插入表达调控序列的核酸分子、包含核酸分子的表达载体及其药物用途的制作方法

本公开涉及核酸分子，更具体地，涉及增强表达效率的核酸分子，包含该核酸分子的表达载体及其药学用途。
背景技术：
：随着生物技术的发展，已经知晓各种表达目的基因(goi)的表达系统。在表达系统中，基于细胞的表达系统通常使用微生物或真核生物的天然表达机制，而其他表达系统通常使用纯化的rna聚合酶、核糖体、trna和核糖核酸。特别地，源自真核生物的蛋白质执行翻译后修饰，例如磷酸化、甲基化和糖基化。由于微生物不具有这种翻译后修饰机制，因此真核生物表达系统已经在表达真核生物起源的蛋白的情况下使用。真核表达系统可用于基因治疗，其中将具有编码用于治疗各种疾病的肽或蛋白质的可读框(orf)的goi插入表达系统中，或用于基因疫苗，其中将具有编码肽或蛋白质(诸如抗原)的orf的goi插入该表达系统中。表达系统通常使用调节goi的转录和/或翻译的核酸序列，使得它们可以在其中有效地表达goi。通常，表达系统使用具有增强的转录效率的启动子来增强转录效率，并且就提高goi的翻译效率而言，使用真核生物特有的加帽系统。加帽系统通常在5'端具有7-甲基-鸟苷(m7g)的5'帽结构，以便有效翻译goi。包含真核生物的翻译调节因子(例如ei4fa，eif4e和eif4g)的翻译起始复合物识别并结合5'帽位点以形成加帽结构并启动翻译以合成蛋白质。当在翻译起始位点形成加帽结构时，加帽结构启动蛋白质合成，同时防止核酸酶作用导致的mrna降解。必须执行体外转录(ivt)过程以装配具有加帽结构的核酸分子。例如，可以通过用限制酶处理质粒dna(pdna)以线性化pdna，使用rna聚合酶翻译线性化的pdna以制造mrna，然后将m7g(5')-ppp-(5')g，(即规则帽类似物)在5’末端附接该mrna以制备加帽mrna来装配具有加帽结构的核酸分子。然而，这样的帽类似物通常以相反的方向结合到5'末端，并且m7g核苷酸不能充当帽。所装配的mrna中约有三分之一没有在帽位甲基化，并且这种mrna无法启动蛋白质合成。备选地，不使用帽类似物进行ivt处理，然后使用市售的牛痘病毒加帽酶进行加帽反应。此外，可以使用抗反向帽类似物(arca)诱导蛋白质合成，该抗反向帽类似物可防止帽的反向反应(arca-加帽的mrna)。已知arca-加帽的mrna可以合成的蛋白质是规则帽类似物-加帽的mrna的两倍，并且半衰期更长。然而，体外进行人工加帽反应(例如arca反应)非常昂贵并且效率低。因此，有必要开发一种具有提高的效率并且可以用作基因疫苗、基因疗法等的表达系统。免疫系统是指一种检测并去除生物体内的病原体或癌细胞，从而保护生物免受各种疾病的侵害的生物结构或机制。免疫系统可分为先天免疫系统(固有免疫系统，自然免疫系统)和适应性免疫系统(获得性免疫系统)。先天性免疫系统是一种保卫宿主的机制，可避免非特异性感染，并在不记忆特定病原体的情况下立即对病原体做出反应。各种动植物都有先天免疫系统，而植物、真菌和昆虫则只有先天免疫系统。相反，适应性免疫系统对抗原或病原体具有特异性，并且有必要通过适应性免疫系统中的抗原呈递过程来识别非自身抗原。因此，可能通过适应性免疫系统，针对特定抗原或针对通过特定抗原感染的细胞诱导特异性免疫应答。由于适应性免疫系统的记忆细胞可以募集过去执行过的免疫应答，因此当相同的病原体渗入身体时，可能迅速去除该病原体。此外，免疫系统可分为体液免疫和细胞介导的免疫(cmi)。在体液免疫中，源自骨髓的b淋巴细胞识别抗原，分化以分泌由糖蛋白(即免疫球蛋白(ig))组成的抗体，然后所述分泌的抗体去除感染的病原体。cmi是一种免疫应答，其中源自胸腺的t淋巴细胞识别抗原从而分泌淋巴因子或直接杀死受感染的细胞。接种整个病原体或其一部分以诱导针对病原体的免疫应答的疫苗抗原已用于预防或治疗各种疾病。在这种情况下，优选诱导由疫苗抗原引起的各种免疫应答。目前，亚单位疫苗主要用于替代早期开发的减毒活疫苗或灭活的杀灭疫苗，因为亚单位疫苗包含明显的结构和组分。然而，亚单位疫苗使用佐剂来增强免疫应答，因为与现有技术的疫苗相比，疫苗显示出较低的免疫原性。由于抗体是针对大多数病原细菌或病毒的主要防御因子，因此只有疫苗抗原诱导的抗体才能预防多种疾病。但是，由于细胞介导的免疫应答对感染疾病起着重要作用，尚未在预防或治疗中开发出针对所述感染疾病的疫苗。在这种情况下，可能在使用佐剂诱导细胞介导的免疫应答时有效地开发疫苗。目前，明矾、金属盐(如氢氧化铝，磷酸铝或氢氧化铝磷酸硫酸盐(aluminumhydroxidephosphatesulphate))和mf59(基于角鲨烯的水包油乳液型佐剂)已经主要用作佐剂用于人疫苗佐剂。这种常用的佐剂几乎不诱导细胞介导的免疫，而主要诱导体液免疫。因此，仅在抗体可以抵抗感染的情况下才可以使用此类佐剂，并且它们不适用于需要细胞介导的免疫应答的疫苗。作为典型的病原体，微生物在其细胞壁上具有与病原体相关的分子模式(pamp)，例如脂多糖(lps)，β-1,3-葡聚糖和肽聚糖。由宿主的免疫系统组成的特定蛋白质，例如模式识别受体(prr)或模式识别蛋白质(prp)，可以识别此类papm。每个prr或prp都可以识别病原体表面上的适当pamp，以形成复合物，该复合物诱导一系列免疫应答，如吞噬作用，结节形成，包囊，蛋白酶级联激活和抗菌肽合成。toll样受体(tlr)是代表性的prr，tlr激动剂已作为疫苗佐剂而开发，因为它们对免疫细胞显示出强大的活性。例如，内毒素lps对免疫细胞上的tlr4显示出强大免疫活性。与人类等高等生物中的基因组dna不同，细菌dna在cpg基序中没有甲基化的胞嘧啶。高级生物中的免疫细胞能够细菌dna，在该细菌dna中cpg基序的胞嘧啶未甲基化为非自身抗原。在这种情况下，特异性受体tlr9识别细菌dna。tlr9激动剂可以增强各种免疫应答，并且已将tlr9激动剂(例如包括cpg基序的寡核苷酸)作为佐剂开发。然而，用作tlr激动剂的lps和cpg基序具有很强的毒性，会在身体中引起诸如炎症反应等副作用。技术实现要素：技术问题相应地，本公开涉及可以减少由于相关技术的局限性和缺点而导致的一个或更多个问题的核酸分子、表达载体以及药物或医学应用。本公开的目的是提供一种有效表达目的肽或蛋白质而不会引起复杂且昂贵的过程的表达系统。本公开的另一个目的是提供可以诱导或刺激细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答的药物组合物，例如佐剂。问题的解决方案根据一个方面，本公开提供了核酸分子，其包含至少一个表达控制序列，该表达控制序列包含病毒内部核糖体进入位点(ires)元件；和至少一个编码区，所述至少一个编码区与所述至少一个表达控制序列可操作地连接并编码肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述核酸分子可以进一步包含位于所述至少一个表达控制序列上游的多个腺苷和多个胸苷中的至少一个。病毒的ires元素可源自小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，披膜病毒科(togaviridae)，双顺反子病毒科(dicistroviridae)，黄病毒科(flaviridae)，逆转录病毒科(retroviridae)和疱疹病毒科(herpesviridae)中的至少一个，例如，可源自小核糖核酸病毒科(picornaviridae)和双顺反子病毒科(dicistroviridae)中的的至少一种。在一个示例性实施方案中，源自小核糖核酸病毒科的病毒ires元件可源自肠道病毒(enterovirus)属，心病毒(cardiovirus)属，apthovirus属，肝病毒(hepatovirus)，捷申病毒(teschovirus)属中的至少一种，以及来源于双顺反子病毒科的病毒ires元件可以来源于蟋蟀麻痹病毒(cripavirus)属。例如,所述病毒ires元件可源自柯萨奇b病毒，蟋蟀麻痹病毒(cricketparalysisvirus)，日本脑炎病毒，脑心肌炎病毒和辛德比斯病毒中的至少一种。在另一个示例性实施方案中，至少一个表达控制序列可包含病毒5'非翻译区(5'utr)。如果需要，所述核酸分子可以进一步包含位于5’utr下游的病毒3'非翻译区(3'utr))，并且其中所述至少一个编码区位于所述5'utr和所述3'utr之间。