药物组合的制作方法

序列表本申请包含已经以ascii格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此结合。所述ascii副本命名为pat058095_sl.txt并且大小为190,381字节。本发明涉及如下药物组合，该药物组合包含(a)结合程序性死亡1(pd-1，本文也称为“pd-1抑制剂”)的至少一种抗体分子(例如，人源化抗体分子)，和(b)hdm2-p53相互作用抑制剂(本文也称为“hmd2抑制剂”)，所述组合用于同时、分开或顺序给予，用于在增殖性疾病的治疗中使用，涉及包含这种组合的药物组合物；涉及治疗患有增殖性疾病的受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者给予所述组合；涉及这种组合用于治疗增殖性疾病的用途；以及涉及包含这种组合的商业包装物；所述增殖性疾病是肿瘤，特别是tp53野生型肿瘤，特别是tp53野生型实体瘤，特别是tp53野生型肾细胞癌(rcc)或结肠直肠癌(crc)。
背景技术：
：p53被许多潜在的致瘤过程(包括异常生长信号、dna损伤、紫外线、和蛋白激酶抑制剂(millardm等人currpharmdesign[当前药物设计]2011；17:536-559))诱导和激活，并调节控制细胞生长停滞、dna修复、细胞凋亡和血管生成的基因(bullockan和fershtar.natrevcancer[癌症自然评论]2001；1:68-76；vogelsteinb等人natureeducation[自然教育]2010；3(9):6)。人双微体-2(humandoubleminute-2，hdm2)是p53最重要的调节因子之一。它直接结合p53，抑制其反式激活，并随后引导其发生细胞质降解(zhangy等人nucleicacidsres[核酸研究]2010；38:6544-6554)。p53是人癌症中最常被灭活的蛋白质之一，所述灭活通过tp53基因的直接突变(在大约50％的人癌症中发现)(vogelstein,b等人nature[自然]2000；408:307-310)或通过抑制机制，如过表达hdm2(zhaoy等人biodiscovery[生物发现]2013；8:4)来进行。hdm2-p53相互作用的强效且具选择性的抑制剂(也称为hdm2抑制剂或mdm2抑制剂，例如nvp-hdm201)已在临床前细胞和体内模型中显示恢复p53功能(holzerp等人在aacr2016,文摘号4855上展示的海报)。t细胞介导针对抗原的免疫响应的能力需要两种不同的信号传导相互作用(viglietta,v.等人(2007)neurotherapeutics[神经病疗法]4:666-675；korman,a.j.等人(2007)adv.immunol.[免疫学进展]90:297-339)。首先，将已经排列在抗原呈递细胞(apc)的表面上的抗原呈递至抗原特异性原初cd4+t细胞。这种呈递通过t细胞受体(tcr)递送信号，该信号指导t细胞启动对所呈递的抗原具有特异性的免疫响应。然后，通过apc与不同的t细胞表面分子之间的相互作用所介导的多种共刺激性以及共抑制性信号触发t细胞的活化和增殖并且最终触发它们的抑制。程序性死亡1(pd-1)蛋白是t细胞调节因子的扩展的cd28/ctla-4家族的抑制性成员(okazaki等人(2002)curropinimmunol[当代免疫学观点]14:391779-82；bennett等人(2003)j.immunol.[免疫学杂志]170:711-8)。cd28家族的其他成员包括cd28、ctla-4、icos和btla。它是许多肿瘤用来逃避免疫系统攻击的免疫检查点通路中的靶标位点之一。建议pd-1作为单体存在，所述单体缺乏其他cd28家族成员特有的未配对半胱氨酸残基。pd-1在活化的b细胞、t细胞和单核细胞上表达。鉴于免疫检查点通路在调节对肿瘤的免疫响应方面的重要性，需要开发调节免疫抑制蛋白(如pd-1)活性从而导致免疫系统的活化的新颖组合疗法。此类药剂可用于例如癌症免疫疗法和其他病症的治疗。结肠直肠癌(crc)是世界上第三大常见癌症，2012年诊断出约140万人，并且是癌症死亡的第四大常见原因，死亡人数为694,000(worldcancerreport2014[2014年世界癌症报告])。crc患者的结果与肿瘤中的免疫浸润有关，表明crc可能受益于刺激免疫响应的疗法(fridmanwh,galonj,pagèsf等人(2011)prognosticandpredictiveimpactofintra-andperitumoralimmuneinfiltrates.[肿瘤内和肿瘤周围免疫浸润的预后和预测影响]cancerres.[癌症研究]第5601-5页)。然而，ctla-4或pd-1检查点抑制剂的初步经验在错配修复缺陷人群之外令人失望(ledt,uramjn,wangh等人(2015)pd-1blockadeintumorswithmismatch-repairdeficiency.[肿瘤的阻滞与错配修复缺陷]n.engl.j.med.[新英格兰医学杂志]第2509-20页；和其他参考文献：ribas等人2005；chung等人2010；brahmer等人2010；topalian等人2012；brahmer等人2012)。缺乏功效的一种或多种原因尚不清楚(kroemerg,galluzzil,laurencezitvogell等人(2015)colorectalcancer:thefirstneoplasiafoundtobeunderimmunosurveillanceandthelastonetorespondtoimmunotherapy？[结直肠癌：第一个发现的处于免疫监视下的肿瘤，也是最后一个对免疫治疗有反应的肿瘤？]oncoimmunology[肿瘤免疫学]4:7,e1058597-1-3)。肾细胞癌(rcc)是全球肿瘤相关死亡的第16大原因，2012年全球死亡人数为143,000(ferlay等人2015)。在美国，预计2016年将有>62,000例新病例和>14,000例肾癌死亡病例(siegel等人2016)。纳武单抗(nivolumab)被批准用于rcc(药物标签(2014))。与依维莫司相比，纳武单抗在一线治疗后的rcc患者中显示出25个月的中位os，其中接受纳武单抗治疗的患者获益为5.4个月(mazzac,escudierb,albigesl.(2017)nivolumabinrenalcellcarcinoma:latestevidenceandclinicalpotential.[肾细胞癌中的纳武单抗：最新证据和临床潜力]theradvmedoncol.[医学肿瘤学的治疗进展]第171-181页)。迄今为止，至少有31项研究调查了rcc中tp53的表达。在2519例rcc肿瘤的荟萃分析(meta-analysis)中，tp53阳性频率为24.5％(noonap,vlatkovicn,polanskir等人(2010)p53andmdm2inrenalcellcarcinoma:biomarkersfordiseaseprogressionandfuturetherapeutictargets？[肾细胞癌中p53和mdm2：疾病进展的生物标志物和未来的治疗靶标？]cancer.[癌症]第116:780-90页)。目前处于开发中的免疫疗法已开始为黑素瘤癌患者提供显著益处，包括常规治疗对其无效的患者。最近，已经批准用于nsclc和黑素瘤的两种pd-1/pd-l1相互作用的抑制剂，派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗，商品名分别为和尽管pd-1/pd-l1相互作用的抑制剂是良好耐受的并且已经在显著范围的癌症类型中证明了一定活性，但是仍然需要用其他治疗剂补充治疗以增加治疗的响应率和持久性。针对hdm2抑制剂描述了不同的给药方案，并在临床研究中进行了测试。例如us2013/0245089披露了治疗罹患癌症的患者的方法，该方法通过以从约800至约3000mg/天的量向患者给予4-{[(2r,3s,4r,5s)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸持续长达约7天(在28天治疗周期的第1-7天)的给药期，接着是从约21至约23天的休息期进行。在b.higgins等人于clinicalcancerresearch[临床癌症研究]中的论文(2014年5月)中披露了28天周期的日程表，其中将rg7388每周一次共给予三次，接着是13天的休息(28天周期的日程表)，或者将药物在28天的日程表中连续5天给予。在wo2015/198266中披露了hdm2抑制剂的其他给药方案。在特定治疗环境中寻找关于特定hdm2抑制剂的安全但有效的剂量和剂量方案(单药治疗或组合疗法、适应症类型)仍然是这些抑制剂临床应用的一大挑战。技术实现要素：本发明提供了化合物a或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体，作为与pd-1抑制剂组合的组分，用于在癌症(其是tp53野生型癌症，特别是tp53野生型实体瘤)的治疗中使用。化合物a是具有以下项目代码、化学名称和结构的化合物：hdm201(inn：siremadlin)，即(s)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1h-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，也称为(6s)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1h)-酮，优选地，hdm201处于琥珀酸共晶形式。更优选地，hdm201处于1:1(摩尔比)的琥珀酸共晶形式。本发明提供了药物组合，该药物组合包含(a)结合程序性死亡1(pd-1)的至少一种抗体分子(例如，人源化抗体分子)，尤其是如下所述的示例性抗体分子，和(b)hdm2-p53抑制剂(其是化合物a)或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体。药物组合可以用于同时、分开或顺序给药以治疗增殖性疾病，特别是tp53野生型癌症，更特别是tp53野生型实体瘤。本发明还涉及一种药物组合，该药物组合包含：(a)hdm2-p53抑制剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体，该hdm2-p53抑制剂是化合物a(hdm201，siremadlin)；以及(b)能够结合人程序性死亡-1(pd-1)的分离的抗体分子，该分离的抗体分子包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区(vh)包含如表1中所述的bap049-克隆-b或bap049-克隆-e的hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列，并且该轻链可变区(vl)包含如下表1中所述的bap049-克隆-b或bap049-克隆-e的lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列，优选地该抗pd-1抗体分子是pdr001(spartalizumab)。还提供了包含这种组合的药物组合物；治疗患有增殖性疾病的受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者给予所述组合；这种组合用于治疗增殖性疾病的用途；以及包含这种组合的商业包装物。pd-1抑制剂是抗pd-1抗体分子，如题为“pd-1的抗体分子及其用途”的ussn14/604,415和wo/2015/112900中所述，两者均通过引用以其全文并入。在一个实施例中，该抗pd-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个抗原结合区(例如可变区或其抗原结合片段)，包括来自重链的三个互补决定区(cdr)和来自轻链的三个cdr，例如选自以下中任何一项的抗体：bap049-hum01、bap049-hum02、bap049-hum03、bap049-hum04、bap049-hum05、bap049-hum06、bap049-hum07、bap049-hum08、bap049-hum09、bap049-hum10、bap049-hum11、bap049-hum12、bap049-hum13、bap049-hum14、bap049-hum15、bap049-hum16、bap049-克隆-a、bap049-克隆-b、bap049-克隆-c、bap049-克隆-d、或bap049-克隆-e；或如表1所述，或是由表1中核苷酸序列所编码的；或者与前述序列中任何一项基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。例如，该抗pd-1抗体分子可包括根据卡巴特(kabat)等人所述的vhcdr1、或根据乔西亚(chothia)等人所述的vh高变环1、或其组合，例如如表1中所示。在一个实施例中，vhcdr1的卡巴特和乔西亚cdr的组合包含氨基酸序列gytfttywmh(seqidno:224)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，取代、缺失或插入，例如保守取代))。该抗pd-1抗体分子可进一步包括例如根据卡巴特等人所述的vhcdr2-3和根据卡巴特等人所述的vlcdr1-3，例如如表1中所示。因此，在一些实施例中，框架区基于根据卡巴特等人定义的cdr和根据乔西亚等人定义的高变环的组合来定义。例如，该抗pd-1抗体分子可包括基于根据乔西亚等人的vh高变环1定义的vhfr1和基于根据卡巴特等人的vhcdr1-2定义的vhfr2，例如如表1中所示。该抗pd-1抗体分子可进一步包括例如根据卡巴特等人基于vhcdr2-3定义的vhfr3-4和根据卡巴特等人基于vlcdr1-3定义的vlfr1-4。在本发明的组合中结合程序性死亡1(pd-1)的优选抗体分子(例如人源化抗体分子)是作为bap049-克隆-e的示例性抗体分子，并且优选的氨基酸序列描述于本文的表1中(vh：seqidno:38；vl：seqidno:70)。优选的抗体分子在本文中也称为抗体b或spartalizumab(inn)或pdr001。本发明进一步提供了用于同时、分开或顺序给予的药物组合，该药物组合包含hdm2-p53抑制剂(其是化合物a)或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体，和如本文所述的抗pd-1抗体分子，所述药物组合用于在增殖性疾病的治疗中使用。本发明特别地涉及本发明的组合，用于在增殖性疾病的治疗中使用。本发明还提供了本发明组合用于治疗增殖性疾病(特别是癌症)的用途。特别地，本发明的组合可用于治疗癌症，该癌症是tp53野生型癌症，特别是tp53实体瘤，并且特别地，所述tp53实体瘤选自肾细胞癌(rcc)和结肠直肠癌(crc)。本发明还提供了本发明的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，这些增殖性疾病特别是癌症、特别是tp53野生型癌症、特别是tp53实体瘤，特别地所述tp53实体瘤选自肾细胞癌(rcc)和结肠直肠癌(crc)。本发明还提供了治疗增殖性疾病的方法，该方法包括同时、分开或顺序向有需要的受试者给予本发明的组合，给予的量对于所述增殖性疾病具有联合治疗有效性。本发明还提供了药物组合物或组合制剂，其包含一定量的本发明组合(该量对增殖性疾病具有联合治疗有效性)，和任选地至少一种药学上可接受的载体。本发明还提供了组合制剂，其包含(a)一个或多个剂量单位的hdm2抑制剂(其是化合物a)或其药学上可接受的盐，和(b)抗pd-1抗体分子，所述组合制剂用于在增殖性疾病的治疗中使用。本发明还提供了商业包装物，该商业包装物包含作为活性成分的本发明的组合和用于向有需要的患者同时、分开或顺序给予本发明的组合的说明书，用于治疗增殖性疾病，特别是为tp53野生型的实体瘤。本发明还提供了商业包装物，该商业包装物包含hdm2抑制剂(其是化合物a)或其药学上可接受的盐、复合物或共晶体，和抗pd-1抗体分子，以及用于在增殖性疾病的治疗中同时、分开或顺序使用的说明书。在另一方面，本发明特征在于诊断或治疗套件(kit)，其包括本文所述的抗体分子和/或低分子量活性组分和使用说明书。本发明还提供了用于给予pd-1抑制剂和hdm2抑制剂的剂量范围和给药方案。特别地，本发明提供了如本文所述的pd-1抑制剂和hdm2抑制剂hdm201的组合，用于治疗癌症，其中将pd-1抑制剂每4周给药一次(q4w)，并且将hdm201在4周治疗周期的第1天、以及在第6至14天中的任一天，优选地在第6至10天中的任一天，更优选地在第8天给予(d1d8q4w)。pd-1抑制剂的每日剂量是从100至400mg、优选地从200至400mg、更优选地从300至400mg、甚至更优选地每日剂量是400mg，并且hdm201的每日剂量是从30至120mg、优选地每日剂量是从40至120mg、更优选地每日剂量是从60至120mg、甚至更优选地每日剂量是从60mg至90mg、甚至更优选地每日剂量是从60至80mg。本文中，hdm201的每日剂量是指游离形式，即不包括任何盐、溶剂化物、复合物或共晶形成物的质量，例如在hdm201琥珀酸共晶体的情况下不包括琥珀酸的质量。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是显而易见的。附图说明图1描绘了鼠抗pd-1mabbap049的轻链和重链可变区的氨基酸序列。上面和下面的序列来自两个独立的分析。基于卡巴特编号的轻链和重链cdr序列加了下划线。基于乔西亚编号的轻重链cdr序列以粗体斜体显示。轻链序列的位置102处的未配对的cys残基加了框。序列按出现的顺序分别公开为seqidno:8、228、16和229。图2a描绘了与种系序列比对的鼠抗pd-1mabbap049的轻链和重链可变区的氨基酸序列。上面和下面的序列分别是种系(gl)和bap049(mumab)序列。基于卡巴特编号的轻链和重链cdr序列加了下划线。基于乔西亚编号的轻重链cdr序列以粗体斜体显示。“-”意指相同的氨基酸残基。序列按出现的顺序分别公开为seqidno:230、8、231和16。图2b描绘了鼠κj2基因的序列和鼠抗pd-1mabbap049中的相应突变。“-”意指相同的核苷酸残基。序列按出现的顺序分别公开为seqidno:233、232、234和235。图3a-3b描绘了荧光标记的鼠抗pd-1mabbap049(mumab)和三种嵌合版本的bap049(chimab)之间的竞争结合。实验进行两次，并且结果分别显示在图3a和3b中。三种嵌合bap049抗体(chimab(cys)、chimab(tyr)和chimab(ser))在轻链可变区的位置102处分别具有cys、tyr和ser残基。chimab(cys)、chimab(tyr)和chimab(ser)也分别称为bap049-chi、bap049-chi-y和bap049-chi-s。图4是显示十六个人源化bap049克隆(bap049-hum01至bap049-hum16)的facs结合分析结果的条形图。对于每种测试的mab，从最左边的条到最右边的条的抗体浓度依次为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml和12.5ng/ml。图5描绘了人源化bap049克隆的结构分析(a、b、c、d和e代表各种类型的框架区序列)。还显示了这些样品中mab的浓度。图6a-6b描绘了在竞争结合测定中使用恒定浓度的alexa488标记的鼠mabbap049、测试抗体的连续稀释物和表达pd-1的300.19细胞测量的人源化bap049mab的结合亲和力和特异性。实验进行两次，并且结果分别显示在图6a和6b中。图7描绘了基于facs数据、竞争结合和结构分析的人源化bap049克隆的排序。还显示了这些样品中mab的浓度。图8a-8b描绘了通过选择的人源化bap049克隆阻断配体与pd-1的结合。pd-l1-ig和pd-l2-ig与pd-1结合的阻断如图8a所示。pd-l2-ig与pd-1结合的阻断如图8b所示。评估bap049-hum01、bap049-hum05、bap049-hum08、bap049-hum09、bap049-hum10、和bap049-hum11。分析中还包括在轻链可变区位置102处具有tyr的鼠mabbap049和嵌合mab。图9a-9b描绘了十六种人源化bap049克隆和bap049嵌合体(bap049-chi)的重链可变结构域序列的比对。在图9a中，显示了所有序列(按出现顺序分别为seqidno:22、38、38、38、38、38、38、38、38、38、50、50、50、50、82、82和86)。