抑制SNARE复合体的抗VAMP2抗体及其用途的制作方法

本发明涉及抑制snare复合体的抗vamp2抗体及其用途。
背景技术：
：细胞中的膜融合由称为可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(snare)的蛋白质引起。snare蛋白是指在所有物种中都良好保留的特定组的蛋白质，而snare复合体是指这些蛋白的复合体。snare蛋白可以分为靶(t-)snare和囊泡(v-)snare，并且t-snare是指突触前膜中存在的snare蛋白，而v-snare是指突触小泡中存在的snare蛋白。t-snare由称为突触融合蛋白1a的整合膜蛋白和外周膜蛋白snap-25(25kda的可溶性nsf附着蛋白)组成，并且其功能单元被认为是其复合体(t-snare复合体)。v-snare是指称为小泡相关膜蛋白2(vamp2或小突触泡蛋白)的膜蛋白。这些snare蛋白具有约60到70个aa、称为“snare核心”的区域，并且这些区域聚集在一起以形成四螺旋束，称为snare复合体。尽管与snare复合体有关的研究正在积极进行，但是针对抑制snare复合体的抗体的研究仍然不足。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供一种抑制snare复合体的抗vamp2抗体或其抗原结合片段。本发明的另一目的是提供一种融合的抗vamp2抗体或其抗原结合片段，其中，tat肽另外结合至该抗vamp2抗体或其抗原结合片段。本发明的另一目的是提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的重组表达载体以及用该重组表达载体转化的细胞。本发明的另一目的是提供一种用于检测vamp2抗原的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。本发明的另一目的是提供一种用于预防或改善皮肤皱纹的化妆品组合物、保健功能食品组合物和用于预防或治疗皮肤皱纹的药物组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。技术方案为实现上述目的，本发明提供一种抗vamp2抗体或其抗原结合片段，其包含：含有轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的轻链可变区，轻链cdr1包含由seqidno:1表示的氨基酸序列，轻链cdr2包含由seqidno:2表示的氨基酸序列，轻链cdr3包含由seqidno:3表示的氨基酸序列；以及含有重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的重链可变区，重链cdr1包含由seqidno:4表示的氨基酸序列，重链cdr2包含由seqidno:5表示的氨基酸序列，重链cdr3包含由seqidno:6表示的氨基酸序列。此外，本发明提供一种融合的抗vamp2抗体或其抗原结合片段，其中，由seqidno:7表示的tat肽另外结合至抗vamp2抗体或其抗原结合片段。此外，本发明提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。此外，本发明提供一种包含所述核酸分子的重组表达载体。此外，本发明提供用重组表达载体转化的细胞。另外，本发明提供一种用于检测vamp2抗原的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。此外，本发明提供一种用于预防或改善皮肤皱纹的化妆品组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。此外，本发明提供一种用于预防或改善皮肤皱纹的保健功能食品组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。此外，本发明提供一种用于预防或治疗皮肤皱纹的药物组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。有益效果本发明涉及抑制snare复合体的抗vamp2抗体及其用途，并且更具体地，本发明涉及包含特定序列的重链和轻链cdr的抗vamp2抗体或其抗原结合片段。预期抗vamp2抗体通过抑制snare复合体的形成而用来改善或治疗皮肤皱纹。附图说明图1显示了筛选vamp2scfv抗体的生物淘选结果。图2显示了用于筛选vamp2scfv抗体的elisa分析结果。图3显示了通过克隆制备细胞可透过性vamp2scfv的结果。图4显示了在细胞可透过性vamp2scfv蛋白的纯化之后通过sds-page示出的大小和蛋白纯度的结果。图5显示了抑制细胞可透过性vamp2scfv蛋白的snare复合体形成的能力的native-page分析的结果。图6显示了抑制细胞可透过性vamp2scfv蛋白的mmp-1胶原酶活性的结果。图7显示了细胞可透过性vamp2scfv蛋白的细胞透过性的流式细胞术结果。