在一个实施方案中，至少一个编码区可以编码抗原或其片段。备选地，所述至少一个编码区编码用于治疗疾病的蛋白质或其片段。在另一个示例性实施方案中，所述至少一个表达控制序列包括具有第一ires元件的第一表达控制序列和位于所述第一表达控制序列的下游并具有第二ires元件的第二表达控制序列。所述至少一个编码区可包含位于所述第一表达控制序列和所述第二表达控制序列之间的第一编码区和位于所述第二表达控制序列的下游的第二编码区。所述核酸分子可进一步包含位于第一表达控制序列和第二表达控制序列中至少一个的上游的多个腺苷或多个胸苷中的至少一个。第一表达控制序列可包含源自柯萨奇b病毒或蟋蟀麻痹病毒的第一病毒ires元件，并且所述第二表达控制序列可包含源自脑心肌炎病毒的第二病毒ires元件。或者，该核酸分子可进一步包含位于至少一个表达控制序列下游的转录控制序列，和/或位于至少一个编码区域下游的多聚腺苷酸化信号序列或多聚腺苷序列。核酸分子可以是rna。在另一方面，本发明提供了包含上述核酸分子的重组载体。在又另一方面，本发明提供了一种刺激，诱导和/或增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的上述核酸分子。核酸分子的至少一个编码区可编码抗原或其片段。例如，所述至少一个编码区可编码选自病毒病原体、病毒抗原及其组合的肽或蛋白质。发明的有益效果为了使用常规的加帽结构有效表达目的基因，存在一个问题，即不得不使用昂贵的酶，并且不得不在一个表达系统中仅表达一种肽或蛋白质。但是，本公开的核酸分子能够在体内有效表达所需的肽或蛋白质，而无需使用昂贵的酶。另外，本公开内容包含ires作为表达控制序列，从而如果需要，可以将相同或不同的肽或蛋白质与其他ires序列可操作地连接，以在单个核酸分子中同时产生所需的肽和蛋白质，且本公开可以提高表达效率。根据本公开，包含能够由病毒表达控制序列表达的免疫原性靶序列的核酸分子可以增强由免疫原性物质引起的免疫应答。因此，本公开的核酸分子可以用作佐剂，用于增强免疫原性物质的免疫应答。附图说明图1是示出根据本公开的示例性实施方案的包括一个表达盒或一个表达单元的多核苷酸或核酸分子的组分的示意图；图2是示出根据本公开的另一个示例性实施方案的包括多个表达盒或多个表达单元的多核苷酸或核酸分子的组分的示意图；图3a和3b是示出根据本公开的实施例测量的通过向细胞施用包括ires元件的rna平台的核酸分子，goi(海肾萤光素酶；r/l)的表达水平的图。图3a是示出在a204细胞中r/l的表达水平的图。图3b是示出在293细胞中r/l的表达水平的图；图4是示出根据本公开的实施例测量的通过向a204细胞施用包括ires元件的rna平台的核酸分子，goi(海肾萤光素酶；r/l)的表达水平的图；图5是示出根据本公开的实施例测量的通过向293t细胞施用包括多个ires元件的rna平台的核酸分子，goi(海肾萤光素酶；r/l)的表达水平的图；图6a和6b是示出根据本公开的实施例测量的通过向细胞施用包括ires元件的rna平台的核酸分子，goi(海肾萤光素酶，r/l；和萤火虫萤光素酶，f/l)的表达水平的图。图6a是示出在293t细胞中r/l和f/l的表达水平的图。图6b是示出在nor10细胞中r/l和f/l的表达水平的图；图7是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的merss蛋白特异性igg1水平的图；图8是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的merss蛋白特异性igg2c水平的图；图9a至图9c是示出根据本公开的实施例通过流式细胞术测量的，源自小鼠骨髓树突细胞(mbmdc)的活化的树突细胞(cd11c+cd40+,cd11c+cd80+和cd11c+cd86+)的图，每种cd4+细胞对于细胞介导的免疫应答增殖；图10a和10b是示出根据本公开的实施例的通过elis24小时层测量的mbmdc的上清液中与th1相关的细胞因子(即il-12和il-6)产生的图；图11是示出根据本公开的实施例的用不同浓度的核酸分子处理的小鼠组织的照片；图12是示出根据本公开的实施例使用用核酸分子配制的merss蛋白接种的小鼠的免疫方案的示意图；图13a和13b是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的merss特异性igg1水平的图；图14a和14b是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的merss蛋白特异性igg2c水平的图；图15是示出根据本公开的实施例的通过erspot测量的使用用核酸分子配制的merss蛋白刺激的小鼠的脾细胞中ifn-γ产生细胞的图；图16是示出根据本公开的实施例的接种了使用用核酸分子配制的merss蛋白的小鼠的免疫方案的示意图；图17是示出根据本公开的实施例的用噬斑减少中和试验(prnt)测定的使用用核酸分子配制的merss蛋白免疫的小鼠的血清中的mers-cov特异性中和抗体水平的图；图18a和图18b是示出根据本公开的实施例的通过elisa测量的merss蛋白特异性igg1水平的图。图19a和19b是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的merss蛋白特异性igg2c水平的图；图20是示出根据本公开的实施例的使用用核酸分子配制的hpv蛋白疫苗接种的小鼠的免疫方案的示意图；图21a至图21c是示出根据本公开实施例的通过elisa测量的hpv蛋白特异性总igg、igg1和igg2水平的图；图22a至图22c是示出根据本公开的实施例的在第一次免疫后2周的merss蛋白特异性总igg、igg1和igg2水平的图；图23a至图23c是示出根据本公开的实施例的在第二次免疫后2周的merss蛋白特异性总igg、igg1和igg2水平的图；图24a是示出根据本公开的实施例的，通过elispot测量的使用具有核酸分子的hpv蛋白疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的ifn-γ产生细胞的图且图24b示出了小鼠脾细胞中ifn-γ分泌细胞；图25a至图25d是示出根据本公开实施例的通过用elisa测量的使用用核酸分子配制的hpv蛋白疫苗免疫的小鼠脾细胞中th1相关细胞因子即il-2、il-6和ifn-γ产生的图；图26是示出根据本公开的实施例使用用核酸分子配制的灭活流感疫苗接种的小鼠的免疫方案的示意图；图27是显示根据本发明实施例的通过prnt测定的使用用核酸分子配制的灭活流感疫苗免疫的小鼠的血清中流感特异性中和抗体水平的图；图28是示出根据本公开的实施例的通过elispot测量的用灭活的流感疫苗和核酸分子刺激的小鼠的脾细胞中的ifn-γ产生细胞的图；图29是示出根据本公开的实施例的通过elispot测量的用灭活的流感疫苗和核酸分子刺激的小鼠的脾细胞中的il-2产生细胞的图；图30是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的使用用核酸分子配制的灭活流感疫苗免疫的小鼠脾细胞中il-6产生的图；图31是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的使用用核酸分子配制的灭活流感疫苗免疫的小鼠脾细胞中ifn-γ产生的图；图32a和图32b是示出根据本公开的实施例的通过elisa测量的merss蛋白igg1水平的图；图33a和图33b是示出根据本公开的实施例的通过elisa测量的merss蛋白-igg2c水平的图；图34是示出根据本发明实施例的通过prnt测定的使用用核酸分子配制的merss蛋白疫苗免疫的小鼠的血清中中和抗体水平的图；图35是示出根据本公开的实施例的通过erspot测量的使用merss蛋白与核酸分子免疫的小鼠的脾细胞中ifn-γ产生细胞的图；图36是示出根据本公开的实施例的通过流式细胞术测定的产生inf-γ、il-2和tnf-α的多功能cd4t细胞的频率的图；图37a和37b是示出根据本发明实施例的通过elisa测量的vzv疫苗特异性igg1和igg2a水平的图；图38a是示出根据本公开的实施例的通过erspot测量的使用用核酸分子配制的vzv疫苗免疫的小鼠的脾细胞中ifn-γ产生细胞的图；图38b是示出根据本公开的实施例的通过erspot测量的使用用核酸分子配制的vzv疫苗免疫的小鼠的脾细胞中il-2产生细胞的图；且图39是示出根据本发明实施例的通过fama测量的使用用核酸分子配制的vzv疫苗免疫的小鼠的血清中和抗体效价的图。