在图9b中，仅显示与小鼠序列不同的氨基酸序列(按出现顺序分别为seqidno:22、38、38、38、38、38、38、38、38、38、50、50、50、50、82、82和86)。图10a-10b描绘了十六种人源化bap049克隆和bap049嵌合体(bap049-chi)的轻链可变结构域序列的比对。在图10a中，显示了所有序列(按出现顺序分别为seqidno:24、66、66、66、66、70、70、70、58、62、78、74、46、46、42、54和54)。在图10b中，仅显示与小鼠序列不同的氨基酸序列(按出现顺序分别为seqidno:24、66、66、66、66、70、70、70、58、62、78、74、46、46、42、54和54)。图11是概述本文公开的组合疗法所靶向的抗原加工和呈递、效应细胞响应和免疫抑制通路的示意图。图12描绘了在接受相同剂量的示例性抗pd-1抗体分子时针对不同体重患者的预测c谷(cmin)浓度。图13描绘了观察到的对比模型预测的(基于群体或个体的)cmin浓度。图14描绘了用于分析药代动力学的模型的累积、时间进程和受试者内变异性。图15显示了对于方案1b，对以120mg治疗的患者估计的每个周期的平均浓度。群组1：120mg，群组2：120mg，新变体。虚线：肿瘤停滞(sjsa-1细胞系)，虚线：肿瘤停滞(脂肪肉瘤细胞系)。用圆圈表示每个个体患者。图16显示几何平均浓度-时间曲线(方案1a，周期1第1天)(pas)。图17显示了第一周期(dds)期间的个体人平均nvp-hdm201浓度。个体c(平均值)＝周期1结束时的个体auc模式除以周期1的持续时间(以小时计)。平均剂量水平＝周期1结束时的总累积剂量除以周期1的持续时间(以天计)。图18显示了基于在每种方案中测试的以下剂量(以从上到下的顺序)建模的血小板动力学曲线：reg2c(d1-7q4wk):25mg(6.25mg/d)；reg2a(d1-14q4wk):20mg(10mg/d)；reg1b(第1天、第8天q4wk):150mg(10.7mg/d)；reg1a(d1q3wk):350mg(16.7mg/d)。图19显示了第一个治疗周期中的个体平均浓度与患有血液肿瘤的患者的每个方案的剂量。在120ng/ml处的线＝来自人sjsa-1异种移植大鼠的95％肿瘤消退。在41ng/ml处的线＝在人sjsa-1(骨肉瘤)异种移植大鼠中源自tgipk/pd模型的肿瘤停滞的平均浓度。在19ng/ml处的线＝在人hsax2655(脂肪肉瘤)pdx大鼠中源自tgipk/pd建模的肿瘤停滞的平均浓度。计算平均剂量水平(mg/天)：图20显示了根据方案1b(2017年9月)，用hdm201治疗的患者的肉瘤(脂肪肉瘤和其他肉瘤)的直径总和自基线的最佳百分比变化与最佳总体响应。pd：疾病进展，sd：疾病稳定，pr：部分响应。图21：balb/c小鼠的结肠26(colon26)肿瘤(7628结肠(colon)26-xpd)中的hdm201调节的免疫细胞浸润hdm201调节结肠26肿瘤中的免疫细胞谱。％cd11c+/cd45+髓样细胞(a)、％cd8+/cd45+t细胞(b)、cd45-细胞中的pdl1mfi(c)、和％pd1+/cd45+淋巴细胞(d)增加。将结肠26细胞植入balb/c小鼠的右侧腹皮下。当肿瘤达到约60mm3时，将小鼠随机分组并在第0天和第7天用hdm201以40mg/kg每3h处理一次共计3次。对小鼠实施安乐死，并且收集肿瘤并在第一次给药后第5天和第12天进行facs分析。图22：hdm201增强结肠26肿瘤和引流淋巴结(8063结肠26-xpd)中的dc功能、t细胞启动和cd8/treg比hdm201调节结肠26肿瘤中的免疫细胞谱。％cd103+cd11c+dc(a)、％tbet+eomes-cd8+/cd45+t细胞(b)、和cd8/treg比(c)增加。将结肠26细胞植入balb/c小鼠的右侧腹皮下。当肿瘤达到约100mm3时，将小鼠随机分组并在第0天和第7天用hdm201以40mg/kg每3h处理一次共计3次。对小鼠实施安乐死；收集肿瘤和引流淋巴结并在第一次给药后第5天和第12天进行facs分析。图23：体重变化百分比(8020结肠26-xef)体重变化百分比。向balb/c小鼠皮下植入2×105个结肠26细胞。将小鼠在细胞植入后第12、19和26天每3小时用40mg/kgx3的hdm201po(口服)处理，并在第12、15、19和22天用5mg/kgapd-1抗体ip(腹膜内)处理。每周记录两次体重，并且基于实例3的相应部分中描述的公式计算体重变化百分比。图24：到达终点的时间(8020结肠26-xef)到达终点的时间。向balb/c小鼠皮下植入2×105个结肠26细胞。将小鼠在细胞植入后第12、19和26天每3小时用40mg/kgx3的hdm201po处理，并在第12、15、19和22天用5mg/kgapd-1抗体ip处理。将终点定义为肿瘤体积等于或大于1000mm3。对数秩(logrank)，p<0.05。图25：个体肿瘤生长曲线(8020结肠26-xef)个体肿瘤生长曲线。向balb/c小鼠皮下植入2×105个结肠26细胞。将小鼠在细胞植入后第12、19和26天每3小时用40mg/kgx3的hdm201po处理，并在第12、15、19和22天用5mg/kgapd-1抗体ip处理。将终点定义为肿瘤体积等于或大于1000mm3。水平虚线指示肿瘤终点肿瘤尺寸(1000mm3)。图26：小鼠对结肠26细胞而不是4t1细胞(8020结肠26-xef)发展长效特异性记忆。用hdm201与apd1抗体的组合进行处理之前，在cr小鼠中发展长效特异性记忆。a)在hdm201+apd1抗体处理后达到cr的所有小鼠拒绝第二次注射结肠26细胞。在左侧腹向原初小鼠(n＝5)和cr小鼠(hdm201+apd1ab，n＝5)植入2×105个结肠26细胞。每周测量肿瘤体积。直至34天在患有cr的小鼠中没有观察到肿瘤。b)六周后，将4t1细胞植入原初小鼠(n＝5)和cr小鼠(hdm201+apd1ab，n＝5)的乳腺脂肪垫中。测量肿瘤体积，所有小鼠发展4t1肿瘤，并且在4t1细胞植入后14天实施安乐死。图27：通过用结肠26和4t1细胞重新攻击动物来证明记忆效应。图28：抗肿瘤记忆t细胞响应的证明：如用h2ld-ah1dextramer检测的，用hdm201或hdm201与抗pd1抗体的组合处理的小鼠脾中ah1特异性cd8+t细胞诱导响应者的频率。图29：抗肿瘤记忆t细胞响应的证明：cd8+t细胞内的cd44+ah1+的频率。图30：p53敲除结肠26克隆的体外表征图31：临床研究cpdr001x2102的研究期表的说明表1总结了鼠、嵌合和人源化抗pd-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。所述抗体分子包括鼠mabbap049，嵌合mabbap049-chi和bap049-chi-y，以及人源化mabbap049-hum01至bap049-hum16和bap049-克隆-a至bap049-克隆-e。该表中显示了重链和轻链cdr的氨基酸和核苷酸序列、重链和轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列、以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。表2描绘了人源化mabbap049-hum01至bap049-hum16和bap049-克隆-a至bap049-克隆-e的重链和轻链框架区的氨基酸和核苷酸序列。表3描绘了人igg重链和人κ轻链的恒定区氨基酸序列。表4显示了人源化mabbap049-克隆-a至bap049-克隆-e的重链和轻链前导序列的氨基酸序列。表5描绘了基于固定剂量给药(flatdosing)日程表的示例性pk参数。具体实施方式hdm2抑制剂术语“hdm2抑制剂”也称为“hdm2i”、“hdm2i”、“mdm2抑制剂”、“mdm2i”、“mdm2i”，在本文中表示抑制hdm-2/p53或hdm-4/p53相互作用的任何化合物，其中通过时间分辨荧光能量转移(tr-fret)测定测量的，ic50小于10μm、优选小于1μm、优选在nm范围内。通过时间分辨荧光能量转移(tr-fret)测量p53-hdm2和p53-hdm4相互作用的抑制。荧光能量转移(或foerster共振能量转移)描述了供体与受体5荧光分子之间的能量转移。对于此测定，将用c-末端生物素部分标记的mdm2蛋白(氨基酸2-188)和mdm4蛋白(氨基酸2-185)与铕标记的链霉抗生物素蛋白组合使用(珀金埃尔默公司(perkinelmer,inc.)，沃尔瑟姆，ma，usa)用作供体荧光团。p53衍生的、cy5标记的肽cy5-tfsdlwkll(p53aa18-26)是能量受体。在340nm处激发供体10分子后，mdm2或mdm4与p53肽之间的结合相互作用在665nm处的受体发射波长处诱导能量转移和增强的响应。由于抑制剂分子与mdm2或mdm4的p53结合位点结合而导致p53-mdm2或p53-mdm4复合物形成的破坏，这导致615nm处的增加的供体发射。从时间分辨模式中测量的两个不同荧光信号的15个原始数据计算比fret测定读数(计数665nm/计数615nmx1000)。可以根据以下程序进行测定：以3.1μl的总体积在白色1536w微量滴定板(greinerbio-onegmbh公司，弗里肯豪森，德国)中进行该试验，通过将100nl稀释在90％dmso/10％h2o(3.2％最终dmso浓度)中的化合物与2μl铕20标记的链霉抗生物素蛋白(最终浓度2.5nm)组合，在反应缓冲液(pbs、125mmnacl、0.001％novexin(由碳水化合物聚合物(novexin聚合物)组成，旨在增加蛋白质的溶解度和稳定性；novexinltd.公司，ambridgeshire，英国)、明胶0.01％、0.2％普朗尼克(来自乙烯氧化物和环氧丙烷的嵌段共聚物，basf，路德维希港，德国)、1mmdtt)中，随后添加0.5μl稀释在测定缓冲液中的mdm2-bio或mdm4-bio(最终浓度10nm)进行。允许溶液在室温预孵育15分钟，随后在测定缓冲液中添加0.5μlcy5-p53肽(最终浓度20nm)。在读板之前在室温孵育10分钟。对于样品的测量，使用具有以下设置30的analystgt多模式酶标仪(分子器件公司(moleculardevices))：二向色镜380nm、激发330nm、发射供体615nm和发射接收器665nm。使用xlfit通过曲线拟合计算ic50值。如果未指定，试剂购自西格玛化工有限公司(sigmachemicalco)，圣路易斯，mo，usa。根据本发明的优选的hdm2抑制剂是hdm201，即(s)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1h-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，也称为(6s)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1h)-酮，hdm201可以作为游离分子、作为溶剂化物(包括水合物)或作为酸变体存在。该溶剂化物可以是乙醇溶剂化物(乙醇化物)。酸变体可以是hdm201与酸形成的盐，或hdm201酸复合物，或作为hdm201酸共晶、优选地hdm201作为共晶存在。优选地，该酸是琥珀酸。最优选地，hdm201以琥珀酸共晶体存在。hdm201及其水合物、溶剂化物和酸变体和制造过程披露在wo2013/111105(例如实例102，形式a、b、和c)。pd-1的抗体分子在一个实施例中，该pd-1抑制剂是抗pd-1抗体分子，如题为“pd-1的抗体分子及其用途”的ussn14/604,415和wo/2015/112900中所述，两者均通过引用以其全文并入。在一个实施例中，该抗pd-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个抗原结合区(例如可变区或其抗原结合片段)，包括来自重链的三个互补决定区(cdr)和来自轻链的三个cdr，例如选自以下中任何一项的抗体：bap049-hum01、bap049-hum02、bap049-hum03、bap049-hum04、bap049-hum05、bap049-hum06、bap049-hum07、bap049-hum08、bap049-hum09、bap049-hum10、bap049-hum11、bap049-hum12、bap049-hum13、bap049-hum14、bap049-hum15、bap049-hum16、bap049-克隆-a、bap049-克隆-b、bap049-克隆-c、bap049-克隆-d、或bap049-克隆-e；或如表1所述，或是由表1中核苷酸序列所编码的；或者与前述序列中任何一项基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。例如，该抗pd-1抗体分子可包括根据卡巴特等人所述的vhcdr1、或根据乔西亚等人所述的vh高变环1、或其组合，例如如表1中所示。在一个实施例中，vhcdr1的卡巴特和乔西亚cdr的组合包含氨基酸序列gytfttywmh(seqidno:224)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，取代、缺失或插入，例如保守取代))。该抗pd-1抗体分子可进一步包括例如根据卡巴特等人所述的vhcdr2-3和根据卡巴特等人所述的vlcdr1-3，例如如表1中所示。因此，在一些实施例中，框架区基于根据卡巴特等人定义的cdr和根据乔西亚等人定义的高变环的组合来定义。例如，该抗pd-1抗体分子可包括基于根据乔西亚等人的vh高变环1定义的vhfr1和基于根据卡巴特等人的vhcdr1-2定义的vhfr2，例如如表1中所示。该抗pd-1抗体分子可进一步包括例如根据卡巴特等人基于vhcdr2-3定义的vhfr3-4和根据卡巴特等人基于vlcdr1-3定义的vlfr1-4。在本发明的组合中结合程序性死亡1(pd-1)的优选抗体分子(例如人源化抗体分子)是作为bap049-克隆-e的示例性抗体分子，并且优选的氨基酸序列描述于本文的表1中(vh：seqidno:38；vl：seqidno:70)。此特定的优选的抗体分子在本文中也称为pdr001或spartalizumab(inn)。本发明进一步涉及药物组合，用于同时、分开或顺序给予，用于治疗增殖性疾病，特别是tp53野生型实体瘤，该药物组合包含(a)结合程序性死亡1(pd-1)的至少一种抗体分子(例如，人源化抗体分子)，尤其是本文所述的示例性抗体分子，和(b)hdm2抑制剂(如化合物a)或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体。在一个实施例中，本发明的特征在于治疗(例如，抑制、减轻或改善)受试者中的障碍，例如过度增殖性病症或障碍(例如，癌症)的方法。该方法包括与hdm2抑制剂组合、以约300mg至400mg的剂量向该受试者给予抗pd-1抗体分子，例如本文所述的优选的抗pd-1抗体分子，每三周一次或每四周一次。例如，在某些实施例中，将该优选的抗pd-1抗体分子以约300mg的剂量给予，每三周一次。例如，在其他实施例中，将该优选的抗pd-1抗体分子以约400mg的剂量给予，每四周一次。在一些实施例中，该增殖性障碍是癌症。在一些实施例中，该增殖性障碍是tp53野生型肿瘤，并且特别地是tp53野生型实体瘤。为了被认为是tp53野生型，肿瘤必需至少在第一剂研究药物之前不超过36个月收集的肿瘤样品中在外显子5、6、7和8中检测不到突变。先前记录为具有hdm2的基因组扩增的肿瘤(定义为>4拷贝数，与日期无关)不需要tp53wt状态确认。在一些实施例中，增殖性障碍是tp53野生型rcc。在一些实施例中，增殖性障碍是tp53野生型crc，特别是微卫星稳定(mss)crc，也称为msscrc。在一些实施例中，将该抗pd-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约300mg、或约400mg的剂量(例如固定剂量)给予。该给药日程表(例如，固定剂量给药日程表)可以从例如每周一次到每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子(例如示例性抗体分子)以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子(例如示例性抗体分子)以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子(例如示例性抗体分子)以从约400mg的剂量给予，每三周一次。在另一个方面，本发明的特征在于降低过度增殖性(例如癌症)细胞的活性(例如生长、存活、或生存能力，或者全部)的方法。该方法包括使细胞与抗pd-1抗体分子(例如本文所述的抗pd-1抗体分子)接触。该方法可以例如作为治疗方案的一部分与c-raf受体酪氨酸激酶抑制剂组合在受试者中进行，例如剂量为约300mg至400mg的抗pd-1抗体分子，每三周一次或每四周一次。在某些实施例中，该剂量为约300mg的抗pd-1抗体分子，每三周一次。在其他实施例中，该剂量为约400mg的抗pd-1抗体分子，每四周一次。在另一个方面，本发明的特征在于包括抗pd-1抗体分子(例如如本文所述的抗pd-1抗体分子)的组合物(例如一种或多种组合物或剂型)。本文还描述了包括抗pd-1抗体分子(例如如本文所述的抗pd-1抗体分子)的配制品，例如剂量配制品和套件，例如治疗套件。在某些实施例中，该组合物或配制品包含300mg或400mg的抗pd-1抗体分子(例如，如本文所述的抗pd-1抗体分子)。在一些实施例中，将该组合物或配制品每三周给予或使用一次或者每四周给予或使用一次。将此类组合物与hdm2抑制剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体组合使用，用于同时、分开或顺序给药，通常用于治疗rcc或crc，特别是用于治疗患有rcc或msscrc的患者。在另一方面，本发明提供了抗pd-1抗体，用于在治疗rcc或crc中使用，其中给予或制备该抗pd-1抗体用于与hdm2抑制剂分开、同时或顺序给予。还提供了hdm2抑制剂，用于在治疗rcc或crc中使用，其中给予或制备该hdm2抑制剂用于与抗pd-1抗体分开、同时或顺序给予。典型地，该抗pd-1抗体被静脉内给予，并且因此与hdm2抑制剂分开或顺序给予，优选口服给予。本文描述了hdm2抑制剂和抗pd-1抗体给予的合适方法、途径、剂量和频率。本文公开的组合可以以单一组合物一起给予或者以两种或更多种不同组合物(例如，如本文所述的组合物或剂型)分开给予。治疗剂的给予可以是任何顺序。第一药剂和另外的药剂(例如第二、第三药剂)可以通过相同的给药途径或通过不同的给药途径给予。本文所述的药物组合，特别是本发明的药物组合，可以是自由组合产品，即两种或更多种活性成分的组合，例如化合物a和本文所述的示例性抗体分子(抗体b)，其作为两种或更多种不同的剂型同时、分开或顺序给予。自由组合产品可以是：(a)一起包装在单一包装或套件中的两种或更多种单独的药物产品，或(b)根据其标签分开包装的药物产品，仅用于与其他单独指定的药物一起使用，其中每种药物都需要达到预期的用途、指示或效果。本发明还提供了一种组合制剂，其包含(a)一个或多个剂量单位的hdm2抑制剂(化合物a)或其药学上可接受的盐，和(b)一个或多个剂量单位的如本文所述的抗pd-1抗体，以及至少一种药学上可接受的载体。在另外的实施例中，本发明特别涉及治疗增殖性疾病、特别是癌症的方法。在一个实施例中，本发明涉及本发明组合用于制备用于治疗增殖性疾病(特别是癌症)的药物用途。在一个实施例中，本发明的组合用于制备用于治疗增殖性疾病、特别是癌症的药物。本发明还提供了本文所述的药物组合，例如包含如下的药物组合：(a)化合物a或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体，和(b)能够结合人程序性死亡-1(pd-1)的分离的抗体分子，该分离的抗体分子包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区(vh)包含如表1中所述的bap049-克隆-b或bap049-克隆-e的hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列，并且该轻链可变区(vl)包含如下表1中所述的bap049-克隆-b或bap049-克隆-e的lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列，用于治疗tp53野生型实体瘤。组合疗法的用途本文公开的组合可以导致以下中的一项或多项：抗原呈递的增加、效应细胞功能(例如t细胞增殖、ifn-γ分泌或细胞溶解功能中的一种或多种)的增加、调节性t细胞功能的抑制、对多种细胞类型(如调节性t细胞、效应t细胞和nk细胞)活性的影响、肿瘤浸润淋巴细胞的增加、t细胞受体介导的增殖的增加和癌细胞的免疫逃逸的减少。