一种生物固定丁醇发酵尾气和工业环氧乙烷尾气的装置的制作方法

本实用新型涉及一种利用丁醇发酵和环氧乙烷工业尾气生物转化琥珀酸的生产装置，具体涉及一种通过尾气比例调控发酵大肠杆菌制备琥珀酸的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术：

随着全球人口和工业化的增长，能源需求急剧增长。近年来，丁醇作为一种优秀的燃料替代品受到了国内外研究人员的高度重视。然而，生物法制备燃料丁醇的发酵过程中，丙酮酸和乙酰乙酸的脱羧反应以及厌氧呼吸的作用释放大量co2气体，同时胞内还原力nad(p)h会以h2的形式流失，造成了大量碳源和能量的浪费，这大大降低了该厌氧发酵过程的原子经济性。生物丁醇发酵过程中每立方发酵液可产生8~10立方的尾气，其中含有60～80%co2和20～40%h2。利用生物转化过程将这部分co2和h2资源化，不仅可以减少温室气体的排放，还能够进一步提高生物转化过程的碳原子经济性，彰显循环生物经济的特色。

厌氧琥珀酸发酵过程因其能够大量固定co2而被认为是一种绿色环保的生物过程。每形成一分子的琥珀酸，便可固定一分子的co2。琥珀酸发酵过程中co2气体首先经过气液界面溶解在溶液中，然后电离成hco3^-,co3^2-和co2三种形式（其总和被统称为溶解co2，dco2），最后通过细胞膜进入胞内解离为hco3^－被菌体利用。因此，co2的供给方式也是决定琥珀酸固定co2效率的关键之一。在厌氧琥珀酸发酵中胞内还原力nadh供给不足是限制其产量进一步提高的重要因素。h2作为一种高还原力的物质，不但可以有效维持发酵体系的厌氧环境，还可被部分微生物利用转化成胞内还原力nadh，供给细胞生长和产物合成。

工业环氧乙烷气体的制备主要是通过乙烯在催化剂银的作用下氧化生成，其主反应是：

其副反应会有大量的二氧化碳和水生成，因此，所得反应产物主要是环氧乙烷、二氧化碳和水，其中环氧乙烷约为85%，生成的乙醛量小于环氧乙烷的0.1%，生产中生成的甲醛量则更小。因此，环氧乙烷生产过程所产生的尾气经脱水后的co2含量可达99%。环氧乙烷尾气虽然可以通过高昂价格的处理装置搜集，目前为止，国际同行使用的处理方式不多，很难找到一个彻底、经济的合理方法。

技术实现要素：

本实用新型提供一种利用丁醇发酵和环氧乙烷工业尾气生物转化琥珀酸的生产方法，其对琥珀酸发酵效率显著提高，且发酵的琥珀酸产量高、糖转化率高，co2固定效率高。

本实用新型采用的技术方案如下：

一种高效生物固定丁醇发酵尾气和工业环氧乙烷尾气的方法，包括如下步骤：

第1步，获得丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气；

第2步，获得用于琥珀酸发酵的种子液；

第3步，获得用于生物固定丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气的培养基；

第4步，将第1步中得到的丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气以及第2步中得到的种子液供入培养基中，进行发酵，获得含有琥珀酸的发酵液。

在一个实施方式中，种子培养基中包括：lb培养基，包括蛋白胨10g/l,酵母粉5g/l,andnacl5g/l。

在一个实施方式中，发酵培养基中按照每升计，包括：3.0g柠檬酸,3.0gna2hpo4·7h2o,8.0gkh2po4,8.0g(nh4)2hpo4,0.2gnh4cl,0.8g(nh4)2so4,1.0gmgso4·7h2o,10.0mgcacl2·2h2o,0.5mgznso4·7h2o,0.3mgcucl2·2h2o,2.5mgmnso4·h2o,1.8mgcocl2·6h2o,0.1mgh3bo3,1.8mgal2(so4)3·5h2o,0.5mgna2moo4·2h2o,16.1mg柠檬酸铁,20.0mgvb1,and2.0mg生物素,0.12g甜菜碱,100g/l葡萄糖。

在一个实施方式中，第4步中进行发酵时，还包括：对丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气构成的混合气体中的co2含量进行调控的步骤。