实施本发明的最佳方式定义如本文使用的，术语“氨基酸”以最广义使用，意在不仅包括l-氨基酸，还包括d-氨基酸，化学修饰的氨基酸和氨基酸类似物。如本文使用的，术语“肽”包括从天然存在的环境中分离或通过重组技术或化学合成法合成的任何蛋白质、蛋白质片段和肽。例如，本公开的肽可包含但不限于至少5个，优选10个氨基酸。如本文使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括可理解的dna(即cdna)和rna分子。作为核酸分子的亚单位的“核苷酸”可包括但不限于脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其类似物和/或可通过dna或rna聚合酶或合成反应掺入多核苷酸的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，具有修饰的碱基的类似物和/或多糖(诸如甲基化的核苷酸)及其类似物(参见，scheit,nucleotideanalogs,johnwiley,newyork,1980；uhlmanandpeyman,chemicalreviews,90:543-584,1990)。如本文使用的，术语“载体”意指可以被转染或递送到宿主细胞中并使一种或多种目的基因(或靶序列的靶基因)能够在细胞内表达的构建体或载体。例如，所述载体可以包括但不限于病毒载体、dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体，与cca(阳离子缩合剂(cationiccondensingagents))连接的dna或rna表达载体、与脂质体一起包装的dna或rna表达载体、诸如生产细胞等特定的真核细胞，等等。如本文使用的，术语“表达控制序列”(ecs)可以意指调节或控制核酸分子的转录过程和/或转录的核酸分子的翻译过程的核酸序列。或者，该术语可用于表示调节或控制转录的核酸分子的翻译过程的核酸序列。在这种情况下，该术语可以与术语“翻译控制序列”互换使用。如本文所用，术语“转录控制序列”(tcs)是指调节或控制核酸分子的转录过程的核酸序列。例如，转录控制序列包含启动子，例如组成型启动子或诱导型启动子，增强子等。表达控制序列，转录控制序列和翻译控制序列中的每一个均与要表达的靶序列可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”意指表达控制序列(例如启动子，信号序列或转录调控因子连接位点处的阵列)与其他核酸序列之间的功能性连接，以便表达控制序列可调控其他核酸序列的转录和/或翻译。如本文使用的，术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指足以使活性成分、其肽或其片段和/或编码该肽或其片段的核酸充分发挥功效或激活的量。例如，含有肽或基因传递载体的药物组合物，其包括编码该肽的核酸分子。核酸分子本公开涉及一种核酸分子或多核苷酸，其包含至少一个具有内部核糖体进入位点(ires)活性的表达控制序列，从而涉及至少一个目的基因(goi)或靶序列。图1是示出根据本公开的示例性实施方案的包括一个表达盒或表达单元的多核苷酸或核酸分子的组分或元件的示意图；如图1所示，该核酸分子可以包含含ires活性的核苷酸序列的表达控制序列(ecs)，和与该表达控制序列(ecs)可操作地连接并包含编码肽或蛋白质的goi的可读框(orf)或靶序列(ts)的编码区(cr)。在一个示例性的实施方案中，表达控制序列(ecs)可包含具有ires活性的5'非翻译区(5'utr)。编码区(cr)可以位于下游，即表达控制序列(ecs)的3'末端，例如具有ires活性的5'utr和编码该蛋白质的肽的靶序列(ts)。在一个示例性的实施方案中，靶序列(ts)可包括但不限于关于免疫原、报告肽或蛋白质、药物(drugs)，药剂(pharmaceuticals)、生物制品等的编码肽或蛋白质的核苷酸。核酸分子可以是dna或rna。在一个示例性的实施方案中，核酸分子具有rna平台类型。在这种情况下，编码区(cr)可以包含goi的转录物序列。表达控制序列(ecs)包含具有ires活性的核苷酸序列，该序列可操作地连接至插入goi的orf的编码区(cr)。如上所述，表达控制序列(ecs)可以具有包含具有ires活性的核苷酸的5'utr结构。5'utr是在编码区(cr)中表达的肽或蛋白质的翻译过程中翻译起始复合物结合的区域，ires是通过与翻译起始复合物形成复杂的第二和三级结构诱导编码区(cr)翻译的顺式作用核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，表达控制序列(ecs)可包含病毒ires元件。例如，表达控制序列(ecs)可以具有包含病毒ires元件的5'utr结构。在一个示例性实施方案中，病毒ires元件可源自小核糖核酸病毒科，披膜病毒科，双顺反子病毒科，黄病毒科，逆转录病毒科和疱疹病毒科等中的至少一种。ires元件具有独特的二级结构或三级结构，可以根据rna的分子折叠结构和翻译的作用方式分为四类，例如涉及经典的真核生物起始因子(eif)或特定的刺激性ires反式作用因子。i类ires需要除了eif4e以外的大多数翻译起始因子，像在经典扫描模型中一样，募集40s核糖体复合物，并且在小核糖核酸病毒科(例如柯萨奇b3病毒(cvb3))中被发现。ⅱ类ires直接在起始密码子处开始翻译，而无需在rna序列的5个末端进行任何扫描，且它们需要大多数的eif，就像i类ires一样，并且在一些小核糖核酸病毒科中(例如脑心肌炎病毒(emcv))中被发现。ⅲ类ires还可通过将rna折叠结构识别为假结体而直接在起始密码子处起始翻译，而无需扫描，但需要较少的i和ⅱ类ires的eif，并且在黄病毒科(例如日本脑炎病毒(jev))中被发现。ⅳ类ires具有简单的翻译模式，不需要任何eif。它仅涉及因子2(eif2)来稳定易位中间体，并具有复杂的rna折叠结构。与通常位于rna序列的5'utr中的其他ires相比，iv类ires在双顺反子病毒科(例如蟋蟀麻痹病毒(crpv))的基因间区域(igr)中被发现。例如，属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件可以源自肠道病毒，心病毒属，apthovirus属，肝病毒属和捷申病毒属中的至少一种。在一个示例性实施方案中，属于肠道病毒属的病毒ires元件可以源自肠道病毒a至肠病毒j类型的任何一种和/或鼻病毒(rhinovirus)a至鼻病毒c类型的任何一种。在另一个示例性实施方案中，属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件可源自但不限于以下的至少一种:肠道病毒属中，肠道病毒属例如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)(pv)，鼻病毒(rv)，柯萨奇病毒，例如，柯萨奇b病毒(cvb)，例如柯萨奇b3病毒(cvb3)和/或肠道病毒71(ev71)；心病毒属，例如脑心肌炎病毒(emcv)和/或泰勒鼠脑脊髓炎病毒(theilermurineencephalomyelitisvirus)(tmev)；apthovirus属，例如口蹄疫病毒(fmdv)；肝病毒属，例如甲型肝炎病毒(hav)；捷申病毒属，例如猪捷申病毒(ptv)，例如ptv-1。在备选实施方案中，属于披膜病毒科的病毒ires元件可以源自但不限于alphavirus属中的至少一种，例如辛德比斯病毒(sindbisvirus)(sv)。在另一个实施方案中，属于双顺反子病毒科的病毒ires元件可以源自但不限于蟋蟀麻痹病毒属，例如，褐珀春肠道病毒(psiv)，蟋蟀麻痹病毒(crpv)，吸血猎蝽病毒(triatomavirus)和/或禾谷缢管芽病毒(rhopalosiphumpadivirus)(rxpd)。