浓度做3个平行，然后加入200ul考马斯亮蓝，混匀，放置2min后置于酶标仪上测定595nm波长处的吸光值，做标准蛋白浓度a595值标准曲线，进行线性回归，得到标准曲线和线性回归方程。

b.发酵上清液可溶性蛋白含量测定

发酵液离心(8000r/min，10min，4℃)得到上清液，经过适当稀释后取30ul样液，加入200ul考马斯亮蓝，混匀，放置2min后测定d595值，并通过标准曲线查得溶液的蛋白浓度。

本发明的有益效果是：本发明的提供一种拟蕈状芽孢杆菌且提供其基因序列，另外利用了该种一种拟蕈状芽孢杆菌来降解羽毛，降解效率高且降解前不需要对羽毛进行前处理，降解的过程不会对环境造成污染。

附图说明

图1是本发明一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛实验图

图2是本发明一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛后检验蛋白的检验报告

图3是本发明一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛后检验氨基酸的检验报告

图4是本发明羽毛降解过程中生物量、产酶及蛋白浓度曲线

具体实施方式

以下结合附图描述本发明的实施结构。

为了更为清楚的解释本发明的目的和技术方案以及要点，结合附图对本发明进一详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅以解释本发明。

如图1至图4所示，本发明的技术方案为：本发明所采用的材料和实验方法包括以下步骤：

1材料和方法

1.1实验材料

北海养海鸭场内废弃羽毛堆积处采土样。家禽市场收集的鸡羽毛，用水洗净，烘干至衡重。

1.2培养基

lb营养培养基(g/l)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，琼脂20g，ph7.2～7.5

富集培养基(g/l)：酵母粉1g，nacl0.5g，k2hpo41g，mgso40.1g，未剪碎的羽毛少量，ph7.0

初筛培养基(g/l)：酪蛋白(脱脂奶粉)30g，k2hpo41.4g，kh2po40.7g，nacl0.5g，mgso40.1g，琼脂20g，ph7.0

种子培养基(g/l):牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，ph7.2

发酵培养基(g/l):整根羽毛10g，k2hpo41.4g，kh2po40.7g，nacl0.5g，mgso40.1g，ph7.0。

1.3拟蕈状芽孢杆菌的分离及筛选

1.3.1富集：10g土样(土样中含有拟蕈状芽孢杆菌)加入80ml的无菌水中，震荡静止后取上清10ml于100ml富集培养基，置于37℃，180r/min摇床中培养48h。

1.3.2初筛：取富集培养液，用无菌水做梯度稀释(10-1～10-7)并混匀，每个稀释梯度的菌液取100ul均匀涂布于脱脂奶粉平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养72h(时间不定，定期观察)，挑选蛋白水解透明圈较大而明显的单菌落多次划线纯化，接斜面培养基保存备用。

1.3.3复筛：将培养好的种子液按照1％(v/v)的接种量接种到羽毛发酵培养基，置于30℃，200r/min的摇床培养，观察羽毛降解情况，发酵48h，发酵液离心，取上清液测定角蛋白酶活性和蛋白含量进行菌种筛选。

1.4菌种(拟蕈状芽孢杆菌)鉴定方法

1.4.1菌株(拟蕈状芽孢杆菌)形态学及生理生化特性

显微镜观察，革兰氏染色，生理生化实验参考细菌系统鉴定手册。

1.4.2产角蛋白酶菌株(拟蕈状芽孢杆菌)的分子鉴定

16srdna鉴定，用牙签从平板挑少量菌体加入30ul10％(ph7.0)chelex-100试剂，使用pcr仪设定好的程序裂解15min(100℃)冷却至室温。迷你离心机离心8min，吸取1ul作为pcr扩增模板。采用16srdna基因的通用引物配成25ul体系进行pcr反应。上游引物(1492r):5’-ggttaccttgttacgactt-3’,下游引物(27f)5’--3’。1％的琼脂糖电泳，测序，序列比对blast，得出拟蕈状芽孢杆菌核苷酸序列如seqidno.1所示，该种拟蕈状芽孢杆菌保藏编号为gdmcc60687，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2019年6月13日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类类别为bacillusparamycoides。