具体实施方式本发明提供一种抗vamp2抗体或其抗原结合片段，其包含：含有轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的轻链可变区，轻链cdr1包含由seqidno:1表示的氨基酸序列，轻链cdr2包含由seqidno:2表示的氨基酸序列，轻链cdr3包含由seqidno:3表示的氨基酸序列；以及含有重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的重链可变区，重链cdr1包含由seqidno:4表示的氨基酸序列，重链cdr2包含由seqidno:5表示的氨基酸序列，重链cdr3包含由seqidno:6表示的氨基酸序列。此外，本发明提供了一种融合的抗vamp2抗体或其抗原结合片段，其中，由seqidno:7表示的tat肽另外结合至抗vamp2抗体或其抗原结合片段。另一方面，表1列出了由seqidno:1至seqidno:6表示的氨基酸组成的cdr。另外，本发明中使用的tat肽的氨基酸序列为“ygrkkrrqrrr”(seqidno:7)，且tat肽的核酸序列为“tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc”(seqidno:8)。在本发明中，术语“抗体”是指用作特异性地识别抗原的受体的蛋白质分子，包括免疫学上与特定的抗原反应的免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体和抗体片段。术语“抗体”还可以包括二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双链抗体、三链抗体或四链抗体。在本发明中，术语“单克隆抗体”是指从基本上相同的抗体的群体中获得的具有单一分子组成的抗体分子，该抗体分子对特定表位表现出单一结合和亲和力，不同于可结合多个表位的多克隆抗体。在本发明中，术语“全长抗体”具有两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键连接至重链。重链的恒定区具有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)类型，并且其子类具有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)和gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)和alpha2(α2)。轻链的恒定区具有kappa(κ)和lambda(λ)类型。igg是亚型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。在本发明中，术语“重链”是指全长重链及其片段，其包括可变区vh以及三个恒定区ch1、ch2和ch3，所述可变区vh包括具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。此外，在本发明中，术语“轻链”可包括全长轻链及其片段，其包括可变区vl和恒定区cl，所述可变区vl包括具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”及“抗原结合片段”可互换使用，是指具有抗体的抗原结合功能的本发明的抗体的任何片段。示例性的抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab')2和fv，但它们不限于此。本发明的抗体或其抗原结合片段不仅可以包括本文所述的抗体序列，而且还可以包括其生物等同物，只要达到它们能够表现出特异性地结合vamp2的能力的程度。例如，可以对抗体的氨基酸序列进行额外的改变，以进一步提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性，此类修改包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。这些氨基酸变化是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(例如疏水性、亲水性、电荷、大小等)而做出。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型可以看出，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有类似的形状。因此，在此基础上，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有生物学等效功能。此外，本发明提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。如本文所使用的，术语“核酸分子”具有全面包括dna(gdna和cdna)和rna分子的含义，并且作为核酸分子中的基本结构单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括具有经修饰的糖或碱基位点的类似物。可以对编码本发明的重链和轻链可变区的核酸分子的序列进行修饰，并且所述修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。