在一个示例性实施方案中，属于黄病毒科的病毒ires元件可以源自但不限于肝病毒属(例如丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus)(hcv))，黄病毒属(例如日本脑炎病毒(jev))；瘟病毒(pestivirus)属，例如经典猪瘟病毒(classicalswinefevervirus)(csfv)和/或牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus)(bvdv)中的至少一种。在另一个示例性的实施方案中，属于逆转录病毒科的病毒ires元件可以源自但不限于以下至少一种:γ逆转录病毒属，例如友鼠白血病病毒(fmlv)和/或莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)；和/或α逆转录病毒属(例如劳斯肉瘤病毒(rsv))。在又一个实施方案中，属于疱疹病毒科的病毒ires元件可以源自但不限于马立克病毒属(mardivirus)，例如marek病病毒(mdv)。在一个示例性实施方案中，表达控制序列(ecs)的病毒ires元件可源自小核糖核酸病毒科和双顺反子病毒科中的至少一种。在这种情况下，属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件可以源自肠道病毒属，心病毒属和apthovirus属中的至少一种，优选源自肠道病毒属。例如，属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件可以源生自肠道病毒属，例如cvb3和/或心病毒属，例如emcv。另外，属于双顺反子病毒科的病毒ires元件可以源自蟋蟀麻痹病毒属，例如psiv和/或crpv，优选crpv。在一个示例性实施方案中，表达控制序列(ecs)可具有源自但不限于sv、cvb3、emcv、jev和crpv中的至少一种的病毒ires元件。例如，表达控制序列(ecs)可以包括但不限于sv来源的病毒ires元件(seqidno:1)，cvb3来源的病毒ires元件(seqidno:2)，emcv来源的病毒ires元件(seqidno:3和/或seqidno:4)，jev来源的病毒ires元件(seqidno:5)，crpv来源的病毒ires元件(seqidno:6)及其组合。备选地，可以修饰某些病毒ires元件的5'末端，以具有源自病毒蛋白的帽类似结构。在备选的实施方案中，本公开的核酸分子可具有能够增强在编码区(cr)中的orf的表达效率的其他元件或核酸序列。例如，多个腺苷(ma)或多个胸苷(mt)可以位于邻近表达控制序列(ecs)，优选在其上游(5'端)。在一个示例性的实施方案中，可将约20至约400个，优选地约30至约300个，更优选地约30至约200个，最优选地约30至约100个腺苷或胸苷插入在具有至少一个ires元素的表达调控序列(ecs)的上游。例如，位于多个腺苷(ma)和/或多个胸苷(mt)附近的表达控制序列(ecs)包含源自小核糖核酸病毒科，披膜病毒科，双顺反子病毒科，黄病毒科，逆转录病毒科和疱疹病毒科的病毒ires元件。在一个示例性实施方案中，与多个腺苷(ma)和/或多个胸苷(ta)相邻定位的病毒ires元件可以源自小核糖核酸病毒科和/或双顺反子病毒科。例如，可以将多个腺苷(ma)和/或多个胸苷(mt)中的至少一个插入表达控制序列(ecs)的上游，所述表达控制序列包含源自但不限于小核糖核酸病毒科(例如肠道病毒(例如cvb3)和/或心病毒(例如emcv)和双顺反子病毒科(例如蟋蟀麻痹病毒(例如crpv)))的病毒ires元件。编码区(cr)可以包含编码相应肽或蛋白质并与表达控制序列(ecs)可操作连接的orf的核苷酸。编码区(cr)可以位于表达控制序列(ecs)的下游(3'末端)。在一个示例性的实施方案中，编码区(cr)可以包含编码报告肽/蛋白质，标志物或选择肽/蛋白质，抗原，抗体，药物，药剂，生物制剂，其片段，其变体和/或其衍生物中的任何一种的orf。例如，在编码区(cr)编码免疫原性肽或蛋白质的情况下，编码区(cr)可包含编码肽或蛋白质例如其抗原或表位的orf。在一个示例性实施方案中，如果编码区(cr)编码报告蛋白或肽，编码区(cr)中的orf可以编码萤光素酶，例如海肾萤光素酶(seqidno:16和/或seqidno；17)和/或萤火虫萤光素酶(seqidno:18)，绿色荧光蛋白(gfp)，增强型绿色荧光蛋白(egfp)和/或β-半乳糖苷酶。编码标志物或选择蛋白或肽的orf可包含编码α-珠蛋白，半乳糖激酶，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶等的核苷酸。可以将编码其他报告蛋白/肽和/或标志物或选择蛋白/肽的其他orf插入编码区(cr)内。在另一个示例性实施方案中，编码区(cr)可包含编码抗原、其片段、其变体或衍生物的orf。例如，可以从编码区(cr)表达的抗原可以包括肿瘤抗原，动物抗原，植物抗原，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原，自身免疫抗原和/或过敏性抗原。优选地，抗原可能具有肿瘤细胞、病毒病原体、细菌病原体、真菌抗原和/或原生动物的表面抗原的分泌形式。如果必要，抗原可以在根据本公开内容的核酸分子中，也可以作为与适当载体结合的半抗原。可以使用其他抗原成分，例如灭活的或减毒的病原体。从编码区(cr)表达的特别优选的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性表面抗原(tssa)。这样的肿瘤抗原可以是但不限于选自以下各项组成的组:p53,ca125,egfr,her2/neu,htert,pap,mage-a1,mage-a3,间皮素(mesothelin),muc-1,gp100,mart-1,酪氨酸酶,psa,psca,psma,steap-1,vegf,vegfr1,vegfr2,ras,cea或wt1,且优选地来自pap,mage-a3,wt1,和muc-1。在另一个示例性实施方案中，致病性抗原可以表达自编码区(cr)，所述致病性抗原源自诱导哺乳动物个体，特别是人的免疫应答的致病性生物体。例如，致病性抗原可以源自细菌、病毒或原生动物(多细胞)致病性生物。在一个示例性实施方案中，致病性抗原可以是位于诸如病毒，细菌或原生动物的生物体表面上的表面抗原，例如蛋白质(或蛋白质片段，诸如表面抗原的外部部分)。在另一个示例性实施方案中，致病性抗原可以表达自编码区(cr)，是源自传染病相关病原体的肽或蛋白质抗原。与传染病相关的病原体可以包括但不限于流感病毒(influenzavirus)，呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)(rsv)，单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)(hsv)，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus)(hpv)，人免疫缺陷病毒(hiv)，疟原虫(plasmodiumgenus)属，葡萄球菌(staphylococcus)属，登革热病毒(dengueviruses)，沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)(cmv)，乙型肝炎病毒(hbv)，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，狂犬病病毒(rabiesvirus)，黄热病病毒(yellowfevervirus)，中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus)(mers-cov)和/或寨卡病毒(zikavirus)。