在一个实施例中，组合中pd-1抑制剂的使用抑制、降低或中和pd-1的一种或多种活性，导致免疫检查点的阻断或减少。因此，这类组合可用于治疗或预防希望增强受试者免疫响应的障碍。因此，在另一方面，提供了调节受试者中的免疫响应的方法。该方法包括向该受试者给予本文披露的组合(例如包含治疗有效量的抗pd-1抗体分子和治疗有效量的化合物a或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体的组合)，使得该受试者中的免疫响应受到调节。在一个实施例中，该抗体分子增强、刺激或增加受试者中的免疫响应。受试者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，优选更高等灵长类动物，例如人(例如患有或有风险患有本文所述障碍的患者)。在一个实施例中，该受试者需要增强免疫响应。在一个实施例中，该受试者患有或有风险患有本文所述障碍，例如，如本文所述的癌症或传染性障碍。在某些实施例中，该受试者是免疫受损的或处于免疫受损的风险中。例如，该受试者正在经历或已经历化学治疗和/或放射疗法。可替代地，或以组合形式，该受试者由于感染而免疫受损或处于免疫受损的风险中。在一方面，一种治疗(例如减少、抑制或延迟进展中的一种或多种)增殖性疾病的方法，该增殖性疾病是实体瘤，该实体瘤是tp53野生型，特别地是rcc或crc。在另一方面，提供了治疗(例如减少、抑制或延迟进展中的一种或多种)受试者中增殖性疾病的方法，该增殖性疾病是实体瘤，该实体瘤是tp53野生型，特别地是rcc或crc。该方法包括向该受试者给予本文披露的组合(例如包含治疗有效量的抗pd-1抗体分子和治疗有效量的化合物a或其药学上可接受的盐、溶剂化物、复合物或共晶体的组合)。本文所述的组合可以以全身方式(例如口服、肠胃外、皮下、静脉内、直肠、肌肉内、腹膜内、鼻内、透皮、或通过吸入或腔内装置)、局部方式或通过应用于粘膜(如鼻子、喉咙和支气管)向该受试者给予。剂量和治疗方案本文披露的治疗剂的剂量和治疗方案可由技术人员确定。在某些实施例中，将该抗pd-1抗体分子通过注射(例如皮下或静脉内)以约1mg/kg至30mg/kg，例如约5mg/kg至25mg/kg、约10mg/kg至20mg/kg、约1至5mg/kg、或约3mg/kg的剂量给予。该给药日程表可以从例如每周一次至每2、3、或4周一次变化。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约10mg/kg至20mg/kg的剂量给予，每两周一次。在一些实施例中，将该抗pd-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约300mg、或约400mg的剂量(例如固定剂量)给予。该给药日程表(例如，固定剂量给药日程表)可以从例如每周一次到每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每三周一次。化合物a的总日剂量可以以单一剂量(即每天一次)或每日两次给予。例如，可以将化合物a以1200mg的剂量给予，每天一次，或者以400mg的剂量给予，每天两次。可以将hdm2抑制剂(其是化合物a)在4周治疗周期的第1天和第8天以约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120mg的每日剂量给予，并且将优选的抗pd-1抗体分子以每三周一次约400mg的剂量给予。可以将hdm2抑制剂(其是化合物a)在4周治疗周期的第1天和第8天以约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120mg的每日剂量给予，并且将抗pd-1抗体分子以每四周一次约400mg的剂量给予。特别地，可以将化合物a在4周治疗周期的第1天和第8天以约40、60、80、100、120mg的每日剂量每日一次(qd)给予。在优选的实施例中，可以将示例性抗pd-1分子以400mg的剂量每四周一次给予，并且可以将化合物a在4周治疗周期的第1天和第8天以60、80、100、或120mg的每日剂量给予。另外的组合疗法本文描述的方法和组合可以与其他药剂或治疗方式组合使用。在一个实施例中，本文所述的方法包括以有效治疗或预防障碍的量向该受试者给予包含如本文所述的抗pd-1抗体分子的组合，其与药剂或治疗程序或方式组合。该抗pd-1抗体分子和药剂或治疗程序或方式可以以任何顺序同时或顺序给予。可以使用抗pd-1抗体分子和其他治疗剂、程序或方式(例如，如本文所述)的任何组合和顺序。该抗体分子和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间给予。该抗体分子可以在其他治疗之前、与治疗同时、治疗后或在障碍缓解期给予。在某些实施例中，将本文所述的方法和组合物与其他抗体分子、化学疗法、其他抗癌疗法(例如靶向抗癌疗法、基因疗法、病毒疗法、rna疗法骨髓移植、纳米疗法或溶瘤细胞药物)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法(例如细胞因子或基于细胞的免疫疗法)、外科手术(例如乳房肿瘤切除术或乳房切除术)或放射程序、或前述中任何的组合中的一种或多种组合给予。另外的疗法可以呈辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施例中，另外的疗法是酶抑制剂(例如，小分子酶抑制剂)或转移抑制剂。可以组合给予的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷化剂、蒽环类药物、长春花生物碱、嵌入剂、能够干扰信号转导通路的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂和辐射(例如局部或全身辐射(例如γ辐射))。在其他实施例中，另外的疗法是手术或放射，或其组合。在其他实施例中，另外的疗法是靶向pi3k/akt/mtor通路、hsp90抑制剂或微管蛋白抑制剂中的一种或多种的疗法。可替代地，或与前述组合组合，本文所述的方法和组合物可与以下中的一种或多种组合给予：免疫调节剂(例如共刺激分子的活化剂或抑制分子的抑制剂，例如免疫检查点分子)；疫苗，例如治疗性癌症疫苗；或其他形式的细胞免疫疗法。在一个实施例中，将本文公开的组合，例如包含抗pd-1抗体分子的组合，与化学疗法组合使用以治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一个实施例中，将抗pd-1抗体分子与标准肺(例如nsclc)化学疗法(例如铂双重疗法(platinumdoublettherapy))一起使用，以治疗肺癌。癌症可能处于早期、中期或晚期阶段。在一个实施例中，将本文公开的组合(例如包含抗pd-1抗体分子的组合)与化学疗法组合使用以治疗皮肤癌，例如黑素瘤。在一个实施例中，将抗pd-1抗体分子与标准皮肤(例如黑素瘤)化学疗法(例如铂双重疗法)一起使用，以治疗皮肤癌。癌症可能处于早期、中期或晚期阶段。可以使用抗pd-1抗体分子和其他治疗剂、程序或方式(例如，如本文所述)的任何组合和顺序。该抗体分子和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间给予。该抗体分子可以在其他治疗之前、与治疗同时、治疗后或在障碍缓解期给予。本文至少部分地公开了以高亲和力和特异性结合程序性死亡1(pd-1)的抗体分子(例如人源化抗体分子)。还提供了编码抗体分子的核酸分子、表达载体、宿主细胞和制备这些抗体分子的方法。还提供了包含这些抗体分子的药物组合物和剂量配制品。本文公开的抗pd-1抗体分子可以(单独或与其他药剂或治疗方式组合)用于治疗、预防和/或诊断障碍，如癌症(例如实体和软组织肿瘤)。因此，本文公开了用于检测pd-1的组合物和方法，以及使用该抗pd-1抗体分子治疗包括癌症在内的各种障碍的方法。在某些实施例中，该抗pd-1抗体分子以平或固定剂量给予或使用。定义另外的术语在下面和整个申请中定义。如本文所用，冠词“一个/种(a和an)”是指一个/种或多于一个/种(例如，至少一个/种)该冠词的语法宾语。除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。“约”和“大约”通常表示在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定值或值范围的20％内，典型地在10％内，并且更典型地，在5％内。“组合”或“与……组合”并不旨在暗示必需同时给予这些治疗剂或治疗性药剂和/或配制其用于一起递送，尽管这些递送方法也在本文所述的范围内。组合中的治疗剂可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗剂同时、在其之前或之后给予。治疗剂或治疗方案可以以任何顺序给予。通常，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或日程表给予。还应理解，该组合中使用的另外的治疗剂可以以单一组合物一起给予或以不同组合物分开给予。通常，预期组合中使用的其他治疗剂的以不超过它们单独使用时的水平使用。在一些实施例中，组合中使用的水平将低于单独使用的水平。在实施例中，另外的治疗剂以治疗剂量或低于治疗剂量给予。在某些实施例中，当第二治疗剂与第一治疗剂(例如抗pd-1抗体)组合给予时，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第二治疗剂的浓度比单独给予第二治疗剂时低。在某些实施例中，当第一治疗剂与第二治疗剂组合给予时，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第一治疗剂的浓度比单独给予第一治疗剂时低。在某些实施例中，在组合疗法中，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第二治疗剂的浓度比作为单一疗法的第二治疗剂的治疗剂量低，例如低10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、或80％-90％。在某些实施例中，在组合疗法中，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第一治疗剂的浓度比作为单一疗法的第一治疗剂的治疗剂量低，例如低10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、或80％-90％。术语“抑制”、“抑制剂”或“拮抗剂”包括给定分子(例如免疫检查点抑制剂)的某些参数(例如活性)的降低。例如，该术语包括至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性(例如pd-1或pd-l1活性)的抑制。因此，抑制不必是100％。术语“活化”、“活化剂”或“激动剂”包括给定分子(例如共刺激分子)的某些参数(例如活性)的增加。例如，该术语包括至少5％、10％、25％、50％、75％或更多的活性(例如共刺激活性)的增加。术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指由给予一种或多种疗法导致的障碍(例如增殖性障碍)的进展、严重性和/或持续时间的减少或缓解，或者障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)的缓解。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。如本文所用，术语“分离的”是指从其原始或天然环境(例如其天然存在的天然环境)中移除的材料。例如，不分离存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽，而是分离通过人为干预从天然系统中的一些或所有共存材料中分出的相同多核苷酸或多肽。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其天然存在的环境的一部分。下面进一步详细描述了本发明的各个方面。另外的定义在整个申请书中陈述。抗体分子在一个实施例中，该抗体分子结合哺乳动物(例如人)pd-1。例如，该抗体分子特异性结合pd-1上的表位，例如线性或构象表位(例如如本文所述的表位)。如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括，例如，单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白fc区的全长抗体)。在实施例中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在实施例中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能性片段。在实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，抗体分子是单特异性抗体分子并结合单一表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个免疫球蛋白可变结构域序列结合相同的表位。在实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一和第二表位重叠。在实施例中，第一和第二表位不重叠。在实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一和第二表位重叠。在实施例中，第一和第二表位不重叠。在实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scfv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scfv或其片段。在实施例中，该第一表位位于pd-1上，并且该第二表位位于tim-3、lag-3、ceacam(例如ceacam-1和/或ceacam-5)、pd-l1或pd-l2上。在实施例中，抗体分子包括双抗体、和单链分子、以及抗体的抗原结合片段(例如，fab、f(ab’)2、和fv)。例如，抗体分子可以包含重(h)链可变结构域序列(在本文缩写为vh)、和轻(l)链可变结构域序列(在本文缩写为vl)。在实施例中，抗体分子包含重链和轻链(在本文中称为半抗体)或由其组成。在另一个实例中，抗体分子包含两个重(h)链可变结构域序列和两个轻(l)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点(如fab、fab’、f(ab’)2、fc、fd、fd’、fv、单链抗体(例如scfv)、单可变结构域抗体、双体(dab)(二价和双特异性)、和嵌合(例如，人源化)抗体)，其可以通过修饰完整抗体或使用重组dna技术从头合成的抗体产生。这些功能抗体片段保留了与其各自的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何类别的抗体，包括但不限于igg、iga、igm、igd和ige，以及来自任何亚类的抗体(例如igg1、igg2、igg3和igg4)。抗体分子的制剂可以是单克隆或多克隆的。抗体分子也可以是人、人源化、cdr移植或体外产生的抗体。抗体可具有选自例如igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区。抗体还可以具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(ig)与术语“抗体”在本文中可互换地使用。抗体分子的抗原结合片段的实例包括：(i)fab片段，其是由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，其是包含两个在绞链区由二硫桥键连接的fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)由vh结构域组成的双抗体(dab)片段；(vi)骆驼科(camelid)或骆驼化(camelized)可变结构域；(vii)单链fv(scfv)(参见例如bird等人(1988)science[科学]242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)；(viii)单一结构域抗体。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。术语“抗体”包括完整分子及其功能性片段。可以改变(例如突变)抗体的恒定区以修饰该抗体的性质(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能)。vh和vl区可以细分为被称为“互补决定区”(cdr)的高变区，其间插入被称为“框架区”(fr或fw)的更保守的区域。框架区和cdr的范围已经通过许多方法精确定义(参见，kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices[美国健康与人类服务部],nih公开号91-3242；chothia,c.等人(1987)j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901-917；以及由牛津分子abm抗体建模软件(oxfordmolecular'sabmantibodymodellingsoftware)使用的abm定义)。通常参见例如，proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]在：antibodyengineeringlabmanual[抗体工程实验室手册](编辑：duebel,s.和kontermann,r.，施普林格出版社(springer-verlag)，海德尔堡)中。如本文所用，术语“互补决定区”和“cdr”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中存在三个cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3)，并且每个轻链可变区中存在三个cdr(lcdr1、lcdr2、lcdr3)。给定cdr的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括以下中所述的那些：卡巴特等人(1991),“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学兴趣的蛋白质序列],”第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth[美国国立卫生研究院，公共卫生服务部],贝塞斯达,马里兰州(“卡巴特”编号方案)，al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948(“乔西亚”编号方案)。如本文所用，根据“乔西亚”编号方案定义的cdr有时也称为“高变环”。例如，根据卡巴特，将重链可变结构域(vh)中的cdr氨基酸残基编号为31-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；并将轻链可变结构域(vl)中的cdr氨基酸残基编号为24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。根据乔西亚，将vh中的cdr氨基酸编号为26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；并将vl中的氨基酸残基编号为26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。通过结合卡巴特和乔西亚的cdr定义，cdr由人vh中的氨基酸残基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)和人vl中的氨基酸残基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)组成。通常，除非特别指出，否则该抗pd-1抗体分子可包括例如如表1中所述的一种或多种卡巴特cdr和/或乔西亚高变环的任何组合。在一个实施例中，以下定义用于表1中描述的抗pd-1抗体分子：hcdr1，根据卡巴特和乔西亚二人的组合cdr定义以及hccdr2-3和lccdr1-3，根据卡巴特的cdr定义。根据所有定义，每个vh和vl典型地包括三个cdr和四个fr，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以包括或可以不包括一个、两个或更多个n-或c-末端氨基酸，或者可以包括与蛋白质结构的形成相容的其他改变。