此外，本发明提供了一种包含所述核酸分子的重组表达载体。在本发明中，“载体”是指用于携带克隆基因(或克隆dna的其它片段)的自我复制dna分子。在本发明中，“表达载体”是指包含期望的编码序列和在特定的宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当的核酸序列的重组dna分子。表达载体可优选包括一个或多个可选择标记。该标记为具有可通过化学方法选择的特性的核酸序列，并且包括能够区分转化细胞和非转化细胞的所有基因。实例包括抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素(geneticin，g418)、博来霉素、潮霉素、氯霉素等，但它们不限于此，本领域技术人员可适当选择。为了表达本发明的dna序列，可以在载体中使用多种表达控制序列中的任何一种。有用的表达控制序列的实例可以包括例如：腺病毒或sv40的早期和晚期启动子、cmv的启动子和增强子、逆转录病毒ltr、lac系统、trp系统、tac或trc系统、t3和t7启动子、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd编码蛋白的调节区、3-磷酸甘油酸激酶或其它乙二醇酯酶的启动子、磷酸酶(例如pho5)的启动子、酵母α-杂交系统的启动子、以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中的基因的表达的构建体或诱导型的各种其它序列及各种组合。表达本发明的抗体的载体可以是在一个载体中同时表达轻链和重链的载体系统，或者是在分开的载体中分别表达轻链和重链的系统。在后一种情况中，将两种载体通过共转化和靶向转化引入宿主细胞中。共转化是在将编码轻链和重链的各载体dna同时引入宿主细胞中之后，筛选表达轻链和重链两者的细胞的方法。靶向转化是如下的方法：选择用包含轻链(或重链)的载体转化的细胞，然后再次用包含重链(或轻链)的载体转化所选择的表达轻链的细胞，以表达轻链和重链两者，从而最终选择细胞。此外，本发明提供用重组表达载体转化的细胞。能够稳定地连续克隆和表达本发明的载体的细胞可以是本领域已知的任何宿主细胞，可以包括原核宿主细胞，例如大肠杆菌(escherichiacoli)、芽孢杆菌菌株(例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis))、链霉菌、假单胞菌(例如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)或葡萄球菌(例如肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus))，但是它们不限于此。在制备抗体或其抗原结合片段的方法中，可根据本领域已知的适宜的培养基和培养条件来进行经转化的细胞的培养。可由本领域技术人员根据所选择的菌株容易地进行调整来实施这一培养过程。将细胞培养按细胞生长方式分为悬浮培养和贴壁培养，并根据培养方法将其分为分批培养方法、补料分批培养方法和连续培养方法。用于培养的培养基必须充分地满足特定菌株的要求。此外，本发明提供一种用于检测vamp2抗原的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。此外，本发明提供一种用于预防或改善皮肤皱纹的化妆品组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。具体而言，该组合物可抑制snare复合体的形成。除了活性成分外，化妆品组合物还可包含稳定剂、增溶剂、常规辅佐剂(诸如维生素、色素和香精)以及载体。化妆品组合物的制剂可以以本领域常规制备的任何制剂来制备，并且可以是选自于由以下所组成的组中的制剂：外用皮肤软膏、乳霜、柔肤水、营养乳、面膜、精华、养发素、洗发水、护发素、柔发素、焗油膏、啫喱、润肤液、润肤水、爽肤水、紧肤水、乳液、牛奶乳液、保湿乳、滋养乳、按摩霜、营养霜、眼霜、保湿霜、护手霜、粉底液、滋养精华、防晒霜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤露和沐浴露，但它不限于此。这些制剂中的每一种的组成可包含制备制剂所必需和适当的各种碱和添加剂，并且本领域技术人员可以容易地选择这些组分的类型和量。当制剂是膏剂、乳霜或啫喱时，它可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等作为载体组分。当制剂是粉剂或喷雾剂时，它可以使用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体组分，并且特别地喷雾剂可以另外包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。当制剂是溶液或乳化液时，将溶剂、增溶剂或乳化剂用作载体组分，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐脂肪酸酯。当制剂是悬液时，它可以使用液体稀释剂，例如水、乙醇或丙二醇、悬浮剂(例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶作为载体组分。