在一个实施方式中，所述的进行调控是指调控丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气的体积比。

在一个实施方式中，所述的进行调控是指将混合气体中的co2含量调至95%-90%。

在一个实施方式中，所述的丁醇发酵尾气中co2含量为60%-80%，其余为h2。

在一个实施方式中，所述的环氧乙烷副产物产生的脱水尾气co2含量约为99%。

在一个实施方式中，第4步中发酵温度是35-38℃，发酵时间控制在50-100h。

在一个实施方式中，第4步中琥珀酸发酵菌株是e.colibsm209或琥珀酸高产工业大肠杆菌。

在一个实施方式中，还包括：对第4步中获得的含有琥珀酸的发酵液中提取琥珀酸的步骤，包括以下步骤：

s1，对发酵液采用微滤膜进行过滤处理；

s2，对微滤的透过液采用超滤膜进行浓缩处理；

s3，对超滤膜的透过液采用第一纳滤膜浓缩处理；

s4，纳滤膜的浓缩液进行结晶、离心后，获得琥珀酸。

在一个实施方式中，所述的微滤膜的平均孔径范围是50-200nm。

在一个实施方式中，所述的超滤膜的截留分子量是5000-20000da。

在一个实施方式中，所述的第一纳滤膜的截留分子量是200-400da。

在一个实施方式中，将超滤膜的浓缩液中加入絮凝剂进行絮凝处理，絮凝后的清液中加入二价金属盐离子，再送入第二纳滤膜进行过滤处理，使琥珀酸透过第二纳滤膜，采用反渗透膜对第二纳滤膜的透过液进行浓缩后，再进行结晶、离心处理，获得琥珀酸。

在一个实施方式中，第二纳滤膜的截留分子量是400-800da。

在一个实施方式中，所述的二价金属盐离子是氯化镁或者氯化钙，加入量是1-5g/l。

一种高效生物固定丁醇发酵尾气和工业环氧乙烷尾气的装置，包括：

发酵罐，用于采用厌氧法进行琥珀酸的发酵；

环氧乙烷尾气通入口，连接于发酵罐上，用于向发酵罐中供入环氧乙烷生产尾气；

丁醇发酵尾气通入口，连接于发酵罐上，用于向发酵罐中供入丁醇发酵尾气；

微滤膜，连接于发酵罐，用于对发酵后的发酵液进行微滤处理，去除菌体和固体杂质；

超滤膜，连接于微滤膜的渗透侧，用于对微滤膜的渗透液进行超滤处理，分离蛋白和琥珀酸；

第一纳滤膜，连接于超滤膜的渗透侧，用于对超滤膜的渗透液中的琥珀酸进行浓缩；

结晶器，连接于第一纳滤膜的截留侧，用于对第一纳滤膜的浓缩液进行结晶；

离心机，连接于结晶器，用于对结晶产生的母液进行离心处理，获得琥珀酸。

在一个实施方式中，超滤膜的浓缩侧连接于絮凝槽，絮凝槽用于对超滤膜中获得的浓缩液进行絮凝处理，去除大分子蛋白和胶体；絮凝槽上设有絮凝剂投加罐，用于向絮凝槽中加入絮凝剂；

还包括：

第二纳滤膜，连接于絮凝槽的清液侧，用于对絮凝槽中得到的清液进行纳滤处理，使小分子蛋白和琥珀酸分离；在第二纳滤膜的进料口上还连接有二价盐加入口，用于向进料口中加入二价盐；

反渗透膜，连接于第二纳滤膜的的渗透侧，用于对第二纳滤膜的渗透液进行浓缩处理；反渗透膜的浓缩侧连接于结晶器。

在一个实施方式中，第一纳滤膜的截留分子量是200-400da。

在一个实施方式中，第二纳滤膜的截留分子量是400-800da。

在一个实施方式中，还包括：co2传感仪、h2传感仪、ph电极、温度探头，分别连接于发酵罐上，分别用于对发酵罐内的co2、h2、ph和温度进行检测。

有益效果

本实用新型中，提出了一种利用丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气的方法，将其成功地应用于琥珀酸的发酵法制备过程中。