在一个示例性实施方案中，所述编码区(cr)可包含但不限于编码mers-cov中的刺突肽的orf(seqidno:19)或编码mers-cov中的刺突肽的片段的orf(seqidno:20)，编码hpv中l1区或其片段的orf，例如编码hpv-16中l1区或其片段的orf(seqidno:21)，编码hpv-18中l1区或其片段的orf(seqidno:22)，编码在流感病毒中血细胞凝集素(haemagglutin)(ha)或其片段的orf(seqidno:23)，编码在水痘-带状疱疹病毒(vzv)中ge或其片段的orf(seqidno:25)和/或其等同核苷酸。在一个示例性实施方案中，所述肽或蛋白可以表达自编码区(cr)，是免疫原性肽或蛋白质，诸如抗原。在一个示例性实施方案中，本公开的核酸分子可以是rna平台。在这种情况下，当编码区(cr)包含编码能够诱导个体中的免疫应答的肽和/或蛋白质(例如病原性抗原)的orf时，本发明的核酸分子可用作能够被注射到个体或受试者中的rna疫苗。rna表达平台比dna表达平台具有许多优势。rna表达平台具有高度的安全性，因为它们不需要核进入和宿主染色体整合，并且缺少抗生素基因，从而避免了抗生素耐药性。此外，rna表达平台表现出自相矛盾的快速降解，从而避免了重复注射引起的免疫毒性。而且，由于不需要任何不必要的生物过程(例如大规模细胞培养和活病原体培养)，rna表达平台显示出便捷的体外生产，从而避免了对生物设施(诸如生物反应器)的需求。此外，rna表达平台可提供均衡的免疫应答诱导，例如t辅助细胞1(th1)和t辅助细胞2(th2)激活以及体液和细胞应答，这归因于rna激活先天免疫途径的特征性能力。在另一个示例性实施方案中，编码区(cr)可以包含编码关于治愈或治疗疾病的治疗性肽和/或蛋白质的orf。在这种情况下，就治疗疾病而言，本发明的核酸分子可用作基因疗法和/或增强免疫应答的佐剂。在一个示例性的实施方案中，关于治疗疾病的治疗性肽或蛋白质可以包括但不限于用于治疗代谢或内分泌失调的治疗性肽或蛋白质；用于治疗血液疾病，循环系统疾病，呼吸系统疾病，癌症或肿瘤疾病，感染疾病或免疫缺陷的治疗性肽或蛋白质；用于治疗激素替代疗法的治疗性肽或蛋白质；用于将体细胞反向分化为全能或多能干细胞的治疗性肽或蛋白质；选自佐剂或免疫刺激蛋白的治疗性肽或蛋白；和/或抗体。这样的肽或蛋白质可以构成如下所述的药物组合物中的药物活性成分。例如，用于治疗代谢或内分泌疾病的肽或蛋白质可包括但不限于骨形态发生蛋白(bmp)，表皮生长因子(egf)，成纤维细胞生长因子(fgf)，胰岛素样生长因子1(igf-1)，igf-1类似物等。这些和其他蛋白质被理解为治疗性的，因为它们意在通过以足够的量替换其功能性蛋白质的有缺陷的内源性产生来治疗受试者。因此，这样的治疗性蛋白质通常是哺乳动物的，特别是人蛋白质。此外，佐剂或免疫刺激蛋白也可用于诱导或改善个体的免疫应答，以治疗个体的特定疾病或改善病况。在又一个示例性的实施方案中，关于佐剂或免疫刺激蛋白的治疗性肽或蛋白可包括但不限于人佐剂蛋白，特别是模式识别受体，例如tlr1,tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr6,tlr7,tlr8,tlr9,tlr10,tlr11；nod1,nod2,nod3,nod4,nod5,nalp1,nalp2,nalp3,nalp4,nalp5,nalp6,nalp6,nalp7,nalp7,nalp8,nalp9,nalp10,nalp11,nalp12,nalp13,nalp14,iipaf,naip,ciita,rig-i,mda5和lgp2。致病性佐剂蛋白，通常包括能够在哺乳动物中引发先天性免疫应答的任何致病性佐剂蛋白，更优选地选自源自细菌、原生动物、病毒或真菌等的致病性佐剂蛋白，例如细菌佐剂蛋白、原生动物佐剂蛋白(例如，弓形虫(toxopolasmgondi)的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白)，病毒佐剂蛋白或真菌佐剂蛋白。特别地，细菌佐剂蛋白可以选自由以下各项组成的组:细菌热激蛋白或伴侣蛋白，包括hsp60，hsp70，hsp90，hsp100；来自革兰氏阴性细菌的ompa(外膜蛋白)；细菌孔蛋白，包括ompf；细菌毒素，包括来自百日咳杆菌的百日咳毒素(pt)，来自百日咳杆菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素cyaa和cyac，来自百日咳毒素的pt-9k/129g突变体，来自百日咳杆菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素cyaa和cyac，破伤风毒素，霍乱毒素(ct)，霍乱毒素b亚基，来自霍乱毒素的ctk63突变体，来自ct的cte112k突变体，大肠杆菌热不稳定肠毒素(ltb)，热不稳定肠毒素(ltb)的b亚基、具有减低的毒性的大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体(包括ltk63，ltr72)；酚溶性调节蛋白；来自幽门螺杆菌的中性粒细胞激活蛋白(hp-nap)；表面活性蛋白d；来自布氏疏螺旋体的外表面蛋白a脂蛋白，来自结核分枝杆菌的ag38(38kda抗原)；来自细菌菌毛的蛋白质；霍乱弧菌肠毒素ct，革兰氏阴性菌菌毛的菌毛蛋白和表面活性蛋白a；或类似物，或上述任何细菌(佐剂)蛋白的任何物种同源物。细菌佐剂蛋白也可能包含细菌鞭毛蛋白(bacterialflagellins)。在一个实施方案中，细菌鞭毛蛋白可以选自以下生物的鞭毛蛋白，所述生物包括但不限于:农杆菌属(agrobacterium)，产水菌属(aquifex)，固氮螺菌属(azospirillum)，芽孢杆菌属(bacillus)，巴尔通体属(bartonella)，博德特氏菌属(bordetella)，疏螺旋体属(borrelia)，伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)，弯曲杆菌属(campylobacter)，卡鲁杆菌属(caulobacte)，梭菌属(clostridium)，埃希氏菌属(escherichia)，螺杆菌属(helicobacter)，毛螺菌属(lachnospiraceae)，军团杆菌属(legionella)，李斯特菌属(listeria)，变形杆菌属(proteus)，假单胞菌属(pseudomonas)，根瘤菌属(rhizobium)，红杆菌属(rhodobacter)，roseburia，沙门氏菌属(salmonella)，serpulina，沙雷菌属(serratia)，志贺氏菌属(shigella)，密螺旋体属(treponema)，弧菌属(vibrio)，类杆菌属(wolinella)，耶尔森氏菌属(yersinia)，更优选地选自来自包括但不限于以下物种的鞭毛蛋白:根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)，嗜火产水菌(aquifexpyrophilus)，巴西固氮螺菌(azospirillumbrasilense)，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，苏芸金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)，杆状巴尔通氏体(bartonellabacilliformis)，支气管败血性包特氏菌(bordetellabronchiseptica)，布氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)，洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia)，空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)，新月柄杆菌(caulobactercrescentus)，肉毒梭状芽胞杆菌菌株贝内特克隆1(clostridiumbotulinumstrainbennettclone1)，大肠杆菌(escherichiacoli)，幽门螺杆菌(helicobacterpylori)，毛螺科菌(lachnospiraceaebacterium)，侵肺军团菌(legionellapneumophila)，单核细胞增生李斯忒氏菌(listeriamonocytogenes)，奇异