此外，本发明提供了一种用于预防或改善皮肤皱纹的保健功能食品组合物，所述组合物包含抗体或其抗原结合片段作为活性成分。具体而言，该组合物可以抑制snare复合体的形成。所述保健功能食品组合物可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料或丸剂的形式提供，并且所述保健功能食品组合物与除作为有效成分的本发明所述的组合物以外的其它食品或食品添加剂组合使用，并且其可以按照常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(例如预防、保健或治疗处理)来适当确定。所述保健功能食品组合物中所含的抗体或其抗原结合片段的有效剂量可根据所述药物组合物的有效剂量使用，但它可为上述范围，并且在出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入的情况下低于上述范围，而且明显的是活性成分可以以具有至少在上述范围的量使用，因为在安全性方面没有问题。对保健功能食品的种类没有特别的限制，其实例包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、甜食、披萨、拉面、其它面条、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物等。此外，本发明提供一种用于预防或治疗皮肤皱纹的药物组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。具体而言，该组合物可抑制snare复合体的形成。本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且该药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐/酯、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸、镁和矿物油等，但不限于此。除上述组分外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可以口服给予或肠胃外给予，并且对于肠胃外给予，可以通过如下进行给予：静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予、直肠给予等。当口服给予时，蛋白质或肽被消化，因此可配制用于口服给予的组合物以包覆活性剂或保护其免受胃中的降解，并且本发明的组合物可通过能够将活性物质转运至靶细胞的任何装置给予。本发明的药物组合物的合适剂量根据以下因素而变化，所述因素例如配制方法、给予方式、患者的年龄、体重、性别、病况、食物、给予时间、给予途径、排泄速率和应答敏感性，并且通常有经验的医生可以容易地确定并开出对期望的治疗或预防有效的剂量。根据本发明所属领域的技术人员可以容易地实施的方法，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂进行配制或通过将其掺入多剂量容器中，将本发明的药物组合物制备成单位剂型。此时，制剂可处于溶液、悬液或者在油或水性介质中的乳化液的形式，或者可处于提取物、粉末、栓剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且可进一步包含分散剂或稳定剂。本发明的组合物可作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合给予，并且可以与常规治疗剂顺序或同时给予。实施例下文中，将详细描述本发明的实施例以理解本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式具体化，并且不应当限于在此阐述的实施方式，以向本发明所属领域的技术人员清楚地说明本发明。实施例1vamp2scfv抗体的筛选1.生物淘选使用具有7.6×109的多样性的opal库进行生物淘选。将4μg的vamp2抗原固定在环氧磁珠上，并使输入的噬菌体反应。通过与抗原反应的噬菌体的洗脱来测量输出效价。每次都要测量输入和输出效价，以获取生物淘选信息并确认其正常运行。对于每次，使用≥4×1012cfu/ml的噬菌体的输入噬菌体。在图1中示出了直至第1轮、第2轮和第3轮的顺序的淘选的结果。分别获得1×108cfu/ml和2.7×108cfu/ml的vamp2的输出(图1)。因此，证实了生物淘选正常进行。2.elisa分析进行elisa分析以筛选具有高灵敏度和高特异性的抗体。将获得的噬菌体用大肠杆菌感染，并在添加抗生素的lb平板上划线。在30℃下于培养箱中孵育16小时后，随机收集所得菌落。将各菌落在lb培养基中培养之后，用iptg处理以表达scfv，并将大肠杆菌裂解以进行可溶性级分的elisa。首先，将1μg/ml的vamp2重组蛋白各自固定在96孔elisa板中，并用包含1％bsa的pbs封闭。1小时后，对以上获得的细胞裂解物处理，并在4℃下反应16小时。用含有0.1％吐温20的pbs洗涤板3次后，将hrp缀合的抗ha抗体在封闭溶液中以1∶1000稀释，并在室温下反应1小时。