同时，本实用新型通过对两种尾气的体积比进行调控，使co2含量为95%-90%，相对于一般琥珀酸发酵过程琥珀酸产率、产量、收率提高了。

本实用新型对发酵液采用了膜分离的方法进行琥珀酸的提取，同时对微滤膜中的浓缩液实现了再次利用，进一步提高琥珀酸收率。

附图说明

图1是本实用新型的发酵装置图。

图2是本实用新型的提取装置图。

其中，1、co2传感仪；2、h2传感仪；3、ph电极；4、温度探头；5、取样口；6、环氧乙烷尾气通入口；7、丁醇发酵尾气通入口；8、发酵罐；9、微滤膜；10、超滤膜；11、第一纳滤膜；12、结晶器；13、离心机；14、絮凝槽；15、絮凝剂投加罐；16、二价盐加入口；17、第二纳滤膜；18、反渗透膜。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本实用新型作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本实用新型，而不应视为限定本实用新型的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本文使用的近似语在整个说明书和权利要求书中可用于修饰任何数量表述，其可在不导致其相关的基本功能发生变化的条件下准许进行改变。因此，由诸如“约”的术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在至少一些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精度相对应。除非上下文或语句中另有指出，否则范围界限可以进行组合和/或互换，并且这种范围被确定为且包括本文中所包括的所有子范围。除了在操作实施例中或其他地方中指明之外，说明书和权利要求书中所使用的所有表示成分的量、反应条件等等的数字或表达在所有情况下都应被理解为受到词语“约”的修饰。

以范围形式表达的值应当以灵活的方式理解为不仅包括明确列举出的作为范围限值的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有单个数值或子区间，犹如每个数值和子区间被明确列举出。例如，“大约0.1%至约5%”的浓度范围应当理解为不仅包括明确列举出的约0.1%至约5%的浓度，还包括有所指范围内的单个浓度（如，1%、2%、3%和4%）和子区间（例如，0.1%至0.5%、1%至2.2%、3.3%至4.4%）。

本说明书中的“去除”，不仅包括完全去除目标物质的情况，还包括部分去除(减少该物质的量)的情况。本说明书中的“提纯”，包括去除任意的或特定的杂质。

本文使用的词语“包括”、“包含”、“具有”或其任何其他变体意欲涵盖非排它性的包括。例如，包括列出要素的工艺、方法、物品或设备不必受限于那些要素，而是可以包括其他没有明确列出或属于这种工艺、方法、物品或设备固有的要素。

本实用新型的方法详述如下：

本实用新型的方法中，利用了丁醇发酵尾气以及工业环氧乙烷尾气；

丁醇尾气在收集过程均经过除油除水，在鼓入发酵罐之前需过滤除菌，丁醇发酵尾气中co2含量为60%-80%，其余为h2。

环氧乙烷副产物产生的脱水尾气co2含量约为99%。

本实用新型中将两者混合后用于琥珀酸的发酵过程使用。琥珀酸发酵菌株是e.colibsm209或琥珀酸高产工业大肠杆菌。

本实用新型中，发现在发酵过程中对混合气体的含量进行调控，可以获得较好的发酵收率。将混合气体中的co2含量调至95%-90%。

以上的发酵过程中，主要的控制参数是：发酵温度是35-38℃，发酵时间控制在50-100h。

在获得了发酵液后，本实用新型首先对发酵液进行微滤处理，其目的是去除掉发酵液中的细菌、大颗粒杂质、碎片等，所述的微滤膜的平均孔径范围是50-200nm。

再通过超滤膜进行过滤处理，主要是用于对发酵液中的蛋白和琥珀酸进行分离，因此，超滤膜的截留分子量适当要小一些，可以控制在5000-20000da。在这个范围内时，可以保持绝大部分的蛋白被截留，并且琥珀酸可以透过纳滤膜。

再通过纳滤膜对超滤的渗透液进行浓缩处理，这里所使用的纳滤膜的截留分子量可以适当小一些，优选200-400da，保证琥珀酸被截留，并且浓缩液中的无机盐可以透过纳滤膜进入渗透侧。再通过结晶、离心，可以将纳滤膜浓缩液中的琥珀酸回收。