变形菌(proteusmirabilis)，绿脓假单胞菌(pseudomonasaeroguinosa)，丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)，苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti)，鼠伤寒沙门氏菌(rhodobactersphaeroides)，类球红细菌(roseburiacecicola)，蔷薇花蕾人葡萄球菌(rosebudshominis)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，羚羊沙门氏菌(salmonellabongos)，伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)，肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)，serpulinahyodysenteriae，粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens),鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii),溃蚀密螺旋体(treponemaphagedenis),解藻朊酸弧菌(vibrioalginolyticus),霍乱弧菌(vibriocholerae),副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus),产琥珀酸沃廉氏菌(wolinellasuccinogenes)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)。原生动物(佐剂)蛋白是病原性佐剂蛋白的另一个例子。原生动物(佐剂)蛋白可以选自任何具有佐剂特性的原生动物蛋白，更优选选自但不限于由以下各项组成的组:来自克氏锥虫(trypanosomacruzi)的tc52，来自刚地锥虫(trypanosomagondii)的pftg，原生动物热激蛋白，利什曼原虫属(leishmaniaspp.)的leif，来自鼠弓形体(鼠弓形体)的轮廓样蛋白等。病毒(佐剂)蛋白是致病性佐剂蛋白的另一个例子。在本文中，病毒(佐剂)蛋白可以选自任何显示佐剂特性的病毒蛋白，更优选选自但不限于由以下组成的组:呼吸道合胞病毒融合糖蛋白(respiratorysyncytialvirusfusionglycoprotein)(f蛋白)，mmt病毒的包膜蛋白，小鼠白血病病毒蛋白，野生型麻疹病毒的血细胞凝集素蛋白等。真菌(佐剂)蛋白甚至是致病性佐剂蛋白的另一个例子。在本发明的上下文中，真菌(佐剂)蛋白可以选自任何显示佐剂特性的真菌蛋白，更优选选自由真菌免疫调节蛋白(fip；lz-8)等组成的组。此外，佐剂蛋白还可以选自由匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)(klh)，ospa等组成的组。在另一个实施方案中，治疗性蛋白质可用于激素替代疗法，特别是用于绝经期妇女的疗法。这些治疗蛋白优选选自雌激素，黄体酮(progesterone)或孕激素(progestins)，有时还选自睾酮。此外，治疗性蛋白质可用于将体细胞重编程为多能或全能干细胞。为此，描述了几个因素，特别是oct-3/4，sox基因家族(sox1，sox2，sox3和sox15)，klf家族(klf1，klf2，klf4和klf5)，myc家族(c-myc，l-myc和n-myc)，nanog和lin28。如上所述，治疗性抗体在本文中也定义为治疗性蛋白质。这些治疗性抗体优选地选自尤其用于治疗癌症或肿瘤疾病的抗体。在一个示例性实施方案中，编码区(cr)可以包含对应于药物组合物中的药物活性成分的orf，即编码药物活性成分或其片段。例如，当药物活性成分包含肽或蛋白质(例如抗原或抗体)时，编码区(cr)可以包含编码抗原或抗体或其片段的orf。在编码区(cr)中的orf长度没有限制，并且在开发用于使用该分子预防或治疗疾病的核酸分子、重组载体以及药物或医学应用中未考虑取决于orf长度的表达效率。在开发人类疫苗或基因疗法时不考虑密码子选择，因为人类的密码子选择基础不会显著影响常见肽/蛋白质的表达。但是，可能优选的是，起始密码子具有kozak序列，并且可以优化与终止密码子相邻的核苷酸。如有必要，可以在不改变氨基酸的情况下将goi中第三个密码子或其要表达的转录mrna密码子更改为"g/c"，从而使mrna具有更高的稳定性。核酸分子可包含至少一个克隆位点，最好是用于在其中插入编码区(cr)的多克隆位点(mcs)。所述至少一个克隆位点可包含至少一个限制性核酸内切酶识别位点和/或被至少一种限制性核酸内切酶切割的位点。在一个实施方案中，限制性核酸内切酶可以包含人工设计的限制性核酸内切酶(例如锌指核酸酶或基于tal效应子的dna结合位点的限制性核酸内切酶或基于pna的pna酶)以及在细菌或古细菌中发现的天然存在的核酸内切酶。例如，天然存在的限制性核酸内切酶可分类为1)i型核酸内切酶(切割与识别位点隔开的位点并需要atp、s-腺苷-l-蛋氨酸和mg2+)，2)ⅱ型核酸内切酶(在识别位点内切割或与识别位点隔开切割，且最需要mg2+)，3)ⅲ型核酸内切酶(与识别位点隔开切割，仅需要atp而不水解atp)，4)ⅳ型核酸内切酶(靶标修饰的位点为甲基化、羟甲基化或葡糖基-羟基甲基化)和5)ⅴ型核酸内切酶(例如crisprcas9-mrna复合物)。例如，可以使用以下限制性核酸内切酶识别位点和/或切割位点:5'-atcgat-3'(angi),5'-aggcct-3'(aati),5'-tgatca-3'(abai),5'-ggatcc-3'(bamhi),5'-gcagc(n)8-3'(bbvi),5'-(n)10cga(n)6tgc(n)12-3'(bcgi),5'-(n)8gag(n)5ctc(n)13-3'(bpli),5'-gtctc(n)-3'(bsmai；alw26i),5'-actggn-3'(bsri),5'-atcgat-3'(clai),5'-ctcttcn-3'(eari),5'-ctgaag(n)16-3'(eco57i),5'-gaattc-3'(ecori),5'-ccwgg-3'(ecorⅱ？；w是a或t),5'-gatatc-3'(ecorⅴ),5'-ggatg(n)9-3'(foki),5'-ggcc-3'(haeⅲ？),5'-aagctt-3'(hindⅲ？),5'-ccgg-3'(hpaⅲ？),5'-ggtga(n)8-3'(hphi),5'-ggtacc-3'(kpni),5'-gatc-3'(mboi),5'-acgcgt-3'(mlui),5'-gccggc-3'(naei),5'-gatatg-3'(ndeⅱ？),5'-gccggc-3'(ngomⅳ？),5'-catg-3'(nlaⅲ？),5'-gcggccgc-3'(noti),5'-ttaattaa-3'(paci),5'-ctgcag-3'(psti),5'-gagctc-3'(saci),5'-ccgcgg-3'(sacⅱ？),5'-gtcgac-3'(sali),5'-gcatc(n)5-3'(sfani),5'-cccggg-3'(smai),5'-tcga-3'(taqi),5'-tctaga-3'(xbai),5'-ctcgag-3'(xhoi)及其组合。在一示例性实施方案中，克隆位点可包括多克隆位点(mcs)。此外，在表达控制序列(ecs)具有包括ires元件的5'utr的情况下，本公开的核酸分子可任选地包含3'utr，以增强在编码区(cr)中的orf的表达效率。在一个实施方案中，编码区域(cr)可以位于5'utr和3'utr之间。3'utr可与5'utr一起提高goi或其转录物的翻译效率，并且在细胞中稳定转录物mrna方面具有重要作用。在一个示例性的实施方案中，3'utr可以作为包括ires元件的5'utr从病毒来源获得。3'utr可以源自与5'utr相同或不同的病毒。在一个示例性实施方案中，病毒3'utr可源自小核糖核酸病毒科，披膜病毒科，双顺反子病毒科，黄病毒科，逆转录病毒科和疱疹病毒科中的至少一种。