将板用含有0.1％吐温20的pbs洗涤5次，然后用tmb底物染色以通过elisaleader测量与抗原结合的scfv抗体。图2显示了使用vamp2的elisa的结果。对192种抗体进行分析，通过随意地将od0.5确定为阳性指标而将od0.1确定为阴性指标而获得了一个阳性克隆。此外，使用其它192个菌落重复进行，并选择了总共9个克隆(图2)。实施例2vamp2scfv抗体序列分析对通过elisa分析筛选出的vamp2的9个阳性克隆进行测序，由此筛选出单个克隆。测序是必要的，因为在先前筛选的阳性克隆中可能存在重复的克隆。作为序列分析的结果，证实了所有9个vamp2都是同一克隆(表1)。[表1]cdr1cdr2cdr3cdr1cdr2cdr3vamp1ltgsssnigsnnvtsdshgswdyslsahnysmsaiysogssikyrsskhtplpsysnamdv实施例3细胞透过性抗vamp2scfv的制备1.tat-vamp2scfv构建体的制备通过使用先前选择的scfv中的一种作为引物，生产插入了限制性酶切位点和tat的pcr产物。将30μl的各pcr产物用4μl缓冲液3.1、1μl的sal1、1μl的xho1和4μl蒸馏水进行处理，在37℃下反应1小时，然后分离dna以得到待插入载体中的插入物。将pet28a(+)载体转化到dh5α感受态细胞中，然后在添加有卡那霉素的lb平板上划线，在37℃下孵育16小时，并在第二天，将菌落接种到添加有卡那霉素的lb培养基中，并在37℃下培养16小时。第二天，使用mini-prep试剂盒分离载体，并将30μl的载体用4μl缓冲液3.1、1μl的sal1、1μl的xho1、1μl的cip和3μl蒸馏水进行处理，以在37℃下反应1小时，然后纯化。通过nanodrop测量经纯化的载体和插入物的浓度，并根据载体和插入物的比例使用t4连接酶在室温下进行连接16小时。连接完成后，将其转化至dh5α中，在添加有卡那霉素的lb平板上划线，在37℃下孵育16小时，并在第二天，将菌落接种在添加有卡那霉素的lb培养基中，并在37℃下孵育16小时。第二天，为了确认插入物的插入，将质粒分离并用sal1和xho1切割，并通过在1％琼脂糖凝胶上的电泳确认条带(图3)。2.tat-vamp2scfv抗体纯化将经克隆的tat-vamp2scfv抗体克隆转化到bl21(de3)大肠杆菌宿主中，并用1mm的iptg诱导转化子。将scfv抗体悬浮在裂解缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl)中，使用超声发生器粉碎并离心以获得上清液。使用对ni-nta具有亲和力的树脂进行蛋白质的纯化。通过sds-page分析确认经纯化的蛋白质具有约30kda的蛋白质大小(图4)。实施例4细胞透过性抗vamp2scfv的细胞毒性试验为了检测tat-vamp2scfv抗体的细胞毒性，将作为哺乳动物神经元的pc12细胞在37℃下于co2培养箱中培养。培养后，将各tat-vamp2scfv抗体按浓度(0.1ppm、1ppm、10ppm、50ppm、100ppm、200ppm、400ppm)进行处理，并在相同的培养条件下进一步培养。培养后，加入mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)溶液并孵育，然后移去培养液，加入dmso(二甲基亚砜)以适当摇动，并在570nm处用elisa酶标仪系统测定吸光度，并且将值在表2中示出。如表2所示，当将tat-vamp2scfv在0.1、1、10、50、100、200、400ppm浓度下处理时，证实了对于400ppm浓度而言，哺乳动物神经元的细胞形状和细胞活力几乎没有变化。因此，发现tat-vamp2scfv是浓度高达400ppm时没有细胞毒性的物质。[表2]浓度(ppm)tat-vamp2scfv0100％0.192.9±6.5％1106.6±9.0％10120.2±2.0％50133.4±5.9％100116.8±3.1％200137.5±6.3％400143.0±5.3％实施例5细胞透过性抗vamp2scfvsnare复合体形成抑制能力试验为了确认tat-vamp2scfv抗体是否抑制了snare复合体的形成，进行了native-page分析。当将snare蛋白snap25、突触融合蛋白1a和vamp2蛋白(lsbioco.)以1∶1∶1(1μg)的浓度进行混合时，确认了通过加入tat-vamp2scfv抗体抑制了复合体的形成。添加1μl的各蛋白质，并按浓度(0.5、1、2、5、10、20μg)处理各tat-vamp2scfv抗体，使用涡旋快速混合，并在4℃下反应1小时。当反应完成时，加入样品缓冲溶液以终止反应，并确认在10％native-page上是否形成了snare复合体(图5)。如图5所示，tat-vamp2scfv以浓度依赖的方式(5、10、20μg)有效地抑制了snare复合体，并且tat-vamp2scfv以5μg的浓度抑制50％的snare复合体的形成。实施例6细胞透过性抗vamp2scfv的mmp-1表达抑制的评价为了探索tat-vamp2scfv对胶原蛋白产生的影响，使用实时pcr方法测试了tat-vamp2scfv对mmp-1活性的抑制作用。