由于超滤膜的浓缩液的体积仍然较多，并且其中含有较多的蛋白，也含有琥珀酸。本实用新型为了将这部分成分再次分离提纯，采用的方法是首先对超滤膜的浓缩液进行絮凝，例如加入100-200mg/l的聚合氯化铝絮凝剂，可以将大分子的蛋白絮凝，使其可以沉降。另外，还有一部分小分子蛋白留存于浓缩液中，本实用新型中通过在絮凝的上清液中加入一定量的二价盐（例如1-5g/l的氯化镁或者氯化钙），可以使小分子蛋白发生变性作用，使分子量增大，就可以通过截留分子量较大一些的纳滤膜将这些增大的小分子蛋白截留，并且使琥珀酸透过纳滤膜，而小分子蛋白被截留于纳滤膜中，就实现了小分子蛋白与琥珀酸的进一步分离。纳滤膜的透过液中主要留有琥珀酸，通过反渗透膜对纳滤膜的浓缩液进行浓缩之后，再经过结晶，离心，可以使琥珀酸回收。

基于以上的方法，本实用新型提供的装置如图1和图2所示，包括：

发酵罐8，用于采用厌氧法进行琥珀酸的发酵；

环氧乙烷尾气通入口6，连接于发酵罐8上，用于向发酵罐8中供入环氧乙烷生产尾气；

丁醇发酵尾气通入口7，连接于发酵罐8上，用于向发酵罐8中供入丁醇发酵尾气；

微滤膜9，连接于发酵罐8，用于对发酵后的发酵液进行微滤处理，去除菌体和固体杂质；

超滤膜10，连接于微滤膜9的渗透侧，用于对微滤膜9的渗透液进行超滤处理，分离蛋白和琥珀酸；

第一纳滤膜11，连接于超滤膜10的渗透侧，用于对超滤膜10的渗透液中的琥珀酸进行浓缩；

结晶器12，连接于第一纳滤膜11的截留侧，用于对第一纳滤膜11的浓缩液进行结晶；

离心机13，连接于结晶器12，用于对结晶产生的母液进行离心处理，获得琥珀酸。

在一个实施方式中，超滤膜10的浓缩侧连接于絮凝槽14，絮凝槽14用于对超滤膜10中获得的浓缩液进行絮凝处理，去除大分子蛋白和胶体；絮凝槽14上设有絮凝剂投加罐15，用于向絮凝槽14中加入絮凝剂；

还包括：

第二纳滤膜17，连接于絮凝槽14的清液侧，用于对絮凝槽14中得到的清液进行纳滤处理，使小分子蛋白和琥珀酸分离；在第二纳滤膜17的进料口上还连接有二价盐加入口16，用于向进料口中加入二价盐；

反渗透膜18，连接于第二纳滤膜的17的渗透侧，用于对第二纳滤膜17的渗透液进行浓缩处理；反渗透膜18的浓缩侧连接于结晶器12。

在一个实施方式中，第一纳滤膜11的截留分子量是200-400da。

在一个实施方式中，第二纳滤膜17的截留分子量是400-800da。

在一个实施方式中，还包括：co2传感仪1、h2传感仪2、ph电极3、温度探头4，分别连接于发酵罐8上，分别用于对发酵罐内的co2、h2、ph和温度进行检测。

实施例1对尾气组成的调控

本实施例中，采用琥珀酸发酵菌株是e.colibsm209进行厌氧发酵。首先，将菌种接种于种子培养基中，种子培养基中包括：lb培养基，包括蛋白胨10g/l,酵母粉5g/l,andnacl5g/l。再将种子培养基接种于发酵培养基中，采用的发酵培养基中按照每升计，包括：3.0g柠檬酸,3.0gna2hpo4·7h2o,8.0gkh2po4,8.0g(nh4)2hpo4,0.2gnh4cl,0.8g(nh4)2so4,1.0gmgso4·7h2o,10.0mgcacl2·2h2o,0.5mgznso4·7h2o,0.3mgcucl2·2h2o,2.5mgmnso4·h2o,1.8mgcocl2·6h2o,0.1mgh3bo3,1.8mgal2(so4)3·5h2o,0.5mgna2moo4·2h2o,16.1mg柠檬酸铁,20.0mgvb1,and2.0mg生物素,0.12g甜菜碱,100g/l葡萄糖。