术语“抗原结合位点”是指抗体分子的一部分，其包含形成与pd-1多肽或其表位结合的界面的决定簇。关于蛋白质(或蛋白质模拟物)，抗原结合位点典型地包括形成与pd-1多肽结合的界面的一个或多个环(具有至少四个氨基酸或氨基酸模拟物)。典型地，抗体分子的抗原结合位点包括至少一个或两个cdr和/或高变环，或更典型地至少三个、四个、五个或六个cdr和/或高变环。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或不使用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备。人源化或cdr-移植的抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)接受者cdr被供体cdr替换。抗体可以被至少一部分非人cdr替换，或者仅一些cdr可以被非人cdr替换。仅需要替换人源化抗体与pd-1结合所需的cdr的数量。优选地，供体是啮齿动物抗体，例如大鼠或小鼠抗体，并且接受者将是人框架或人共有框架。典型地，提供cdr的非人类免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，供体免疫球蛋白是非人类(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人类)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高、优选90％、95％、99％或更高同一性的序列。示例性pd-1抑制剂pd-1是cd28/ctla-4家族成员，其在例如活化的cd4+和cd8+t细胞、tregs、和b细胞上表达。它负调节效应t细胞信号传导和功能。pd-1在肿瘤浸润性t细胞上被诱导，并且可导致功能性衰竭或功能障碍(keir等人(2008)annu.rev.immunol.[免疫学年评]26:677-704；pardoll等人(2012)natrevcancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。pd-1在与其两种配体(程序性死亡-配体1(pd-l1)或程序性死亡-配体2(pd-l2))之一结合时递送共抑制信号。pd-l1在许多细胞类型(包括t细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、树突细胞(dc)、b细胞、上皮细胞、血管内皮细胞)以及许多类型的肿瘤上表达。pd-l1在鼠和人肿瘤上的高表达与多种癌症中的不良临床结果相关(keir等人(2008)annu.rev.immunol.[免疫学年评]26:677-704；pardoll等人(2012)natrevcancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。pd-l2在树突细胞、巨噬细胞和一些肿瘤上表达。已经针对癌症免疫疗法在临床前和临床上验证了阻断pd-1通路。临床前和临床研究都证明，抗pd-1阻断可以恢复效应t细胞的活性，并产生强大的抗肿瘤响应。例如，阻断pd-1通路可以恢复衰竭/功能失调的效应t细胞功能(例如，增殖、ifn-γ分泌或细胞溶解功能)和/或抑制treg细胞功能(keir等人(2008)annu.rev.immunol.[免疫学年评]26:677-704；pardoll等人(2012)natrevcancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。pd-1通路的阻断可以用抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或pd-1、pd-l1和/或pd-l2的寡肽实现。如本文所用，术语“程序性死亡1”或“pd-1”包括同种型，哺乳动物例如人pd-1，人pd-1的物种同源物，和包含至少一个与pd-1的共同表位的类似物。pd-1的氨基酸序列(例如人pd-1)是本领域已知的，例如shinoharat等人(1994)genomics[基因组学]23(3):704-6；fingerlr等人gene[基因](1997)197(1-2):177-87。本文所述的抗pd-1抗体分子可以根据本文描述的方法单独使用或与本文所述的一种或多种另外的药剂组合使用。在某些实施例中，本文所述的组合包括pd-1抑制剂，例如，如本文所述的抗pd-1抗体分子(例如，人源化抗体分子)。在一个实施例中，该抗pd-1抗体分子包括：(a)重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含seqidno:4的hcdr1氨基酸序列、seqidno:5的hcdr2氨基酸序列和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及轻链可变区(vl)，该轻链可变区(vl)包含seqidno:13的lcdr1氨基酸序列、seqidno:14的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:33的lcdr3氨基酸序列；(b)vh，该vh包含选自seqidno:1的hcdr1氨基酸序列；seqidno:2的hcdr2氨基酸序列；和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:10的lcdr1氨基酸序列、seqidno:11的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:32的lcdr3氨基酸序列；(c)vh，该vh包含seqidno:4的hcdr1氨基酸序列、seqidno:5的hcdr2氨基酸序列和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:13的lcdr1氨基酸序列、seqidno:14的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:33的lcdr3氨基酸序列；或(d)vh，该vh包含seqidno:1的hcdr1氨基酸序列；seqidno:2的hcdr2氨基酸序列；和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:10的lcdr1氨基酸序列、seqidno:11的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:32的lcdr3氨基酸序列。在一个实施例中，该抗pd-1抗体分子包含：(a)重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含seqidno:4的hcdr1氨基酸序列、seqidno:5的hcdr2氨基酸序列和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及轻链可变区(vl)，该轻链可变区(vl)包含seqidno:13的lcdr1氨基酸序列、seqidno:14的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:33的lcdr3氨基酸序列；(b)vh，该vh包含seqidno:1的hcdr1氨基酸序列；seqidno:2的hcdr2氨基酸序列；和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:10的lcdr1氨基酸序列、seqidno:11的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:32的lcdr3氨基酸序列；(c)vh，该vh包含seqidno:224的hcdr1氨基酸序列、seqidno:5的hcdr2氨基酸序列和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:13的lcdr1氨基酸序列、seqidno:14的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:33的lcdr3氨基酸序列；或(d)vh，该vh包含seqidno:224的hcdr1氨基酸序列；seqidno:2的hcdr2氨基酸序列；和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；以及vl，该vl包含seqidno:10的lcdr1氨基酸序列、seqidno:11的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:32的lcdr3氨基酸序列。在某些实施例中，该抗pd-1抗体分子包含：(i)重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含选自seqidno:1、seqidno:4或seqidno:224的hcdr1氨基酸序列；seqidno:2的hcdr2氨基酸序列；和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；并且(ii)轻链可变区(vl)，该轻链可变区(vl)包含seqidno:10的lcdr1氨基酸序列、seqidno:11的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:32的lcdr3氨基酸序列。在其他实施例中，该抗pd-1抗体分子包含：(i)重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含选自seqidno:1、seqidno:4或seqidno:224的hcdr1氨基酸序列；seqidno:5的hcdr2氨基酸序列和seqidno:3的hcdr3氨基酸序列；并且(ii)轻链可变区(vl)，该轻链可变区(vl)包含seqidno:13的lcdr1氨基酸序列、seqidno:14的lcdr2氨基酸序列、和seqidno:33的lcdr3氨基酸序列。在前述抗体分子的实施例中，该hcdr1包含seqidno:1的氨基酸序列。在其他实施例中，该hcdr1包含seqidno:4的氨基酸序列。在又其他实施例中，该hcdr1包含seqidno:224的氨基酸序列。在实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架(fw)区的重链可变区，该框架区包含seqidno:147、151、153、157、160、162、166、或169中任何一项的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者与seqidno:147、151、153、157、160、162、166、或169中任何一项的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸取代、插入或缺失。在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的重链可变区，该框架区包含seqidno:147、151、153、157、160、162、166、或169中任何一项的氨基酸序列。在又其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少两个、三个或四个框架区的重链可变区，该框架区包含seqidno:147、151、153、157、160、162、166、或169中任何一项的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含seqidno:147或151的vhfw1氨基酸序列，seqidno:153、157或160的vhfw2氨基酸序列，和seqidno:162或166的vhfw3氨基酸序列，并且任选地，还包含seqidno:169的vhfw4氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的轻链可变区，该框架区包含seqidno:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任何一项的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者与seqidno:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任何一项的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸取代、插入或缺失。在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的轻链可变区，该框架区包含seqidno:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任何一项的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少两个、三个或四个框架区的轻链可变区，该框架区包含seqidno:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任何一项的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含seqidno:174、177、181、183或185的vlfw1氨基酸序列，seqidno:187、191或194的vlfw2氨基酸序列，和seqidno:196、200、202或205的vlfw3氨基酸序列，并且任选地，还包含seqidno:208的vlfw4氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与seqidno:38、50、82或86中任何一项至少85％同一的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含seqidno:38、50、82、或86的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与seqidno:42、46、54、58、62、66、70、74或78中任何一项至少85％同一的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:42、46、54、58、62、66、70、74、或78的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含seqidno:38的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链。在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含seqidno:50的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:52或seqidno:102的氨基酸序列的重链。在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含seqidno:82的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:84的氨基酸序列的重链。在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含seqidno:86的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:88的氨基酸序列的重链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:42的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:44的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:46的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:48的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:54的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:56的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:58的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:60的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:62的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体包含含有seqidno:64的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:66的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:70的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:74的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:76的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含seqidno:78的氨基酸序列。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:80的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:42的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:66的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:70的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:50的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:70的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:46的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:50的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:46的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:50的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:54的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:54的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:58的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:62的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:50的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:66的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:74的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:38的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:78的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:82的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:70的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:82的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:66的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:86的氨基酸序列的重链可变结构域和含有seqidno:66的氨基酸序列的轻链可变结构域。