例如，属于小核糖核酸病毒科的病毒3'utr可源自但不限于肠道病毒属(例如pv，rv，诸如cvb3的柯萨奇病毒，和/或ev71)，心病毒属(例如emcv和/或tmev)，apthovirus属(例如fmdv)，肝病毒属(例如hav)和捷申病毒属(例如诸如ptv-1的ptv)中的至少一种。此外，属于披膜病毒科的病毒3'utr可源自但不限于甲病毒属(alphavirus)(例如sv)，属于双顺反子病毒科的病毒3'utr可能源自但不属于仅限于蟋蟀麻痹病毒属(例如psiv，crpv，锥猎蝽属病毒和/或rxid)。在一个备选的实施方案中，属于黄病毒科的病毒3'utr可以源自但不限于肝炎病毒属(例如hcv)，黄病毒属(例如jev)，黄病毒属(例如jev)和/或瘟病毒属(例如csfv和/或bvdv)。在另一个实施方案中，属于逆转录病毒科的病毒3’utr可以源自但不限于α逆转录病毒属(alpharetrovirus)(例如rsv)，并且属于疱疹病毒科的病毒3'utr可以源自但不限于不限于马立克病毒属(例如mdv)。在一个示例性实施方案中，病毒3'utr可包括但不限于源自sv的3'utr(seqidno:7)，源自cvb3的3'utr(seqidno:8)，源自emcv的3'utr(seqidno:9)和/或源自jev的3'utr(seqidno:10)。此外，本公开的核酸分子可以进一步包含位于表达控制序列(ecs)附近的转录控制序列(tcs)用于促进其转录。例如，转录控制序列(tcs)可以位于表达控制序列(ecs)的上游(5'末端)。这样的转录控制序列(tcs)不限于特定元件，并且将在下面的重组载体部分中更详细地描述。此外，核酸分子还可以是用于诱导在编码区(cr)的orf以及表达控制序列(ecs)，编码区(cr)，3'utr和转录控制序列(tcs)中的表达的其他元件。在一个示例性的实施方案中，核酸分子可具有插入在表达控制序列(ecs)(例如具有ires元件的5'utr)和编码区(cr)的起始密码子之间的kozak序列/元件。如果必要，核酸分子在表达控制序列(ecs)的3'末端进一步包含下游发夹结构(dlp)。例如，当源自sv的5'utr(例如seqidno:1)作为表达控制序列应用时，可以将源自sv的dlp元件或序列(例如seqidno:11)插入5'utr和编码区(cr)之间。在另一个备选的实施方案中，可以将作为起始密码子的核苷酸(例如cctgct)和/或用于增强goi表达的另一个识别序列(例如atggcagctcaa)插入表达控制序列的下游。另外，可以在编码区(cr)或3'utr(如果使用3'utr的情况下)的下游插入多聚腺苷酸化信号序列和/或多聚腺苷序列(pa)，以稳定转录的核酸分子并进一步增强编码区域(cr)中orf的翻译效率。例如，当本发明的核酸分子包含rna转录物核苷酸时，多聚腺苷序列(pa)可包含约25至约400个，优选地约30至约400个，更优选地约50至约250个，最优选地约60至约250个腺苷核苷酸。在又一个示例性实施方案中，如果核酸分子包含dna平台核苷酸，则多聚腺苷酸化信号序列可以位于编码区(cr)的下游。聚腺苷酸化信号序列可以具有5'-nnuana-3'基序的共同结构(其中n是腺嘌呤/腺苷，胞嘧啶/胞苷，胸腺嘧啶/胸苷，鸟嘌呤/尿苷和尿嘧啶/尿苷的任何碱基或核苷酸)。例如，多聚腺苷酸化信号序列可以是共有的结构，例如5'-aauaaa'-3'或5'-auuaaa-3'。例如，多聚腺苷酸化信号序列可以源自但不限于sv40，人生长因子(hgh)，牛生长因子(bgh)和/或兔β-珠蛋白(rbglob)。在图1中，该核酸分子仅具有表达盒(ec)，所述表达盒仅包含一个表达控制序列(ecs)和仅一个编码区(cr)。在不同的实施方案中，本公开的核酸分子可以包含具有ires元件的多个表达控制序列和编码可以由多个表达控制序列中的至少一个表达的肽或蛋白质的多个编码区。图2是示出根据本公开的另一个示例性实施方案的包括多个表达盒或多个表达单元的多核苷酸或核酸分子的组分或元件的示意图。如图2所示，根据本公开的另一个实施方案的核酸分子包含两个表达盒“ec1”和“ec2”。第一表达盒“ec1”包含具有ires元件的第一表达控制序列“ecs1”(例如5’utr1)和可操作地连接至第一表达控制序列“ecs1”并包含orf作为第一目标序列“ts1”的第一编码区“cr1”。第二表达盒“ec2”包含具有ires元件的第二表达控制序列“ecs2”(例如5’utr2)和可操作地连接至第二表达控制序列“ecs2”并包含orf作为第二目标序列“ts2”的第二编码区“cr2”。在一个示例性实施方案中，第二表达控制序列“ecs2”可以位于第一表达控制序列“ecs1”的下游，第一编码区“cr1”可以位于第一表达控制序列“ecs1”和第二表达控制序列“ecs2”之间,且第二编码区“cr2”可以位于第二表达控制序列“ecs2”的下游。在一个示例性实施方案中，每个第一表达控制序列“ecs1”和第二表达控制序列“ecs2”可以具有参考图1的如上文所述的病毒ires元件的5'utr。第一表达控制序列“ecs1”和第二表达控制序列“ecs2”可以具有源自相同来源的病毒ires元件。备选地，第一表达控制序列“ecs1”和第二表达控制序列“ecs2”可具有源自不同来源的病毒ires元件。在一个备选的实施方案中，核酸分子可以进一步包含在邻近例如多个表达控制序列“ecs1”和“ecs2”中至少一个的上游(5'端)插入的多个腺苷或多个胸苷。在图2中，多个腺苷或多个胸苷“ma1/mt1”被插入在与转录控制序列(tcs)相邻的第一表达控制序列“ecs1”的上游，并且另一多个腺苷或多个胸苷“ma2/mt2”被插入在第二表达控制序列“ecs2”的上游。然而，可以各自增强在编码区“cr1”和“cr2”中的各自的orf的多个腺苷或多个胸苷可与第一和第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”中的至少一个相邻插入，优选在其上游。在一个示例性实施方案中，第一和第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”中的至少一个可以包含病毒ires元件。具体地，第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”可包含源自小核糖核酸病毒科，披膜病毒科，双顺反子病毒科，黄病毒科，逆转录病毒科和疱疹病毒科中的至少一种的病毒ires元件。在一个实施方案中，第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”可包含源自小核糖核酸病毒科和双顺反子病毒科中的至少一种的病毒ires元件。例如，包括属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件的第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”可包含源自肠道病毒属，心病毒属，apthovirus属，肝病毒属和捷申病毒属中的至少一个的病毒ires元件，以及源自双顺反子病毒科的病毒ires元件源自蟋蟀麻痹病毒属，优选肠道病毒属。例如，包括属于小核糖核酸病毒科的病毒ires元件的第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”可包含源自肠道病毒属(例如柯萨奇病毒，诸如cvb3)的病毒ires元件和/或来源于心病毒属(例如emcv)的病毒ires元件。在另一个实施方案中，包括属于双顺反子病毒科的病毒ires元件的第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”可包含源自蟋蟀麻痹病毒属(例如psiv和/或crpv)的病毒ires元件。此外，编码区包括位于第一和第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”之间的第一编码区“cr1”和位于第二表达控制序列“ecs2”下游的第二编码区“cr2”。第一和第二编码区“cr1”和“cr2”中的每一个可包含goi的orf或其编码肽或蛋白质的转录物。例如，关于治疗疾病，第一和第二编码区“cr1”和“cr2”中的每一个可包含编码报告肽或蛋白质、标志物或选择肽或蛋白质、抗原和/或肽或蛋白质的orf。