1.5菌株降解、利用羽毛角蛋白能力的检测

1.5.1菌株降解羽毛能力的定性测定

实验分组，分为实验组合和参照组，参照组和实验组都选用250ml三角瓶。分别提取75ml的发酵培养基分别装入参照组和实验组；其中，发酵培养基(g/l)为:整根羽毛10g、k2hpo41.4g、kh2po40.7g、nacl0.5g、mgso40.1g、ph7.0。接着将所分离的菌株(拟蕈状芽孢杆菌)接入实验组进行发酵培养，目测培养液中羽毛的降解程度。发酵时间每隔一天用相机拍照记录实验结果，如图1所示，其中图1中(a)为对照组发酵两天后的照片，图1中(b)为实验组发酵一天后的照片，图1中(c)为实验组发酵两天后的照片。结果分析，参照组中的羽毛基本完整，基本没发生降解，说明培养基对羽毛基本没有降解的作用；图1(b)中可看出，接入菌种后发酵一天后，羽毛只剩较大的枝干；图1(c)中可看出，接入菌种后发酵两天后，羽毛所剩无几，由此可以得出，该菌种具有高效降解羽毛的作用。将发酵两天的实验组(图1中(c))送检，测量羽毛降解后的产物，得到如图2、图3所示的检验报告，羽毛降解液中含有0.98％的粗蛋白、有机质含量31.9g/l、游离氨基酸4.02g/l，钾6.2g/l等成分，而这些成分都是从羽毛上分解出来的，从而进一步证明该菌种具有高效降解羽毛的作用。

1.5.2菌株降解羽毛的定量测定

将lb培养基(g/l)按照1％(v/v)接种量接入羽毛发酵培养基后，其中，lb培养基(g/l)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，琼脂20g，ph7.2～7.5。在发酵0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52h时分别取样，采用活菌计数法测定不同时间点发酵液中菌体数量；并测定不同时间点发酵液上清中蛋白酶活性的大小及可溶性蛋白含量，测定方法如下所示：

1.5.2.1可溶性蛋白的测定

a蛋白质含量标准曲线的绘制：以牛血清蛋白(bsa)作为标准蛋白，精确配制成200ug/ml的稀释液，取7个2.0ml的无菌离心管，分别向其中加入成梯度浓度的标准蛋白稀释液，再加去离子水补足到200ul，配制成7个不同浓度梯度的标准蛋白(0、5、10、15、20、25、30ug/ml)，分别从上述标线蛋白溶液中取30ul注入96孔板中，每个浓度做3个平行，然后加入200ul考马斯亮蓝，混匀，放置2min后置于酶标仪上测定595nm波长处的吸光值，做标准蛋白浓度a595值标准曲线，进行线性回归，得到标准曲线和线性回归方程，如图4所示。

b.发酵上清液可溶性蛋白含量测定

发酵液离心(8000r/min，10min，4℃)得到上清液，经过适当稀释后取30ul样液，加入200ul考马斯亮蓝，混匀，放置2min后测定d595值，并通过标准曲线计算溶液的蛋白浓度，如图4所示。

1.5.2.2角蛋白酶活力的测定

a.粗酶液的制备：将种子培养液接入装有50ml羽毛发酵培养基的250ml三角瓶中，置于35℃恒温摇床中进行发酵，转速为200r/min，发酵48h后得到角蛋白酶活为13770u。发酵液离心(12000r/min，10min)，取上清液，即为粗酶液，置于4℃保存。

b.底物ph7.52％酪蛋白溶液的制备

20g酪蛋白加入300ml0.1mol/l氢氧化钠溶液混匀置于80℃恒温水浴锅中溶解完全，再加入ph7.50.01mol/ltris-hcl溶液定容至1l调节ph至7.5。

c.酶活测定步骤

将发酵液离心(12000r/min10min4℃)，取上清液进行适当稀释，吸取200ul与300ul2％酪蛋白溶液(ph7.5)混匀，50℃水浴反应10min，加入500ul4mol/ltca溶液以终止反应。离心10min，吸取200ul上清液，依次加入1ml0.5mol/l碳酸钠溶液和200ul福林酚试剂，50℃反应10min。以200ul去离子水与底物反应作为空白，于660nm处检测吸光值。以酪蛋白为底物，每1min催化分解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需要的酶量定义为一个酶活单位。酶活计算公式为：x＝a*k*1/10*n(公式中：x：酶活力，u/ml；a：吸光度；k：吸光系数；l：反应总体积，1ml；10：反应时间10min；n：稀释倍数)。图4为角蛋白酶活随在不同时间的变化的曲线图。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式。但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或简单替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广西民族大学

<120>一种拟蕈状芽孢杆菌

<130>2019

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1409

<212>dna

<213>拟蕈状芽孢杆菌(bacillusparamycoides)

<400>1

tgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagt60

aacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccg120

gataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatgga180

tggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgta240

gccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg300

aggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgag360

tgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaat420

aagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccg480

cggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtg540

gtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggg600

agacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagat660

atggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaa720

agcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgct780

aagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctgg840

ggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgga900

gcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaca960

accctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtc1020

agctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagtt1080

gccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtgggg1140

atgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggt1200

acaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggat1260

tgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgcc1320

gcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaac1380

acccgaagtcggtggggtaaccttttgga1409