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链和含有seqidno:44的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链和含有seqidno:56的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链和含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链和含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:102的氨基酸序列的重链和含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:44的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:48的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:52的氨基酸序列的重链和含有seqidno:48的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:52的氨基酸序列的重链和含有seqidno:56的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:56的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:60的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:64的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:52的氨基酸序列的重链和含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:52的氨基酸序列的重链和含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:76的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:40的氨基酸序列的重链和含有seqidno:80的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:84的氨基酸序列的重链和含有seqidno:72的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:84的氨基酸序列的重链和含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子包含含有seqidno:88的氨基酸序列的重链和含有seqidno:68的氨基酸序列的轻链。在其他实施例中，前述抗体分子选自fab、f(ab')2、fv或单链fv片段(scfv)。在其他实施例中，前述抗体分子包含选自igg1、igg2、igg3和igg4的重链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含选自κ或λ轻链恒定区的轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含人igg4重链恒定区(其在seqidno:212或214的位置228(根据eu编号)或位置108处具有突变)和κ轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含人igg4重链恒定区(其在seqidno:212或214的位置228(根据eu编号)或位置108处具有丝氨酸至脯氨酸突变)和κ轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含人igg1重链恒定区(其在seqidno:216的位置297(根据eu编号)或位置180处具有天冬酰胺至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含人igg1重链恒定区(其在seqidno:217的位置265(根据eu编号)或位置148处具有天冬氨酸盐至丙氨酸突变，以及在seqidno:217的位置329(根据eu编号)或位置212处具有脯氨酸至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子包含人igg1重链恒定区(其在seqidno:218的位置234(根据eu编号)或位置117处具有亮氨酸至丙氨酸突变，以及在seqidno:218的位置235(根据eu编号)或位置118处具有亮氨酸至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。在其他实施例中，前述抗体分子能够结合人pd-1，其中解离常数(kd)小于约0.2nm。在一些实施例中，前述抗体分子结合人pd-1，其中kd小于约0.2nm、0.15nm、0.1nm、0.05nm、或0.02nm，例如约0.13nm至0.03nm，例如约0.077nm至0.088nm，例如约0.083nm，例如如通过biacore方法测量的。在其他实施例中，前述抗体分子结合食蟹猴pd-1，其中kd小于约0.2nm、0.15nm、0.1nm、0.05nm、或0.02nm，例如约0.11nm至0.08nm，例如约0.093nm，例如如通过biacore方法测量的。在某些实施例中，前述抗体分子结合人pd-1和食蟹猴pd-1两者，其中kd是相似的，例如在nm范围内，例如如通过biacore方法测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合人pd-1-ig融合蛋白，其中kd小于约0.1nm、0.075nm、0.05nm、0.025nm、或0.01nm，例如约0.04nm，例如如通过elisa测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合表达人pd-1的jurkat细胞(例如人pd-1转染的jurkat细胞)，其中kd小于约0.1nm、0.075nm、0.05nm、0.025nm、或0.01nm，例如约0.06nm，例如如通过facs分析测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合食蟹猴t细胞，其中kd小于约1nm、0.75nm、0.5nm、0.25nm、或0.1nm，例如约0.4nm，例如如通过facs分析测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合表达食蟹猴pd-1的细胞(例如用食蟹猴pd-1转染的细胞)，其中kd小于约1nm、0.75nm、0.5nm、0.25nm、或0.01nm，例如约0.6nm，例如如通过facs分析测量的。在某些实施例中，前述抗体分子不具有与小鼠或大鼠pd-1的交叉反应性。在其他实施例中，前述抗体具有与恒河猴pd-1的交叉反应性。例如，可以使用表达pd-1的细胞(例如表达人pd-1的300.19细胞)通过biacore方法或结合测定来测量交叉反应性。在其他实施例中，前述抗体分子结合pd-1的细胞外ig样结构域。在其他实施例中，前述抗体分子能够减少pd-1与pd-l1、pd-l2或两者，或者与表达pd-l1、pd-l2或两者的细胞的结合。在一些实施例中，前述抗体分子减少(例如阻断)pd-l1与表达pd-1的细胞(例如表达人pd-1的300.19细胞)的结合，其中ic50小于约1.5nm、1nm、0.8nm、0.6nm、0.4nm、0.2nm、或0.1nm，例如在约0.79nm和约1.09nm之间，例如约0.94nm，或约0.78nm或更小，例如约0.3nm。在一些实施例中，前述抗体减少(例如阻断)pd-l2与表达pd-1的细胞(例如表达人pd-1的300.19细胞)的结合，其中ic50小于约2nm、1.5nm、1nm、0.5nm、或0.2nm，例如在约1.05nm和约1.55nm之间，或约1.3nm或更小，例如约0.9nm。在其他实施例中，前述抗体分子能够增强抗原特异性t细胞响应。在实施例中，该抗体分子是单特异性抗体分子或双特异性抗体分子。在实施例中，该抗体分子对pd-1具有第一结合特异性，并且对tim-3、lag-3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、pd-l1或pd-l2具有第二结合特异性。在实施例中，该抗体分子包含抗体的抗原结合片段，例如半抗体或半抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，与使用同种型对照(例如igg4)时il-2的表达相比，前述抗体分子将来自葡萄球菌肠毒素b(seb)(例如，以25μg/ml)活化的细胞的il-2表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约2至3倍，例如约2至2.6倍，例如约2.3倍，例如，如在sebt细胞活化测定或人全血离体测定中所测量的。在一些实施例中，与使用同种型对照(例如igg4)时ifn-γ的表达相比，前述抗体分子将来自抗cd3(例如以0.1μg/ml)刺激的t细胞的ifn-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约1.2至3.4倍，例如约2.3倍，例如，如在ifn-γ活性测定中所测量的。在一些实施例中，与使用同种型对照(例如igg4)时ifn-γ的表达相比，前述抗体分子将来自seb(例如以3pg/ml)活化的t细胞的ifn-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约0.5至4.5倍，例如约2.5倍，例如，如在ifn-γ活性测定中所测量的。在一些实施例中，与使用同种型对照(例如igg4)时ifn-γ的表达相比，前述抗体分子将来自用cmv肽活化的t细胞的ifn-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约2至3.6倍，例如约2.8倍，例如，如在ifn-γ活性测定中所测量的。在一些实施例中，与使用同种型对照(例如igg4)时cd8+t细胞的增殖相比，上述抗体分子使用cmv肽活化的cd8+t细胞的增殖增加至少约1、2、3、4、5倍，例如约1.5倍，例如如由通过至少n(例如n＝2或4)个细胞分裂的cd8+t细胞的百分比来测量的。在某些实施例中，前述抗体分子的cmax在约100μg/ml和约500μg/ml之间、在约150μg/ml和约450μg/ml之间、在约250μg/ml和约350μg/ml之间、或在约200μg/ml和约400μg/ml之间，例如约292.5μg/ml，例如如在猴中所测量的。在某些实施例中，前述抗体分子的t1/2在约250小时和约650小时之间、在约300小时和约600小时之间、在约350小时和约550小时之间、或在约400小时和约500小时之间，例如约465.5小时，例如如在猴中所测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合pd-1，其中kd低于5×10-4、1×10-4、5×10-5、或1×10-5s-1，例如约2.13×10-4s-1，例如如通过biacore方法测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合pd-1，其中ka快于1×104、5×104、1×105、或5×105m1s1，例如约2.78×105m1s-1，例如如通过biacore方法测量的。在一些实施例中，前述抗pd-1抗体分子结合pd-1的c链、cc'环、c'链和fg环内的一个或多个残基。pd-1的结构域结构描述于例如以下文献中：cheng等人,"structureandinteractionsofthehumanprogrammedcelldeath1receptor[人类程序性细胞死亡1受体的结构和相互作用]"j.biol.chem.[生物化学杂志]2013,288:11771-11785。如cheng等人中所述，c链包含残基f43-m50，cc'环包含s51-n54，c'链包含残基q55-f62，并且fg环包含残基l108-i114(根据chang等人(同上)所述的氨基酸编号)。因此，在一些实施例中，如本文所述的抗pd-1抗体结合pd-1的f43-m50、s51-n54、q55-f62和l108-i114的一个或多个范围中的至少一个残基。在一些实施例中，如本文所述的抗pd-1抗体结合pd-1的f43-m50、s51-n54、q55-f62和l108-i114的两个、三个或所有四个范围中的至少一个残基。在一些实施例中，该抗pd-1抗体结合pd-1中的残基，该残基也是pd-l1和pd-l2之一或二者的结合位点的一部分。在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述抗体分子、其载体和宿主细胞中的任一项。还提供了编码任何前述抗体分子的抗体重链可变区或轻链可变区或两者的分离的核酸。在一个实施例中，分离的核酸编码重链cdr1-3，其中所述核酸包含seqidno:108-112、223、122-126、133-137或144-146的核苷酸序列。在另一个实施例中，分离的核酸编码轻链cdr1-3，其中所述核酸包含seqidno:113-120、127-132或138-143的核苷酸序列。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与seqidno:39、51、83、87、90、95或101中的任一项具有至少85％同一性。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含seqidno:39、51、83、87、90、95或101中的任一项。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与seqidno:41、53、85、89、92、96或103中的任一项具有至少85％同一性。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含seqidno:41、53、85、89、92、96或103中的任一项。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与seqidno:45、49、57、61、65、69、73、77、81、94、98、100、105或107中的任一项具有至少85％同一性。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含seqidno:45、49、57、61、65、69、73、77、81、94、98、100、105或107中的任一项。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与seqidno:45、49、57、61、65、69、73、77、81、94、98、100、105或107中的任一项具有至少85％同一性。在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含seqidno:45、49、57、61、65、69、73、77、81、94、98、100、105或107中的任一项。在某些实施例中，提供了包含前述核酸的一种或多种表达载体和宿主细胞。还提供了产生抗体分子或其片段的方法，该方法包括在适于基因表达的条件下培养如本文所述的宿主细胞。在一个方面，本发明的特征在于提供本文所述的抗体分子的方法。该方法包括：提供pd-1抗原(例如包含至少一部分pd-1表位的抗原)；获得特异性结合pd-1多肽的抗体分子；并评估该抗体分子是否特异性结合pd-1多肽，或评估该抗体分子调节(例如抑制)pd-1活性的功效。该方法可以进一步包括将该抗体分子向受试者(例如人或非人动物)给予。在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂和至少一种治疗剂(例如本文所述的抗pd-1抗体分子)。在一个实施例中，该组合物(例如药物组合物)包括抗体分子和一种或多种试剂(例如，如本文所述的治疗剂或其他抗体分子)的组合。在一个实施例中，将该抗体分子与标记物或治疗剂缀合。在某些实施例中，本文所述的组合物包含pd-1抑制剂，该抑制剂选自spartalizumab(pdr001，诺华公司(novartis))、纳武单抗(百时美施贵宝公司(bristol-myerssquibb))、派姆单抗(默克公司(merck&co))、匹地利珠单抗(curetech公司)、medi0680(米迪缪尼有限公司(medimmune))、regn2810(再生元公司(regeneron))、tsr-042(tesaro)、pf-06801591(辉瑞公司(pfizer))、bgb-a317(百济神州公司(beigene))、bgb-108(百济神州公司(beigene))、incshr1210(因赛特公司(incyte))、或amp-224(amplimmune公司)。药物组合物和套件在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包括与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的抗体分子。如本文所用的，“药学上可接受的运载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。载体可适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。本发明的组合物可以呈多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)，分散体或悬浮液，脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗应用。典型的优选组合物呈可注射或可输注溶液的形式。优选的给药方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)给予。在优选的实施例中，抗体通过静脉内输注或注射给予。在另一个优选的实施例中，抗体通过肌肉内或皮下注射给予。如本文所用的短语“肠胃外给予(parenteraladministration和administeredparenterally)”意指除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。治疗组合物在制造和贮藏条件下典型地应该是无菌和稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳、分散体、脂质体、或适合于高抗体浓度的其他有序结构。可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将活性化合物(即抗体或抗体部分)以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。总体上，通过将有效化合物掺入无菌媒介物来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所希望的成分。可以例如通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的溶液流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的吸收延长。抗体分子可以通过本领域已知的多种方法给予，但是对于许多治疗应用，优选的给予途径/方式是静脉内注射或输注。例如，抗体分子可以通过静脉内输注以超过20mg/min，例如20mg/min-40mg/min，并且典型地大于或等于40mg/min的速率给予，以达到约35mg/m2至440mg/m2，典型地约70mg/m2至310mg/m2并且更典型地约110mg/m2至130mg/m2的剂量。在实施例中，抗体分子可以通过静脉内输注以小于10mg/min的速率给予；优选小于或等于5mg/min，以达到约1mg/m2至100mg/m2，优选约5mg/m2至50mg/m2，约7mg/m2至25mg/m2并且更优选约10mg/m2的剂量。如本领域技术人员将理解的，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。在某些实施例中，活性化合物可与将保护该化合物避免快速释放的载体一起制备，如控释配制品，包括植入物、经皮贴片和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、以及聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法是获得专利权的或是本领域的技术人员通常已知的。