哺乳动物神经元pc12细胞在37℃下于co2培养箱中培养。孵育后，用uv照射系统照射uva。之后，将10ppm的tat-vamp2scfv抗体和作为阳性对照的100ppm的腺苷用于处理，并在相同的培养条件下进一步培养。孵育后，用trizol300μl收集细胞，转移到1.5ml管中，加入50μl氯仿并涡旋并在室温下放置5分钟。随后，通过在4℃和15,000rpm下离心15分钟，将上清液转移到新管，与等量的2-丙醇混合，并使其在室温下静置5分钟，然后在4℃和12,000rpm下离心20分钟。离心后，弃去2-丙醇，加入300μl的75％乙醇，然后在4℃和10,000rpm下离心10分钟，弃去75％乙醇，并将rna团块在室温下干燥以除去剩余的乙醇。将30μl经depc处理的纯净水添加至所述团块，以溶解并在260nm处定量。将1μg的总rna用于rt-pcr，并将topscriptrt干混合物用于rt-pcr。合成实时pcr中使用的mmp-1和gapdh并用于macrogen中，并将核酸序列示于下表3中。使用toprealtmqpcr2xpremix进行实时pcr。如图6所示，tat-vamp2scfv抑制mmp-1胶原酶，该酶引起由紫外线造成的皱纹形成。证实当用10ppm处理时，皱纹改善效果优于对照。[表3]实施例7细胞透过性抗vamp2scfv的细胞透过性测定为了证实tat-vamp2scfv的细胞透过活性，使用作为哺乳动物神经元的pc12细胞确认了细胞透过活性。使用含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基在6孔板中将pc-12细胞培养24小时(1×106细胞/孔)。将经培养的细胞用pbs洗涤两次，并将样品在无fbs的无血清培养基中处理3小时(处理浓度50μg)。反应时间之后，通过用pbs洗涤两次来除去残留的样品，并使用0.05％胰蛋白酶-edta将细胞收集在准备好的管中。回收的细胞用pbs洗涤3次，在1500rpm下离心3分钟，然后加入3ml的70％冷etoh并反应1小时。在用pbs洗涤3次之后，使用3％bsa进行封闭，并且使用his-probefitc-conjugated在黑暗状态下于室温下进行染色30分钟。反应后，除去染色溶液，并用pbs洗涤3次。除去上清液后，向各facs管中加入300μlpbs，然后将细胞充分重悬，以使用facscalibur和fl-1(488nm)确定tat-vamp2scfv向细胞中的透过程度。如图7所示，发现tat-vamp2scfv本身具有优异的细胞内透过活性。尽管已经参考本发明的具体的实施方式对本发明进行了具体描述，但是对于本领域技术人员而言很明显的是，该具体的描述仅仅是优选的实施方式，并且本发明的范围不限于此。即，本发明的实际范围由所附的权利要求书及其等同物限定。<110>哈坞生物科技株式会社（hauulbio）<120>抑制snare复合体的抗vamp2抗体及其用途<130>op-2019-0047pct<150>kr10-2018-0098309<151>2018-08-23<150>kr10-2019-0066179<151>2019-06-04<160>8<170>kopatentin2.0<210>1<211>13<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr1<400>1thrglyserserserasnileglyserasnasnvalthr1510<210>2<211>4<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr2<400>2seraspserhis1<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr3<400>3glysertrpasptyrserleuserala15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr1<400>4asntyrsermetser15<210>5<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr2<400>5alailetyrseraspglyserserile15<210>6<211>19<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr3<400>6lystyrargserserlyshisthrproleuprosertyrserasnala151015metaspval<210>7<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>tat肽<400>7tyrglyarglyslysargargglnargargarg1510<210>8<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>tat肽<400>8tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc33当前第1页12