1.一种利用多重定量pcr技术检测样品中多种病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)通过待检测病毒dna和/或rna序列进行blast比对,设计并优化针对多种待检测病毒的特异性引物及探针;
(2)利用步骤(1)的特异性引物和探针来优化多重qpcr的反应条件,获得了优选的反应条件;
(3)通过稀释病毒原液和经典的细胞斑块实验,将103或104pfu的病毒稀释液调整为103或104拷贝的标准化ct值;根据调整后稀释液和稀释因子,从高滴度病毒库纯化制备106拷贝的病毒核酸标准品;将106拷贝病毒核酸标准品按10倍梯度稀释产生1到105拷贝的目标病毒基因标准品,进而通过abi7500pcr仪器检测产生病毒的标准曲线;
(4)采用一步法taqman检测试剂盒,按照所述步骤(2)得到的优选的反应条件进行检测;根据步骤(3)的标准曲线计算检测结果。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,待测病毒为x-mulv病毒和prv病毒。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,针对x-mulv病毒和prv病毒,所述特异性引物为:
x-mulv病毒的正向引物(fp1),其核苷酸序列如seqidno.1所示;
x-mulv病毒的逆向引物(rp1),其核苷酸序列如seqidno.2所示;
prv病毒的正向引物(fp2),其核苷酸序列如seqidno.3所示;
prv病毒的逆向引物(rp2),其核苷酸序列如seqidno.4所示;
所述探针为:
x-mulv病毒的探针(probe1),其核苷酸序列如seqidno.5所示;
prv病毒的探针(probe2),其核苷酸序列如seqidno.6所示。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中优选的反应条件为:
1)扩增体系:1-stepmastermix终浓度1x,fp-1终浓度900nm,rp-1终浓度900nm,probe-1终浓度200nm,fp-2终浓度900nm,rp-2终浓度900nm,probe-2终浓度200nm,模板,10μl,用ddh2o补足25μl体系;
2)扩增参数:step1:48℃,30min;step2:95℃,10min;step3:95℃,15sec;step4:60℃,1min;step3和step4,40cycles。
5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,将所述x-mulv病毒的rna先反转录成dna,再和prv病毒的dna一起检测。