参见例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems[缓控释药物递送系统],j.r.robinson编辑,马塞尔穧德克尔公司(marceldekker,inc.),纽约,1978。在某些实施例中，抗体分子可以口服给予，例如，与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起。化合物(和其他成分，如果希望的话)也可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗给药，化合物可与赋形剂混合并以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。为了通过除肠胃外给药以外的其他方式给予本发明化合物，可能需要用材料包被该化合物或将该化合物与材料共同给予以防止其失活。治疗组合物还可以用本领域已知的医疗装置给予。调节剂量方案以提供最佳的希望响应(例如，治疗响应)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以给予单次推注，可以随着时间的过去给予若干个分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便给药和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所希望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格是通过以下指定并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和有待实现的具体治疗效果，以及(b)在混配这种活性化合物用于治疗个体的敏感性的领域中的固有限制。治疗或预防有效量的抗体分子的示例性、非限制性范围是0.1mg/kg-30mg/kg，更优选1mg/kg-25mg/kg。抗pd-1抗体的剂量和治疗方案可由技术人员确定。在某些实施例中，将该抗pd-1抗体分子通过注射(例如皮下或静脉内)以约1mg/kg至40mg/kg，例如1mg/kg至30mg/kg，例如约5mg/kg至25mg/kg、约10mg/kg至20mg/kg、约1至5mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、15mg/kg至25mg/kg、或约3mg/kg的剂量给予。该给药日程表可以从例如每周一次至每2、3、或4周一次变化。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约10mg/kg至20mg/kg的剂量给予，每两周一次。作为另一个实例，治疗或预防有效量的抗体分子的示例性、非限制性范围是200mg-500mg，更优选300mg/kg-400mg/kg。抗pd-1抗体的剂量和治疗方案可由技术人员确定。在某些实施例中，将该抗pd-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约300mg、或约400mg的剂量(例如固定剂量)给予。该给药日程表(例如，固定剂量给药日程表)可以从例如每周一次到每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗pd-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每三周一次。虽然不希望受理论束缚，但在一些实施例中，平或固定剂量可以对患者有益，例如，以节省药物供应和减少药房错误。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子的清除率(cl)为从约6ml/h至16ml/h，例如约7ml/h至15ml/h，约8ml/h至14ml/h，约9ml/h至12ml/h，或约10ml/h至11ml/h，例如约8.9ml/h、10.9ml/h、或13.2ml/h。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子的cl重量指数为从约0.4至0.7，约0.5至0.6，或0.7或更小，例如0.6或更小，或约0.54。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子的稳态分布体积(vss)为从约5v至10v，例如约6v至9v、约7v至8v或约6.5v至7.5v，例如约7.2v。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子的半衰期为从约10天至30天，例如约15天至25天、约17天至22天、约19天至24天、或约18天至22天，例如约20天。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子的cmin(例如针对80kg患者)为至少约0.4μg/ml，例如至少约3.6μg/ml，例如从约20μg/ml至50μg/ml，例如约22μg/ml至42μg/ml、约26μg/ml至47μg/ml、约22μg/ml至26μg/ml、约42μg/ml至47μg/ml、约25μg/ml至35μg/ml、约32μg/ml至38μg/ml，例如约31μg/ml或约35μg/ml。在一个实施例中，在以约400mg的剂量(每四周一次)接受抗pd-1抗体分子的患者中测定cmin。在另一个实施例中，在以约300mg的剂量(每三周一次)接受抗pd-1抗体分子的患者中测定cmin。在某些实施例中，与抗pd-1抗体分子的ec50相比，cmin高至少约50倍，例如至少约60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、或100倍，例如至少高约77倍，例如如基于seb离体测定中的il-2变化所确定的。在其他实施例中，与抗pd-1抗体分子的ec90相比，cmin高至少5倍，例如至少6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍，例如至少高约8.6倍，例如如基于seb离体测定中的il-2变化所确定的。该抗体分子可以通过静脉内输注以超过20mg/min，例如20mg/min-40mg/min，并且典型地大于或等于40mg/min的速率给予，以达到约35mg/m2至440mg/m2，典型地约70mg/m2至310mg/m2，并且更典型地约110mg/m2至130mg/m2的剂量。在实施例中，约110mg/m2至130mg/m2的输注速率达到约3mg/kg的水平。在其他实施例中，该抗体分子可以以小于10mg/min，例如小于或等于5mg/min的速率通过静脉输注给予以达到约1mg/m2至100mg/m2，例如约5mg/m2至50mg/m2、约7mg/m2至25mg/m2，或约10mg/m2的剂量。在一些实施例中，该抗体在约30min的时间内输注。应注意，剂量值可随待缓解的病症的类型和严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和给予或监督组合物给予的人的专业判断随时间调整特定剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指以必要的剂量和在必要的时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量的经修饰抗体或抗体片段可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及抗体或抗体部分在个体中引发所希望响应的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过经修饰抗体或抗体片段的任何毒性或有害作用的量。“治疗有效剂量”优选抑制可测量的参数，例如相对于未治疗的受试者，肿瘤生长速率抑制至少约20％，更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％，并且仍更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制可测量参数(例如癌症)的能力。可替代地，组合物的这种性质可以通过检查化合物抑制的能力来评估，这种抑制在体外通过本领域技术人员已知的测定进行。“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的预防结果的有效的量。典型地，因为预防的剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以这种预防有效量将小于治疗有效量。包含本文所述抗体分子的套件也在本发明的范围内。该套件可包括一种或多种其他要素，包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物、治疗剂、或用于螯合或以其他方式偶联抗体与标记物或治疗剂或辐射防护组合物的试剂；用于制备用于给予的抗体的装置或其他材料；药学上可接受的载体；和用于对受试者给予的装置或其他材料。组合疗法的另外的用途组合，例如本文公开的抗pd-1抗体分子，具有体外和体内诊断、以及治疗和预防用途。例如，可以将这些分子向在体外或离体培养的细胞或者人类受试者给予，以治疗、预防和/或诊断多种障碍，如癌症和感染性障碍。因此，在一个方面，本发明提供了修饰受试者中免疫响应的方法，该方法包括向该受试者给予本文所述的组合，从而修饰该受试者中的免疫响应。在一个实施例中，免疫响应被增强、刺激或上调。如本文所用，术语“受试者”是具有以pd-1功能异常为特征的障碍或病症的人类患者。贯穿在本申请的全文中，如果说明书的文本与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。表1.鼠、嵌合和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。所述抗体分子包括鼠mabbap049，嵌合mabbap049-chi和bap049-chi-y，以及人源化mabbap049-hum01至bap049-hum16和bap049-克隆-a至bap049-克隆-e。显示了重链和轻链cdr、重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。表2.人源化mabbap049-hum01至bap049-hum16和bap049-克隆-a至bap049-克隆-e的重链和轻链框架区的氨基酸和核苷酸序列表3.人igg重链和人κ轻链的恒定区氨基酸序列表4.人源化mabbap049-克隆-a至bap049-克隆-e的重链和轻链前导序列的氨基酸序列实例以下实例用于帮助理解本发明，但并不旨在且也不应解释为以任何方式限制其范围。实例1：抗pd-1抗体分子的固定剂量给药日程表基于药代动力学(pk)建模，预期利用固定剂量以适当的cmin浓度提供对患者的暴露。超过99.5％的患者将高于ec50，并且超过93％的患者将高于ec90。示例性抗pd-1抗体分子(使用300mg，每三周一次(q3w)或400mg，每四周一次(q4w))的预测稳态平均cmin预期平均高于20ug/ml(最高体重，150kg)。表5.基于固定剂量给药日程表的示例性pk参数用任一剂量/方案(300mgq3w或400mgq4w)观察到的示例性抗pd-1抗体分子的预期平均稳态cmin浓度将比ec50(0.42ug/ml)高至少77倍并比ec90高约8.6倍。离体效力基于seb离体测定中的il-2变化。对于300mgq3w或400mgq4w，预期不到10％的患者达到cmin浓度低于3.6ug/ml。对于300mgq3w或400mgq4w，预期不到0.5％的患者达到cmin浓度低于0.4ug/ml。图12显示了在接受相同剂量的示例性抗pd-1抗体分子时针对不同重量患者的预测c谷(cmin)浓度。将基于体重的给药与固定剂量进行比较(3.75mg/kgq3w对比300mgq3w和5mg/kgq4w对比400mgq4w)。图12支持示例性抗pd-1抗体分子的固定剂量给药。进一步验证pk模型。如图13所示，观察到的对比模型预测的浓度位于一致的线上。图14显示该模型捕获累积、时间进程和受试者内变异性。实例2：hdm201的剂量和给药方案此实例提供了临床安全性和药代动力学(pk)数据的总结，其支持本发明的单一药剂hdm201针对1期试验chdm201x2101中的患有实体瘤的患者的剂量和方案。本文中，披露的数据来自此多中心、开放标签、首次在人中进行的、患有tp53野生型(wt)晚期实体瘤的患者中的hdm201i期研究，在标准疗法或尚无标准治疗方案方面取得进展(nct02143635)。发现优选的是在4w(周)周期的d1(第一天)和d8(第八天)给出120mghdm201(方案1b)。这些数据来自单一疗法试验，其中数据截止日期为2016年9月19日。该研究的i期部分的主要目标是确定最大耐受剂量(mtd)和/或鉴定hdm201的优选剂量。此研究设计允许平行探索hdm201跨实体恶性肿瘤的两种广泛剂量策略的安全性、耐受性和临床活性：间歇性高剂量方案(方案1a和1b)和延长的低剂量方案(方案2a和2c)。表ex2.1总结了在实体瘤患者中评估的每个类别的给药方案。表ex2.2提供了本研究中涉及的患者的基线特征。主要目标的终点是在第一个治疗周期期间剂量限制毒性(dlt)的发生。尽管主要分析基于dlt率估计mtd，但最终优选的剂量确定利用超出周期1dlt率的另外的数据(包括后期循环耐受性、pk、pd和抗肿瘤活性)。表ex2.1：在实体瘤组中评估的hdm201剂量方案和剂量水平患者群体参与本研究的患者特征在于以下表征：年龄≥18岁患有局部晚期或转移性实体恶性肿瘤的患者，这些患者尽管已接受标准疗法但肿瘤仍然进展，或对于这些患者尚不存在有效的标准疗法自筛选前不超过36个月采集的肿瘤活检中获得的肿瘤，其具有记录的tp53wt状态(最低限度是外显子5-8中没有突变)依据实体瘤响应评估标准(recist)v1.1可测量或不可测量(但可评估)的疾病东部肿瘤协作组(easterncooperativeoncologygroup，ecog)体能状态≤2先前没有用抑制p53-hdm2相互作用的化合物(例如rg7388或nvp-cgm097)治疗在研究治疗前≤2周，没有用靶向骨髓谱系的生长因子(例如g-csf)治疗绝对中性粒细胞计数>1,500/μl、血小板计数>100,000/μl、血红蛋白>9.0g/dl表ex2.2提供了本研究中涉及的患者的基线特征。表ex2.2：基线特征(fas)*who/ecogps：东部肿瘤协作组/世界卫生组织的体能状态统计学分析采用控制过量用药的剂量递增(ewoc)原则，由贝叶斯逻辑回归模型(blrm)指导剂量递增决策。决策基于从研究中评估的所有剂量水平和方案可得的数据的综合，这些数据包括剂量限制毒性、在第一治疗周期内所有常见不良反应事件评价标准(ctcae)等级≥2毒性数据、以及来自可评估患者的药代动力学和药效学数据。对于剂量递增和方案选择，还考虑了周期2血液学毒性。剂量/方案理由在用单一药剂hdm201在实体瘤中评估的4种给药方案中，发现间歇性高剂量方案1b(4w周期的d1和d8)具有最有利的治疗指数。在所有测试剂量下，在此方案中3/4级血小板减少最低，并且在选择的120mg的rde治疗的患者中未发生(见表ex2.3-1)。最常见的非血液学毒性是胃肠道，但在4种方案中评估的任何剂量水平都没有剂量限制。药代动力学数据表明，基于临床前数据的pk/pd建模，方案1b的120mg剂量水平实现了治疗相关暴露，并且通过观察以此剂量治疗的患者的临床功效得到进一步支持(1名患者具有长持续时间pr、1名患者具有未经证实的pr、并且1名患者具有sd)。120mg剂量也在由支持剂量递增的贝叶斯逻辑回归模型(blrm)推荐的有利剂量范围内。因此，120mg剂量的方案1b被认为是最优选的剂量和方案。详细的临床总结在数据截止时(2016年9月19日)，85名患有实体瘤的患者在评估的4种给药方案中用hdm201治疗(参见表ex2.1)。在评估的所有方案中，剂量限制毒性主要与骨髓抑制有关。在所有剂量限制性血细胞减少中，在方案中最常见3/4级中性粒细胞减少和血小板减少(表ex2.3)。因此，4种方案中，3/4级血细胞减少(最重要的是血小板减少)的对比发生率是告知选择方案和剂量扩大的关键因素。发现在研究期间，hdm201诱导的骨髓抑制可以延迟发作(超过周期1)。因此，在研究过程中，使用非结合敏感性模型，在周期2中发生的剂量限制性血液学毒性也被考虑到剂量递增决策中。表ex2.4总结了在实体瘤中评估的所有方案中的周期1期间的剂量限制毒性和周期2中剂量限制血液学毒性的数量。间歇性高剂量方案1a和延长的低剂量方案2a首先在剂量递增中进行评估。两种方案在实现预测的治疗相关暴露的剂量水平下均具有不利的dlt率和延迟的血液学毒性。因此，开展了探索另外两种治疗方案的群组：间歇性高剂量方案1b和延长的低剂量方案2c。在方案2c中，在如下剂量水平观察dlt，在该剂量水平下暴露低于基于pk/pd建模预测为有效的暴露。根据方案1b以3种不同剂量水平(120mg、150mg和200mg)治疗了20名患者。疑似归因于方案1b中的研究治疗而报告的最常见的ae(所有等级)是恶心(12名患者，60.0％)、血小板减少/血小板计数减少(9名患者，45.0％)、中性粒细胞减少/中性粒细胞计数减少(8名患者，40.0％)和呕吐(5名患者，25.0％)。此组中的9名患者(45.0％)经历了至少一个怀疑与治疗相关的ctcae3/4级ae。认为疑似归因于研究治疗的三种最常见的ctcae3/4级ae是：中性粒细胞减少/中性粒细胞计数减少(6名患者，30.0％)、脂肪酶增加(3名患者，15％)和血小板减少/血小板计数减少(2名患者，10.0％)。在以150mg剂量治疗的一名患者中观察到符合dlt标准的一例长期中性粒细胞减少(在第22天开始且持续18天)。更多详细信息，参见表ex2.5。在评估的4种方案中，方案1b具有3/4级血小板减少的最低总发生率(表ex2.3)。在120mg的优选的剂量(方案1b)时，没有3/4级血小板减少ae的病例(参见表ex2.3-1)。在此剂量水平，没有由于血小板减少引起的剂量打断或中断，并且没有患者需要血小板输注。所有方案中3/4级中性粒细胞减少的发生率相似，并且在120mg剂量水平的9名患者中的2名中观察到。在此剂量水平下没有非血液学剂量限制毒性或3/4级ae。重要的是，在120mg(方案1b)的优选剂量下观察到有意义的临床活性。在以此剂量治疗的9名患者中，患有软组织肉瘤的患者中存在1个pr(持续18周并且在截止日期仍然进行中)，在患有脂肪肉瘤的患者中存在1个未经证实的pr和1个sd(持续8周)，表明在此剂量和日程表下实现治疗相关的暴露。表ex2.3：疑似与研究药物相关的所有血细胞减少不良事件-实体瘤表ex2.4：实体肿瘤中的治疗周期1dlt和周期2血液学剂量限制毒性表ex2.5：怀疑与研究药物相关的所有等级和3/4级不良事件，依据优选项和治疗-实体瘤-方案1b安全性通常在周期2期间发生的剂量限制毒性是中性粒细胞减少和血小板减少。研究药物相关的所有等级不良事件(ae；在≥10％的所有患者中发生)显示在表ex2.6中。表ex2.6：疑似与研究药物相关的不良事件，依据组合治疗方案(所有等级，在≥10％中发生)最常见的非血液学毒性是胃肠道，但在4种方案中评估的任何剂量水平都没有剂量限制；最常见的所有等级的胃肠道ae都是恶心(44/85；52％)，其严重程度大多为轻度至中度。研究药物相关的特别关注的3/4级ae显示在表ex2.3中。对于所有治疗方案，观察到疑似与研究药物相关的3/4级血液学毒性，发生在高达约35％的患者中。方案1b中3/4级血小板减少最低。临床pk在整个剂量递增过程中评估了药代动力学数据。在研究过程中已经评估了两种hdm201药物变体(详情参见试验方案)。非隔室pk分析显示在剂量范围内(2至350mg)达到最大血浆浓度的中值时间范围为从2.0至5.8h。初步剂量比例评估显示在所研究的剂量范围内近似的剂量比例pk(auc最后和cmax)。对于大多数剂量群组，auc最后和cmax的患者间变异性(cv％几何平均值)是低至中等(6％至58.5％)。此外，使用群体方法对所有可用的hdm201浓度进行综合分析。hdm201的pk最好用1室pk模型描述，该模型具有延迟的零级和一级吸收过程、以及线性清除。体重被鉴定为表观中心分布容积(vc/f)的统计学显著的协变量，其中vc/f随着体重的增加而增加。为了进一步支持hdm201的优选剂量，使用区室pk建模来估计以方案1b以120mg治疗的9名患者的每个周期的个体平均浓度(图15)。对于大多数患者(9个中的7个)，每个周期估计的平均药物浓度接近或高于从临床前数据的pkpd建模(人sjsa-1异种移植大鼠模型)确定的每个周期约等于41ng/ml的最保守平均肿瘤停滞浓度。