本实施例中，采用的丁醇发酵尾气co2含量为70%，其余为h2；采用的工业环氧乙烷尾气中co2含量约为99%。通过对两种尾气的体积比进行调控，可以实现不同的co2和h2的浓度配比，主要可以将两者的体积比控制在使co2的含量为92%左右，而h2约为接近8%。

调控发酵温度是35-38℃，发酵时间控制在72h。在不同条件下得到的发酵收率如下表所示：

从上表中可以看出，本实用新型中意外地发现，将丁醇发酵尾气和工业环氧乙烷尾气的体积比进行调控时，使co2的含量为92%左右，而h2约为接近8%时，可以获得优异的生产产率，琥珀酸的浓度可以达到最高的66.02g/l，这说明了较高的co2分压和稍许h2的通入与搅拌改变了发酵系统内的微生物发酵过程，可以提高发酵效果。

实施例2对琥珀酸的提取

在实施例1中所获得的发酵液，进行以下方法对琥珀酸进行提取。

采用平均孔径50nm的陶瓷微滤膜对发酵液进行过滤处理；再采用截留分子量5000的超滤膜对微滤的透过液进行浓缩，使得琥珀酸透过超滤膜，而蛋白质留存于超滤膜的截留侧中；通过截留分子量200的纳滤膜对超滤膜的透过液进行浓缩，使无机盐透过纳滤膜，并且使琥珀酸留存于纳滤的浓缩液中；将纳滤的浓缩液冷却结晶之后，进行离心处理，烘干，得到提纯的琥珀酸（命名为琥珀酸i）。

对于超滤膜的浓缩液，在其中加入100mg/l的聚合氯化铝进行絮凝，使大分子蛋白絮凝沉降，絮凝清液中再加入4g/l的氯化镁，使小分子蛋白变性，提高其分子量，通过截留分子量600的纳滤膜对絮凝清液进行小分子蛋白和琥珀酸的分离，使琥珀酸透过纳滤膜，再通过反渗透膜将琥珀酸进行浓缩之后，进行离心处理，烘干，得到提纯的琥珀酸（命名为琥珀酸ii）。

实施例3

本实施例与实施例2的区别在于：未对絮凝的清液中加入二价盐离子对蛋白质进行变性。

采用平均孔径50nm的陶瓷微滤膜对发酵液进行过滤处理；再采用截留分子量5000的超滤膜对微滤的透过液进行浓缩，使得琥珀酸透过超滤膜，而蛋白质留存于超滤膜的截留侧中；通过截留分子量200的纳滤膜对超滤膜的透过液进行浓缩，使无机盐透过纳滤膜，并且使琥珀酸留存于纳滤的浓缩液中；将纳滤的浓缩液冷却结晶之后，进行离心处理，烘干，得到提纯的琥珀酸（命名为琥珀酸i）。

对于超滤膜的浓缩液，在其中加入100mg/l的聚合氯化铝进行絮凝，使大分子蛋白絮凝沉降，通过截留分子量600的纳滤膜对絮凝清液进行小分子蛋白和琥珀酸的分离，使琥珀酸透过纳滤膜，再通过反渗透膜将琥珀酸进行浓缩之后，进行离心处理，烘干，得到提纯的琥珀酸（命名为琥珀酸ii）。

以上实施例中提纯得到的琥珀酸以及纳滤膜的分离情况如下所示：

从上表中可以看到，通过以上的方法可以获得纯度较好的琥珀酸产品，这一部分主要是通过直接从发酵液提纯而得到的，纯度可以达到99.5%以上，而通过超滤膜的浓缩液中所获得的琥珀酸ii，由于是从与其它更多的杂质中分离得到的，因此，其纯度较琥珀酸i有所下降；另外，实施例2中由于对絮凝后的清液中进行了加入二价盐的蛋白质变性处理，可以使小分子蛋白的分子量增大，也就使得纳滤膜对琥珀酸和蛋白的分离性能更好，使透过纳滤膜的蛋白质减小，截留率提高，这就可以使得琥珀酸ii的纯度也得到了提高。