治疗方案1a(12.5-350mg)的单剂量(第1天)后nvp-hdm201的代表性几何平均血浆浓度-时间曲线示于图16中口服吸收很快(中值tmax2-5.8小时)，并且不因剂量组(2-350mg)而变化平均血浆暴露(auc最后和cmax)随剂量增加而增加，单剂量和重复剂量后剂量比例无重大偏差nvp-hdm201稳态通常在第8天达到，其中每日给药后积累有限第1天单剂量(50-350mg)后评估的中值半衰期范围为13.7至23.1h暴露期间的患者间差异(cv％几何平均值)通常是低至中等。使用nvp-hdm201的区室群体pk建模来估计周期1的个体平均血浆浓度，并且允许与通过pk/pd肿瘤生长建模得到的肿瘤停滞的临床前平均浓度进行比较。结果示于图17中。与方案2a/2c相比，用方案1a/1b达到的平均血浆浓度更接近95％肿瘤消退(图18中的上虚线)所要求的预期的临床前目标有效水平(125ng/ml)，并且接近或高于对于从人sjsa-1异种移植物大鼠模型的pk/pd建模确定的约等于41ng/ml(虚线)的最保守的平均肿瘤停滞浓度的估计的平均浓度(图17)。浓度约等于19ng/ml的虚线代表由来自脂肪肉瘤(hsax2655)患者来源的异种移植物大鼠模型的临床前数据的pk/pd建模确定的平均肿瘤停滞。浓度为29.4ng/ml的虚线代表由sjsa-1细胞系中的细胞活性确定的ic50值。统计学分析此研究利用贝叶斯逻辑回归模型(blrm)来支持剂量递增并评估mtd和/或确定hdm201的优选剂量。采用控制过量用药的剂量递增(ewoc)原则，blrm使得能够结合可用的先前信息并基于关于在临床研究中看到的观察到的剂量限制毒性(dlt)的新信息更新模型参数。在方案1a和1b的剂量递增过程中，dlt发生率已被用于更新模型并支持下一剂量的决策。当在研究过程中，很明显hdm201诱导的骨髓毒性主要发生在周期2时，使用包括周期1dlt和周期2血液学剂量限制性ae(均衡加权所有血细胞减少)的非结合敏感性模型用于指导剂量递增/rde确定。此外，决策始终基于研究中评估的所有剂量水平的可用相关数据的综合，这些数据包括来自可评估患者的低级别毒性、pk和pd数据(如果可获得)。使用来自用方案1b(剂量水平120mg、150mg和200mg)治疗的患者的周期1dlt事件数据，blrm的结果支持递增至400mghdm201。依据方案分析和敏感性分析，120mg的中值dlt率分别为3.5％和25.7％。因此，考虑到在此剂量下观察到的临床相关的3/4级血小板减少、可控的中性粒细胞减少、和有意义的临床活性的较低发生率，发现120mg是优选剂量。功效在数据截止时，2/46(4％)接受高剂量间歇方案的患者实现pr(患有sts-内膜肉瘤的1名患者接受方案1a；患有sts-血管外皮细胞瘤的1名患者接受方案1b)(表ex2.7)。接受高剂量间歇性方案的15/46(33％)患者和接受低剂量延长的方案的14/39(36％)患者实现sd(表ex2.7)。虽然在所有给药方案中观察到有意义的疾病控制(dcr：34％)，但仅在方案1a和1b中观察到pr，这表明高剂量间歇方案更有效。到2017年9月，观察到肉瘤(脂肪肉瘤和其他肉瘤)患者中的强的抗肿瘤功效。根据方案1b，在用hdm201治疗的21名肉瘤患者中，5名患者显示部分响应(pr)、并且11名患者显示疾病稳定(sd)。该疾病仅在5名患者中进展(pd)(参见图20)。表ex2.7：最佳总体响应(fas)(2016年11月)bor：最佳总体响应；ci，置信区间；cr：完全响应；dcr：疾病控制率(cr或pr或sd)；fas：全分析集；orr：总体响应率(cr或pr)；pd：进行性疾病；pr：确认的部分响应；sd：疾病稳定；bor基于研究者使用recist1.1评估疾病状态；cr和pr通过在首次满足响应标准后不少于4周进行的重复评估来确认。使用精确(clopper-pearson)区间计算95％ci。在低剂量延长的方案2a和2c中，在32周的治疗结束时，具有至少稳定疾病或更好的患者的中值相对剂量强度(rdi)是相似的。在2种高剂量间歇方案中，方案1b具有更有利的rdi，这支持其在治疗相关剂量下的总体更好的耐受性(表ex2.8)。表ex2.8在32周的治疗结束时具有至少稳定疾病的患者的相对剂量强度总结(sas)sas，安全性分析集。n＝治疗的患者总数，仅包括相应治疗方案中的治疗组：方案1a：≥100mg；方案1b：≥120mg；方案2a：≥7.5mg；方案2c：≥15mgn＝具有至少一个sd或pr或cr的患者的数量、或因pd以外的原因而停止治疗的患者。血小板减少的pk/pd模型基于随时间的个体pk和血小板计数数据，建立pk/pd模型。pk模型：1个区室，具有双相吸收。pd模型：调节的弗里贝里(friberg)模型，用于血小板减少，包括plt输注和hdm201对增殖细胞和调节的影响。数据库：n＝73个受试者1301pk观察1023pd血小板观察427pdgdf15观察图18中所示的血小板动力学曲线基于在每个方案中测试的以下剂量建模(在图18中从上到下依序)：reg2c(d1-7q4wk)：25mg((25mgx7个给药日)/28天周期＝6.25mg/天)reg2a(d1-14q4wk)：20mg((20mgx14个给药日)/28天周期＝10mg/天)reg1b(q4wk，第1、8天)：150mg((150mgx2个给药日)/28天周期＝10.7mg/天)reg1a(d1q3wk)：350mg((350mgx1个给药日)/21天周期＝16.7mg/天)基于此建模，1b具有已证明单一药剂活性的方案的最佳总血小板动力学曲线。在临床研究中用方案1b150mg，仅在100天后发生首次出现的g4血小板减少。将艾曲波帕添加至1b可以减轻相关延迟并降低随后周期的血小板恢复的峰值。实例3：pd-1抑制剂与hdm2抑制剂hdm201组合的临床前研究在此实例中，证实了mdm2抑制剂nvp-hdm201(hdm201)对结肠26结肠直肠腺癌(crc)同系小鼠模型中的免疫调节的影响。使用多色facs分析，观察到hdm201在早期时间点(治疗后第5天)增加肿瘤中cd103+cd11+树突细胞(dc)的数量，这反映了dc抗原交叉呈递的激活。hdm201也增加了肿瘤以及肿瘤引流淋巴结中tbet+eomes-cd8+t细胞的百分比；这表明t细胞被dc引发。在稍后的时间点(治疗后第12天)，肿瘤中观察到增加的cd8/treg比，表明有效的免疫响应的诱导。此外，hdm201诱导的免疫抑制蛋白(如在cd45-细胞上的程序性死亡配体1(pd-l1)和在cd45+t细胞中的程序性死亡-1(pd1))的上调。在结肠26crc同系小鼠模型中评估hdm201作为单一疗法或与抗pd1抗体组合的抗肿瘤作用。40mg/kg的hdm201抑制肿瘤生长，而用抗pd1抗体添加pd-1阻断导致协同且持久的肿瘤消退。与单独治疗(无cr)相比，组合组(10个cr中的5个)的完全肿瘤消退率(cr)显著增加。组合臂中这种稳健的抗肿瘤活性与hdm201的免疫调节一致，其中实现cr的小鼠也产生针对结肠26细胞而非4t1细胞的长效特异性记忆。总之，这些数据表明mdm2抑制似乎调节肿瘤中的树突细胞功能、t细胞引发、和cd8/treg比，这导致肿瘤生长抑制；与抗pd1抗体的组合进一步从免疫抑制状态释放t细胞，并显著改善抗肿瘤响应。这些数据支持在临床中探索这种组合。为了研究hdm201的免疫调节作用，使用结肠26鼠crc模型(基于其野生型p53状态进行选择)。我们的假设是抑制mdm2/p53相互作用将上调肿瘤细胞中的pdl1和淋巴细胞中的pd1，而阻断pd1/pdl1相互作用将加强hdm201的抗肿瘤作用。材料和方法材料动物和维持条件对于所有实验，将动物在12小时(h)光/暗循环设施中饲养并使其可随意获得食物和水。动物特征总结在表ex3.1中。表ex3.1动物特征关于动物福利的声明在实验之前允许动物在诺华公司(novartis)nibr动物设施中适应至少3天。根据诺华公司(novartis)iacuc法规和指南处理动物。细胞和细胞培养条件同系肿瘤模型是小鼠衍生的肿瘤细胞系，将该细胞系植入肿瘤起源的同一小鼠品系的动物中。这允许使用免疫感受态动物，这对于测试靶向这些研究中使用的免疫细胞的抗体是重要的。结肠26是由n-亚硝基-n-甲基尿烷(griswolddp和corbettth；acolontumormodelforanticanceragentevaluationcancer[用于抗癌剂评估癌症的结肠肿瘤模型]36:2441-2444,1975)诱导的balb/c小鼠结肠癌细胞系。4t1是来自balb/c小鼠的自发性发展的乳腺肿瘤(aslaksoncj,millerfr.selectiveeventsinthemetastaticprocessdefinedbyanalysisofthesequentialdisseminationofsubpopulationsofamousemammarytumor.[通过分析小鼠乳腺肿瘤亚群的连续传播来定义转移过程中的选择性事件]cancerres.[癌症研究]52:1399-1405,1992)。结肠26细胞获得自诺华研究基金会(novartisresearchfoundation)的基因组研究所(genomicsinstitute)。4t1细胞购自atcc。两种细胞系的原种均由cle(细胞系百科全书(celllineencyclopedia))产生。将结肠26和4t1细胞在含有10％热灭活的胎牛血清的rpmi1640(不含抗生素)中培养；在impactviiipcr测定组中，这些细胞不含支原体和病毒污染(idexxradil，idexx实验室公司(idexxlaboratoriesinc)，韦斯特布鲁克，me)。化合物配制和抗体将hdm201-bb(琥珀酸)配制在于50mm磷酸盐缓冲液(ph6.8)中的0.5％w/v甲基纤维素(mc)溶液中至4.84mg/ml(4mg/ml游离碱)的最终浓度。盐/游离碱比为1.21。在本周的第一天，以10ml/kg每3h持续三次(3×q3h)通过口服强饲法(po)每周给予(qw)来给予该配制品。当避光时，配制品在4℃稳定3周。抗pd1抗体(克隆29f.1a12，鼠交叉反应性)及其同种型对照(大鼠igg2a)购自生物试剂公司(biolegend)(圣地亚哥，加利福尼亚，美国)。将两种抗体在pbs(gibco，生命技术公司(lifetechnologies))中配制成0.5mg/ml的最终浓度，并以10ml/kg的体积通过腹膜内注射(ip)每周两次(2qw)持续两周给予。方法雌性balb/c小鼠中的结肠26同系肿瘤模型将结肠26细胞在80％-95％汇合时收获、洗涤、并以2×106个细胞/ml的浓度重悬于冷pbs中。最后，将总体积为100μl的0.2×106细胞皮下(sc)植入原初balb/c小鼠的右上腹部。对于8020结肠26-xef研究，当肿瘤体积在细胞植入后第10天达到27-60mm3的范围时，将动物随机化并招募到研究中。所有治疗均在三天后(第13天)开始。对于pd研究，当平均肿瘤体积达到100至120mm3时，将动物随机化。动物监测每天监测动物的健康、行为和总体健康。对任何垂死的动物实施安乐死。研究设计包括治疗组的剂量和方案的研究7628结肠26-xpd、8063结肠26-xpd、和8020结肠26-xef的设计总结于表ex3.2至ex3.4中。在一个或多个给药日对动物称重，并将给药体积调节至体重至10ml/kg。在随机化时记录肿瘤尺寸和体重，并且在研究持续时间后每周收集两次。在每天收集数据后收集以下数据：死亡率、个体和群体平均体重、以及个体和群体平均肿瘤体积。表ex3.27628结肠26-xpd研究的剂量和日程表表ex3.38063结肠26-xpd研究的剂量和日程表表ex3.48020结肠26-xef研究的剂量和日程表流式细胞术分析对于两项研究(7849结肠26-xpd和8063结肠26-xpd)，通过流式细胞术对来自肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行分析。对淋巴结淋巴细胞分析8063结肠26-xpd。将样品铺板到两个单独的96孔板中，一个用于t细胞染色(表ex3.5)并且一个用于髓样细胞染色(表ex3.6)。表ex3.5流式细胞术组(7628结肠26-xpd)组标记克隆荧光团稀释t细胞cd4530-f11bv5101:200t细胞cd11b/cd1970/m1bv7111:200t细胞cd4gk1.5bv4211:200t细胞cd853-6.7bv6501:200t细胞foxp3fjk-16sapc1:100t细胞pd-129f.1a12bv6051:100t细胞pd-l110f.9g2pe.cy71:100t细胞活/死染色ef7801:5000髓样细胞cd4530-f11bv5101:400髓样细胞cd11bm1/70bv7111:200髓样细胞cd11cn418pe1:200髓样细胞ly6chk1.4fitc1:200髓样细胞ly6g1a8pacblue1:200髓样细胞pd-l110f.9g2pe.cy71:100髓样细胞pd-129f.1a12bv6051:100髓样细胞活/死染色ef7801:5000表ex3.6流式细胞术组(8063结肠26-xpd)组标记克隆荧光团稀释t细胞cd4530-f11bv5101:400t细胞cd4gk1.5buv3951:200t细胞cd853-6.7bv6501:200t细胞foxp3fjk16saf4881:100t细胞t-bet4b10bv4211:100t细胞eomesdan11magpe.cy71:100t细胞tim-35d12pe1:200t细胞pd-129f.1a12bv6051:200t细胞pdl110f.9g2bv7111:100t细胞cd11bm1/70buv7371:400t细胞活/死染色ef7801:2000髓样细胞cd4530-f11bv7851:500髓样细胞cd11bm1/70buv7371:1000髓样细胞cd11cn418apc-efluor7801:100髓样细胞f480bm8apc1:100髓样细胞i-a/i-em5/114.15.2bv6501:400髓样细胞ly6chk1.4pecy71:500髓样细胞ly6g1a8buv3951:100髓样细胞cd1032.00e+07efluor4501:100髓样细胞cd86michel-17fitc1:100髓样细胞cd401c10percp-efluor7101:100髓样细胞pdl110f.9g2pe1:100髓样细胞活/死染色黄色1:1000组织处理对于7628结肠26-xpd研究，在治疗开始后第5天和第12天从小鼠收集肿瘤和脾。根据rds-2016-00163产生单细胞悬浮液。简言之，用剪刀剪碎组织，随后使用gentlemax(美天旎公司(miltenyi))在含有rpmi1640(gibco，生命技术公司(lifetechnologies))的解离缓冲液中用liberasetm研究级胶原酶(罗氏公司(roche))和dna酶l重组酶(roche)机械均化。在37℃在水浴中孵育15分钟后，将匀浆用10％fbs淬灭并经70μm细胞过滤器(falcon)过滤。在该过程结束时，获得细胞的单细胞悬浮液，并将200万个细胞铺板到96孔板中用于用抗体的t细胞或骨髓细胞组染色。对于8063结肠26-xpd研究，收集肿瘤和淋巴结，然后根据rds-2017-00141将其机械地和酶促地加工成单细胞悬浮液。消化过程涉及4-5个连续消化循环，每个循环中使用含有dna酶i(罗氏公司(roche))、胶原酶p(罗氏公司(roche))和分散酶(gibco)的新消化缓冲液。在此过程结束时，将细胞悬浮液经70μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬浮液。将200万个细胞铺板到96孔板中用于染色t细胞组或骨髓细胞组抗体。facs染色和数据采集一旦将细胞铺板后，如表ex3.5和ex3.6中所示，用活/死染色对样品进行染色。此后，将样品用1:50稀释的小鼠fc嵌段(美天旎生物技术公司(miltenyibiotec))在冰上阻断30分钟。将样品以1500rpm离心5分钟，然后如表ex3.5和ex3.6中所示用荧光染料缀合的表面抗体混合物染色60分钟。在阻断和染色过程中，细胞维持在4℃并避光。对于t细胞的细胞内染色，在表面染色后，将板再次以1500rpm离心5分钟，然后使用fix/perm套件(e生物科学公司(ebioscience))将细胞固定并透性化过夜。用透性化缓冲液洗涤细胞，然后在4℃在黑暗中用细胞内抗体染色1小时。将板在透化性缓冲液中洗涤两次并悬浮在200μlpbs中。使用lsrfortessatm(bd生物科学公司(bdbiosciences))进行数据采集。数据分析体重将体重变化百分比计算为(bw目前-bwd0)/(bwd0)×100％。数据表示为从初始体重的平均体重百分比变化，其测量值被视为平均值d0±sem。当提及体重时，d0与肿瘤细胞植入后7-10天或治疗开始前1-3天获得的测量值相关。肿瘤体积分别使用以下公式计算百分比治疗/对照(％t/c)和百分比消退(％reg)值：如果δt>0，％t/c＝100×δt/δc如果δt<0，％reg＝100×δt/t初始其中：t＝研究给定日药物治疗组的平均肿瘤体积；δt＝研究给定日药物治疗组的平均肿瘤体积-初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；t初始＝初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；c＝研究最后一天所有媒介物治疗的小鼠对照组的平均肿瘤体积；δc＝对照组在最后一天所有媒介物治疗的小鼠的平均肿瘤体积-对照组在初始给药日的平均肿瘤体积。到达终点的时间进行卡普兰-迈耶(kaplan-meier)存活分析以比较到达终点的时间(tte)的差异。一旦肿瘤体积超过1000mm3，将小鼠评分为达到肿瘤终点并评分为死亡(“1”)。进行对数秩(mantel-cox)存活分析(sigmaplot13.0)。在prism(graphpadv7)中进行到达终点的中值时间的图形分析。流式数据分析使用来自treestar的flowjov10.0.7软件在每次运行后进行分析。对于每个分析，对感兴趣的群体进行门控以使用形态学参数的组合鉴定活白细胞(所有细胞：ssc-a对fsc-a，单细胞：ssc-h对ssc-w；fsc-h对fsc-w)，并使用efluor780(bd生物科学公司(bdbiosciences))或黄色染料(英杰公司(invitrogen))将死细胞排除。将cd45+cd4+和cd45+cd8+标记用于门控t细胞，随后是cd4+foxp3-(t常规)、和cd4+foxp3+(treg)子集。对于新引发的t细胞，门控tbet+eomes-细胞。根据broz和krummel公开的策略(brozml,krummelmf.theemergingunderstandingofmyeloidcellsaspartnersandtargetsintumorrejection[对骨髓细胞作为肿瘤排斥的伴侣和靶的新认识]cancerimmunolres.[癌症免疫研究]2015apr；3(4):313-9)对髓样细胞进行门控。对于cd11b+cd11c+cd103+dc，门控树突细胞(dc)。cd45-特异性标记被用来鉴定包括肿瘤细胞、内皮细胞和成纤维细胞的非淋巴细胞。统计学分析对于流式数据，在sigmaplot13.0中进行非配对t检验和单因素方差分析(anova)。将δ肿瘤体积和百分比体重差用于统计学分析。在组之间，使用anova或克鲁斯卡尔-沃利斯(kruskal-wallis)anova进行比较，然后进行图基(tukey)事后检验。对于到达终点的时间的分析，进行对数秩(mantel-cox)存活分析(sigmaplot13.0)。在prism(graphpadv7)中进行到达终点的中值时间的图形分析。对于所有统计学评估，显著性水平设定为p<0.05。除非另有说明，否则报告与媒介物对照组相比的显著性。结果药效学：免疫谱分析(7628结肠26-xpd和8063结肠26-xpd)相应于表ex3.5和表ex3.6中所示的组，通过流式细胞术进行til的免疫谱分析。在第一次给药后第5天和第12天，对动物实施安乐死。收集肿瘤、肿瘤引流淋巴结和脾，用于til表征。枚举了来自肿瘤和淋巴结的髓样细胞和t细胞区室，并且结果显示在图21和22中。脾细胞主要用于染色对照(数据未显示)。初始免疫谱分析揭示hdm201增加％cd11c+cd45+细胞和cd8t细胞(图3-1)。为了进一步剖析通过hdm201调节的特定细胞类型，我们进行了全面的facs分析。我们发现hdm201增加了％cd103+cd11+dc(其能够实现抗原交叉呈递)；并且增加了新引发的tbet+eomes-cd8+/cd45+t细胞，和cd8/treg比(图22)。此外，hdm201在cd45-细胞中诱导pdl1表达，所述表达表示为在cd45-群(肿瘤细胞、基质细胞或内皮细胞)中的pdl1的平均荧光强度(mfi)；hdm201还增加了％pd1+cd45+细胞(图21)。这些结果表明hdm201诱导针对肿瘤的主动免疫响应；与此同时，它引发了免疫细胞以及肿瘤细胞上免疫抑制蛋白的上调。抗肿瘤活性：将hdm201与结肠26同系异种移植肿瘤模型(8020结肠26-xef)中的apd-1抗体组合在结肠26鼠同系模型(8020结肠26-xef)中研究了hdm201与靶向pd-1/pd-l1轴的apd1抗体的抗肿瘤活性。在细胞植入后第9天，基于肿瘤体积将动物随机分入治疗组。治疗在第12天开始，并且继续每周给予hdm201持续3周、以及给予抗pd1抗体每周两次持续2周。动物保留在研究中直至各自达到个体终点(由肿瘤体积>1000mm3定义)。使用卡普兰-迈耶分析(graphpadv7.0)将肿瘤生长延迟评估为到达终点的中值时间。耐受性监测动物体重并报告为相对于治疗前(肿瘤植入后第9天)体重的百分比变化。所有治疗均耐受良好，因为在所有组中观察到体重增加(图23)。肿瘤植入后第23天是所有动物保留在研究中的最后一天，因此用于此分析。抗肿瘤活性使用如通过卡普兰-迈耶分析(对数秩)分析确定的到达终点的中值时间(tv≥1000mm3)来评估治疗介导的肿瘤生长延迟。如表ex3.7所示，分别地，与媒介物对照相比，作为单一疗法的hdm201倾向于增加到达终点的时间，其到达终点的中值时间分别为31.5天，与23天相比。相反，阻断pd1导致到达终点的时间为23天，这与媒介物组相同。hdm201与apd1抗体的组合显著延长了到达终点的时间至第84天(p<0.05)(表ex3.7，图24)。表ex3.7卡普兰-迈耶到达终点的时间(8020结肠26-xef)每个治疗组的个体动物肿瘤体积显示在图25中。在媒介物处理组中的所有动物中观察到肿瘤生长，到第30天均达到终点。作为单一疗法的hdm201诱导1/10动物具有部分响应(图25)；单一疗法抗pd-1抗体(克隆#29f.1a12)也导致1/10动物表现出部分响应(图25)。相反，抗pd-1抗体和hdm201的组合导致2/10动物表现出部分响应、以及5/10表现出完全响应(图25)。hdm201促进持久的肿瘤特异性免疫响应鉴于用hdm201观察到的免疫调节活性及其与检查点阻断抗体组合的能力，探讨了产生的抗肿瘤响应的持久性和特异性。为了探究抗肿瘤响应是否是抗原特异性的，将应答小鼠在左侧腹部用结肠26再次攻击。达到完全响应的那些动物再次受到攻击(在第一次细胞植入后第123天)，在侧翼的对面有20万个结肠26细胞，由此所有小鼠拒绝第二次注射结肠26细胞，而原初小鼠发展肿瘤(图26)。相反，当用4t1细胞再次攻击时(在第182天)，所有小鼠都发展肿瘤(类似于原始小鼠)，这证明记忆对结肠26细胞是特异性的(图26)。为了进一步探讨hdm201治疗是否诱导抗肿瘤记忆t细胞响应的发展，在体外用ct26相关的抗原ah1(gp70423-431)肽(huang等人1996)分离并刺激来自应答小鼠的脾细胞，并且经由elispot测定计算产生ifn-γ的细胞的数量。如图27所示，在所有应答者中检测到t细胞对ifn-γ的抗原特异性产生。与此一致，我们观察到用hdm201或hdm201与抗pd1抗体的组合处理的小鼠脾中ah1特异性cd8+t细胞诱导响应者的频率的增加，如用h2ld-ah1dextramer检测的。(图28和29)。总之，这些数据表明用hdm201治疗促进了持久性肿瘤特异性记忆t细胞响应的发展。p53敲除结肠26克隆的体外表征p53敲除结肠26克隆在1μmhdm201存在下生长，并通过蛋白质印迹筛选p53表达，使用抗p53抗体(细胞信号传导公司(cellsignaling)cst#2524)加载40μg总蛋白质/样品。鉴定p53阴性克隆，在没有hdm201的情况下生长4天，然后用1μmhdm201再次处理24小时，以及鉴定结肠26亲代细胞，以监测p53通路的响应。通过蛋白质印迹监测p53和p21变化，并使用84基因qpcr阵列另外确认通路活性(rt2profilerpcr阵列p53通路，目录号330231pamm-027zaqiagen)。还提交了选择克隆，用于rnaseq分析。使用这种p53ko结肠26模型，显示hdm201不能抑制肿瘤生长(图30)。当pd-1/pd-l1轴被阻断时没有观察到另外的益处(图30)。总之，此数据证明了hdm201的抗肿瘤活性的特异性，因为仅在p53野生型肿瘤中观察到其有益反应。结论p53是转录因子，通过细胞周期停滞或诱导细胞凋亡在保护细胞的基因组稳定性中发挥核心作用。还报道了p53参与肿瘤免疫的调节和免疫响应的稳态调节。本文中，证明了hdm201对肿瘤以及肿瘤引流淋巴结中的免疫细胞有影响。具体而言，hdm201增加肿瘤和引流淋巴结中的抗原呈递细胞(dc)。据推测，dc将肿瘤抗原呈递给原初t细胞，这导致肿瘤以及肿瘤引流淋巴结中新引发的t细胞数量增加。这些t细胞迁移到肿瘤部位，并识别待被激活的肿瘤抗原。最终，在肿瘤中观察到增加的cd8/treg比。cd8t细胞是识别肿瘤细胞并诱导肿瘤细胞杀伤的活性效应细胞。此外，观察到与hdm201和apdl1抗体作为单一疗法相比，cd45-群体中的pdl1上调，并且hdm201与抗pd1抗体的组合显著增强抗肿瘤响应。这些结果表明mdm2抑制引发适应性免疫，其通过阻断p53野生型肿瘤模型中的pd-1/pd-l1通路而进一步增强，从而提供了将癌症患者中的mdm2抑制剂和检查点阻断抗体与野生型p53组合的基本原理。实例4：pd-1抑制剂pdr001(bap049-克隆e，spartalizumab)与hdm2抑制剂hdm201组合的临床研究临床试验cpdr001x2102，eudract号：2016-000654-35ib期、开放标签、多中心研究以表征与(特别是)hdm201组合的pdr001的安全性、耐受性和药效学(pd)基本原理最近开发的增强抗肿瘤免疫力的药剂正迅速改变癌症的治疗。然而，这些治疗不是在所有癌症类型中都有效、响应通常不持久、并且许多患者从治疗中获得很少或没有获得益处。pd-1/pd-l1相互作用的抑制剂在显著范围的癌症类型中具有良好的耐受性和活性，并且可能是提高治疗响应率和持久性的组合疗法的一个组成部分。在此试验中待与pdr001组合的药剂用作免疫调节剂，而不是直接抗肿瘤药剂。市售的药物(帕诺司他(panobinostat)和依维莫司)将用于未经批准的适应症，并且在此情况下，依维莫司将以比批准的方案显著更低的剂量和更少的频率给药。目标是使用这些药物来刺激更有效的抗肿瘤免疫响应，而不是作为肿瘤细胞赖以生存的关键通路的抑制剂。由于这些原因，并且因为预期增强抗肿瘤免疫响应对许多疾病是有益的，所以将在与市售的那些不同的适应症中测试这些组合。关于pdr001与hdm201的组合：hdm201(hdm2与tp53之间的相互作用的抑制剂)也可增强临床前模型中pd-1阻断的免疫激活和功效。该研究将鉴定进一步测试的剂量和日程表，并将初步评估这些组合的安全性、耐受性、药理学和临床活性。已选择以下癌症类型用于研究：结肠直肠癌(错配修复缺陷亚群之外)：pd-1/pd-l1疗法由于未知原因无效的癌症。公开的数据表明，肿瘤的免疫环境是预察和预测对用常规化疗治疗有响应的，但由于未知原因，pd-1或ctla-4抑制剂无效(kroemerg,galluzzil,laurencezitvogell等人(2015)colorectalcancer:thefirstneoplasiafoundtobeunderimmunosurveillanceandthelastonetorespondtoimmunotherapy？[结直肠癌：第一个发现的处于免疫监视下的肿瘤，也是最后一个对免疫治疗有反应的肿瘤？]oncoimmunology[肿瘤免疫学]4:7,e1058597-1-3)。包括crc的目的是了解组合疗法是否可以激活更有效的抗肿瘤响应。患有msscrc的患者将有资格获得pdr001+hdm01臂，因为此疾病具有相对低的tp53突变率。肾细胞癌，仅用于pdr001+hdm201臂：包括rcc的目的是对与hdm201的组合治疗是否可以扩大活性、加深响应或导致更持久的响应提供初步评估。对用pdr001+hdm201进行研究的疾病进行修改，以反映仅鉴定具有tp53野生型疾病患者资格的必要性。肾细胞癌具有低的tp53突变率，并且少数患者对用pd-1抑制剂治疗有响应。该研究的目的是提供初步证据，证明与用单一药剂pd-1抑制剂治疗的公布数据相比，组合用药可以提高响应率和响应持久性。每个疾病组可包括先前用pd-1检查点抑制剂治疗的患者子集，以探索组合治疗是否能够克服对pd-1阻断的抗性。对于每种疾病，不应用特定的分子选择，因为目前可获得的数据通常不支持基于批准的分子诊断测试(如pd-l1表达)排除患者。本研究将探讨这些药物是否可以安全地与pdr001组合使用，如果是，将鉴定适合进一步研究的剂量和方案。该研究还将评估每种组合是否诱导肿瘤中的药理学变化，这些变化将提示潜在的临床益处，并将初步评估每种组合的功效。目标主要目标＝>表征pdr001与hdm201组合的安全性和耐受性，以鉴定用于进一步研究的推荐剂量和日程表终点：安全性·治疗时出现的ae和sae的频率和严重程度·基线与基线后实验室参数和生命体征之间的变化仅递增·在前两个治疗周期中发生剂量限制毒性(dlt)耐受性·剂量中断和减少的频率·剂量强度关键的次要目标＝>表征肿瘤中免疫浸润的变化终点：通过苏木精和伊红(h&e)染色的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的组织病理学，通过ihc表征til和髓样细胞浸润(视情况而定，如cd8、foxp3和骨髓标记)次要目标＝>估计pdr001与hdm201组合的抗肿瘤活性终点：最佳总体响应(bor)，pfs/irrc的和recistv1.1。无治疗存活(tfs)＝>表征所有研究药物的药代动力学终点：pdr001血清浓度和pk参数、hdm201血浆浓度和pk参数＝>评估pdr001的免疫原性终点：抗pdr001抗体的存在和/或浓度探索性目标＝>在重新给予研究治疗后估计pdr001与hdm201组合的抗肿瘤活性终点：bor/recistv1.1研究设计这是在tp53野生型mss-crc或rcc患者中进行的，pdr001与hdm201组合的ib期、多中心、开放性研究。该研究由剂量递增部分、随后是具有11个研究臂的剂量扩大部分构成。在研究的剂量递增部分期间，患者将用固定剂量的与hdm201组合的pdr001治疗(静脉内给予)。将对3至6名患者进行治疗，直至确定一个或多个mtd/一个或多个rde。hdm201的起始剂量为60mg。用hdm201进行的针对pdr001的mtd/rde的剂量递增和确定将通过blrm采用ewoc标准指导。在完成两个治疗周期后将进行剂量递增。将密切监测所有招募的患者的安全性评估(包括不良事件(ae)和实验室值)以便识别任何dlt。将定义单个mtd/rde；不建立疾病特异性mtd/rde。在确定mtd/rde之前，必需用pdr001和hdm201的组合治疗至少12名患者。将从所有患者获得配对的肿瘤活组织检查。对这些活组织检查样品的分析将有助于更好地理解组合的剂量与药效学活性之间的关系。一旦宣布mtd/rde用于组合疗法，可以开始相应的剂量扩大部分。扩大部分的主要目标是进一步评估mtd/rde中任何研究治疗的安全性和耐受性。关键的次要目标是评估治疗响应中肿瘤免疫浸润的变化。这将在从所有患者收集的成对肿瘤活组织检查中进行评估，在mtd/rde治疗的患者中，具有至少10名可评估的活组织检查对(活组织检查标本必需含有足够用于分析的肿瘤)。如果这不可行，可以停止收集这些活组织检查。计划至少治疗20名患者，但考虑到一些活检标本的失败，因此估计每个研究臂大约有30名患者接受治疗。次要目标包括评估初步抗肿瘤活性。在每个治疗组中，可以招募最多大约6名患者，这些患者接受过先前pd-1/pdl-1抑制剂疗法并且疾病有进展。如果组合显示有希望克服对单一药剂pd-1/pdl-1抑制剂的先前治疗的抗性，或者如果未接受过先前pd-1/pdl-1抑制剂治疗的患者的招募在逻辑上是不可行的，则该数量可以增加。所有招募到递增部分和扩大部分的患者均可参加以下研究期：·预筛期·筛选期·治疗期1·治疗中断期·治疗期2·安全性随访期·疾病进展随访每个研究期如下所述，并显示在图31中。所有患者都被认为是“在研究中”，直到他们完成安全性随访期、撤回同意书、失去随访或死亡。必需在任何分子预筛选程序之前签署分子预筛选知情同意书(如果已经在研究之外评估了tp53状态，则不适用)。潜在的合格患者必需通过测序获得tp53状态的文件，然后才能考虑患者进行全面筛查。如果患者的肿瘤样本在tp53基因的外显子5、6、7和8中没有突变，并且如果从第一剂研究治疗的不超过36个月前收集的肿瘤样本中获得tp53状态(如果tp53wt状态是在研究之外局部获得的，也适用)，则该患者将被视为有资格进行全面筛查。除外情况：hdm2扩增(定义为>4拷贝数)的先前文件(无论日期)不需要tp53wt状态确认。筛选测试应仅在知道tp53状态后开始。一旦患者签署了研究知情同意书，筛选期就开始了。将对患者进行评估，以确保他们符合所有入选标准且不符合排除标准。治疗期1将在筛选后(在周期1第1天)开始。患者将在预定的就诊时进行临床评估。治疗期1期间的研究治疗将被给予六个治疗周期，除非患者经历不可接受的毒性、具有疾病进展的临床证据，和/或治疗由研究者或患者自行决定中断。具有疾病进展的放射学证据但具有临床益处证据的患者可继续研究治疗以在诺华公司(novartis)的书面批准后完成六个周期。如果患者在治疗期1永久停止研究治疗，则必需进行治疗结束访问并进行如下限定的适当的随访评估。一旦患者完成周期6(治疗期1)，将中断研究治疗并且患者将进入研究治疗中断期。患者将继续进行安全性评估(每月)、肿瘤评估(每2个月)的研究访问，以及收集pdr001pk(每月)和ro评估(每月)的样品。一旦患者有疾病进展的临床或放射学证据，他们可以在与诺华公司(novartis)的经记录讨论后恢复治疗。如果患者永久停止研究治疗而不是进入治疗期2，则必需进行治疗结束访问，并且必需按照以下限制进行适当的随访评估。患者应以与治疗中断时相同的剂量和日程表恢复研究治疗(图27)。只有在研究者和诺华公司(novartis)医学监测员之间达成书面协议(在出现的毒性和进展相关的临床状态的下降方面，患者适合治疗)后，患者才在治疗期2开始治疗。所有患者在恢复研究治疗前必需进行肿瘤评估；此肿瘤评估将用作治疗期2基线(图27)。在完成两个研究治疗周期后，如果患者没有经历任何>2级研究治疗相关的毒性，他/她可以按照机构护理标准减少评估日程或每三个月评估一次进行继续研究，以较为频繁的为准。在治疗期2具有疾病进展的放射学证据并且具有临床益处的证据的患者可以在与诺华公司(novartis)的书面讨论之后继续研究治疗。在治疗期2中永久停止研究治疗后，必需如下限定进行治疗结束访问和安全性随访评估。eot访问将在决定永久停止研究治疗后14天内进行。所有参与的患者必需完成eot访问。在永久停用pdr001后，将对所有患者进行150天的安全性评估。患者群体研究将在患有晚期/转移性crc或rcc的成年患者中进行。入选标准：有资格入选本研究的患者必需满足以下所有标准：1.必需在任何程序之前获得书面知情同意书2.年龄≥18岁3.患有晚期/转移性癌症、具有如由recist版本1.1确定的可测量的疾病的患者，这些患者尽管已经接受了标准疗法但是仍有进展或对标准疗法不耐受，或者对其尚不存在标准疗法。对于与hdm201组合的pdr001，患者必需符合以下组之一·tp53野生型crc(通过包括pcr和/或ihc的局部测定，不是错配修复缺陷)或tp53野生型rcc为了被认为是tp53野生型，肿瘤必需至少在第一剂研究药物之前不超过36个月收集的肿瘤样品中在外显子5、6、7和8中检测不到突变。先前记录为具有hdm2的基因组扩增的肿瘤(定义为>4拷贝数，与日期无关)不需要tp53wt状态确认。4.ecog体能状态≤1患者必需有适合进行活组织检查的疾病部位，并根据治疗机构的指南为肿瘤活组织检查的候选者。患者必需愿意在筛查时接受新的肿瘤活组织检查，并在本研究的治疗期间再次进行。5.允许使用pd-1/pdl-1抑制剂的先前治疗，条件是归因于先前pd-1或pd-l1定向治疗的任何毒性不会导致治疗中断。排除标准：符合本研究资格的患者不得满足以下任何标准(除其他外)：超出实验室值范围的患者定义为：·肌酐清除率(使用科克罗夫特-高尔特(cockcroft-gault)公式计算、或测量)<40ml/min·总胆红素>1.5xuln，患有吉尔伯特综合征的患者除外(如果其总胆红素>3.0xuln或直接胆红素>1.5xuln则将其排除)·丙氨酸氨基转移酶(alt)>3xuln，患有肝脏受累肿瘤的患者除外(如果其alt>5xuln则将其排除)·天冬氨酸氨基转移酶(ast)>3xuln，患有肝脏受累肿瘤的患者除外(如果其ast>5xuln则将其排除)·绝对中性粒细胞计数<1.0x109/l，无生长因子或输血支持·血小板计数<75x109/l，无生长因子或输血支持·血红蛋白(hgb)<9g/dl·钾、镁、钙或磷酸盐异常>ctcae1级，尽管有适当的替代疗法需要以下治疗的患者：·中等至强的cyp3a4抑制剂·任何具有窄治疗指数的cyp3a4/5的底物中等至强的cyp3a4诱导剂超出范围值的患者：·绝对嗜中性粒细胞计数(anc)<1500/μl·血小板<100000/μl治疗用于pdr001的rp2d在cpdr001x2101i/ii期临床研究中建立，每四周给予400mg，并将用于该组合研究中的所有患者因此，患者将用在400mgq4w的rp2d的pdr001治疗。pdr001(以100mg粉末形式提供，用于输注溶液)将通过静脉内输注30分钟，或如果临床有指示则长达2小时进行给药。hdm201将在4周治疗周期(q4w)的第1天(d1)和第8天(d8)给予，即方案1b。hdm201将作为口服给药的硬明胶胶囊提供，剂量强度为10mg和100mg(以hdm201游离碱的mg数表示)。胶囊通过不同的尺寸和/或颜色来区分，并且将以开放标签、防止儿童开启的密封瓶提供。起始剂量将是60mg。剂量能以20mg的剂量增量递增，例如80mg、100mg、120mg。hdm201可以在建议的起始剂量以下逐步减少，例如40mg。chdm201x2101临床研究确定了对于具有实体瘤患者的rde，在每个28天周期的d1和d8给予120mg。对于此组合研究，起始剂量是在每个28天周期的d1和d860mg。对于具有实体瘤的患者，该剂量是rde的一半，尽管尚未在患者中进行测试，但预计此剂量和日程表具有活性，如通过用hdm201(15mg-25mgqd，1周进行/3周停止)治疗的具有实体瘤的患者的血小板减少的诱导来评估。pdr001将与hdm201组合给予。患者将基于固定剂量规模(flatscale)给药，而不是按体重或体表面积给药。在临床访问期间完成pdr001输注后立即给予组合药物的剂量。在药代动力学取样的当天，患者应在给药前抽血和pdr001给药后在诊所服用早晨剂量。hdm201应在餐前至少1小时或餐后至少2小时空腹口服。患者应该在早晨(每天服药的时间大致相同)，用一杯水并且不咀嚼胶囊来服用胶囊。如果将患者分配为需要服用多个胶囊的剂量水平，则应在尽可能短的间隔内连续服用胶囊。在访问日，患者将在研究员或指定人员的监督下在诊所接受hdm201。如果患者在第8天忘记按照计划服用该剂量，他/她应该尽快服用该剂量。但是，如果已经超过计划剂量6天，则应跳过此剂量。对于hdm201，对于患有血小板减少的患者，应慎重考虑使用抗凝血剂和抗血小板药物。研究药物pdr001：药物形式：用于输注的粉剂。用于静脉内(iv)使用。抗体将以400mgq4wi.v.(静脉内)(其是单一药剂rde(推荐扩大剂量))的固定剂量给予。对于组合治疗方案，抗体也可以300mgi.v.q3w给予，这可能更方便。hdm201：药物产品由直接填充到硬明胶胶囊(hgc)中的hdm201琥珀酸原料药组成，并且不含任何其他赋形剂。以四种剂量强度提供用于口服使用的药物产品：1mg、2.5mg、10mg和100mg(基于游离形式的重量)。1mg强度胶囊是“尺寸3”黄色hgc，2.5mg强度胶囊是“尺寸3”瑞典橙hgc，10mg强度胶囊是“尺寸1”灰色hgc，并且100mg是“尺寸0”瑞典橙hgc。该药物产品包装在防止儿童开启的、感应密封的高密度聚乙烯(hdpe)瓶中。用于口服使用。通过引用并入包括附图和表的其他实施例和实例在国际专利申请公开号wo2015/112900和题为“pd-1的抗体分子及其用途”的美国专利申请公开号us2015/0210769中公开，以上文献通过引用以其全文并入。本文提及的所有公开物、专利和登录号均通过引用以其全文特此并入，如同每个单独的出版物或专利被明确且单独地表明通过引用而并入。等同形式虽然已经讨论了本发明的特定实施例，但上述说明是说明性而非限制性的。在综述本说明书和以下权利要求书之后，本发明的许多修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。应当通过参考权利要求书及其等同形式的全范围以及说明书连同此类变化来确定本发明的全范围。当前第1页12