在一个示例性实施方案中，第一编码区“cr1”可以可操作地连接至第一表达控制序列“ecs1”(例如5'utr1)，而第二编码区“cr2”可以可操作地连接至第二表达控制序列“ecs2”(例如5'utr2)。在一个示例性实施方案中，在第一编码区“cr1”中作为orf的第一靶序列“ts1”和在第二编码区“cr2”中作为另一个orf的第二靶序列“ts2”中的每一个可以具有编码不同肽或蛋白质的orf。在这种情况下，核酸分子能够表达不同的肽或蛋白质。例如，当第一和第二编码区“cr1”和“cr2”中的每一个包含编码彼此不同抗原或其片段的orf时，包含该分子的核酸分子或重组载体能够表达不同的抗原并且能够被用作预防多种疾病的遗传学疫苗。在另一个实施方案中，当第一和第二编码区“cr1”和“cr2”中的每一个包含编码不同的治疗性肽或蛋白质的orf时，包含该分子的核酸分子或重组载体可以用于治疗或治愈多种疾病。备选地，在第一编码区“cr1”中作为orf的第一靶序列“ts1”和在第二编码区“cr2”中作为另一个orf的第二靶序列“ts2”中的每一个可以具有编码相同的肽或蛋白质的orf。与图1所示的核酸分子相似，图2中所示的包含多个表达控制序列“ecs1”和“ecs2”和多个编码区“cr1”和“cr2”的核酸分子，可包含用于在编码区“cr1”和“cr2”中的每一个的表达的“goi1”和“goi2”的其他核苷酸。例如，当第一和/或第二表达控制序列“ecs1”和“ecs2”包括具有ires元件诸如病毒ires元件的5'utr时，核酸分子可以进一步包含3'utr。3'utr可以位于第二编码区域“cr2”的下游。3'utr可以包含如上所述的病毒3'utr。例如，3'utr可以源自相同的来源，在第一表达控制序列“ecs1”中的5’utr1或第二表达控制序列“ecs2”中的5’utr2中的至少一个。在示例性实施方案中，3'utr可以源自但不限于5'utr1的相同来源。此外，图2中的核酸分子还包含转录控制序列(tcs)，所述转录控制序列与以下各项相邻，优选地在以下各项的上游:第一表达控制序列"ecs1”，在表达控制序列"ecs1”和"ecs2”中的每一个之间的kozak序列和编码序列"cr1"和“cr2”中的每一个。此外，如果需要，核酸分子可进一步包含dlp序列，起始密码子序列和/或识别序列，用于增强表达控制序列“ecs1”和“ecs2”中的每一个的下游的“goi1”和“goi2”的表达。同样，在一个示例性实施方案中，核酸分子可以进一步包含在第二编码区“cr2”(或者如果插入了3'utr则为3'utr)下游的多聚腺苷酸化信号序列或多聚腺苷序列(pa)。图2显示了两个表达控制序列“ecs1”和“ecs2”以及两个编码区“cr1”和“cr2”，该核酸分子可以具有三个或更多个表达控制序列和/或编码区。重组载体和药物应用可以将图1和2中所示的核酸分子插入载体中。载体可具有可操作地连接至该核酸分子的另一种表达控制序列。如果必要，可以将该核酸分子与另一个核酸分子连接，以编码融合的肽或融合的蛋白质。例如，所述载体可以包括但不限于病毒载体、dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体，与cca(阳离子缩合剂(cationiccondensingagents))连接的dna或rna表达载体、与脂质体一起包装的dna或rna表达载体、诸如生产细胞等特定的真核细胞，等等。在一个示例性的实施方案中，解释了本公开的核酸分子以转染到哺乳动物细胞中并表达目的肽或蛋白质。这样的构造对于治疗目的特别有用。在宿主细胞中有许多表达核酸分子的方法，可以采用任何适当的方法。例如，可以将本公开的核酸分子插入病毒载体，诸如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、慢病毒、杆状病毒或其他痘病毒(例如禽痘病毒)等。已经知道将核酸分子(例如dna)插入这种载体的技术。可能插入额外的靶向部分，诸如选择标记基因，以便于容易地鉴定或选择转染细胞和/或编码充当逆转录病毒载体中特定靶细胞受体的配体的基因。靶向可以通过使用特异性抗原的已知方法来进行。对于本公开的目的，使用可商购的并且是本领域已知的多种载体是可能的。选择合适的载体将主要取决于要插入载体中的核酸分子的大小以及用该载体转染的具体的宿主细胞。每个载体根据其功能(外源多核苷酸的扩增和/或表达)和与具有其的具体宿主细胞的相容性而包含各种组分。例如，本公开的重组载体可包含另一种表达控制序列，其可对肽或蛋白质的表达有影响，例如起始密码子，终止密码子，多聚腺苷酸化信号序列，增强子，用于膜靶向或分泌的信号序列等。多聚腺苷酸化序列增加了转录物的安全性并促进了转录物的细胞质转运。增强子序列是相对于转录控制序列位于各个位点的核酸序列，例如，与没有增强子序列的启动子的转录活性相比，促进和增加转录活性。信号序列包括但不限于phoa信号序列、ompa信号序列等(如果宿主细胞是埃希氏菌属(escherichiaspp.)中的细菌)；α-淀粉酶信号序列，枯草杆菌蛋白酶序列等(如果宿主细胞是芽胞杆菌属细菌)；mf-α信号序列，suc2信号序列等(如果宿主细胞是酵母)；和胰岛素信号序列，α-干扰素信号序列，抗体分子信号序列等(如果宿主细胞是哺乳动物)。一类载体是“质粒”，其是指圆形的双链dna环，可以在其中连接额外核酸分子。载体的另一类是噬菌体载体。又另一类载体是病毒载体，其中可以将额外的核酸分子连接到病毒基因组。特定的载体可以自主复制到具有经转染的载体的宿主细胞中(例如，具有细菌复制起点的病毒载体和附加型哺乳动物载体(episomemammalianvector))。其他载体(例如非附加体哺乳动物载体)可以在它们转染宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主细胞的基因组一起复制。此外，特定的载体可以指导与载体可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体(或简称为“重组载体”))。通常，可用于重组dna技术的表达载体以质粒的形式存在。组成型或诱导型启动子可以在本公开中用作转录控制序列(tcs)。被各种可能的宿主细胞识别的多个启动子是本领域众所周知的。可以通过限制性酶消化从供体核酸分子中去除启动子，然后该分离的启动子序列插入选择载体来将选择的启动子与具有包含适当goi的orf的至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”的核酸分子可操作地连接。可以使用天然启动子序列和多个外源启动子两者来指导靶基因的扩增和/或表达。但是，外源启动子通常比天然靶向多肽启动子更优选，因为与天然靶向多肽启动子相比，外源启动子允许被表达的靶基因的大量转录和高产量。此外，当本公开的重组载体是可复制的阻遏载体时，它可以包含复制起点，其是用于起始复制的特定核酸序列。另外，重组载体可包含编码可选择的标志物的序列。可选择的标志物旨在通过载体筛选转染的细胞，且可使用提供可选择的表型(例如药物抗性，营养需求，细胞毒性剂抗性或表面蛋白的表达)的标志物。本发明的载体可以包含本领域常规使用的抗生素抗性基因，例如氨苄青霉素，庆大霉素，羧苄青霉素，氯霉素，链霉素，卡那霉素，遗传霉素，新霉素和四环素抗性基因作为可选择的标志物。筛选转染的细胞是可能的，因为只有表达可选择的标志物的细胞才能在治疗选剂的环境中存活。可选择的标志物的代表性例子可以包含营养缺陷型标志物，ura4，leu1，his3等，但是可以在本发明中使用的可选择的标志物不限于这样的例子。使用本领域已知的任何宿主细胞是可能的，只要该宿主细胞稳定且连续地克隆和表达载体即可。注入宿主细胞的载体可以在细胞中表达，其中获得大量重组肽或蛋白质。例如，当表达载体包括lac启动子时，其可以通过对宿主细胞用iptg处理来诱导基因表达。此外，本公开涉及药物组合物，其包含药学上有效量的核酸分子或基因载体，所述核酸分子或基因载体包括所述核酸分子和药学上可接受的载体。例如，该核酸分子或该基因载体可以用作基因疫苗、基因疗法或佐剂。例如，药物组合物可以包含核酸分子或基因载体，所述核酸分子或基因载体包括该分子作为佐剂，药学上可接受的载体和任选地药学活性成分。在一个示例性的实施方案中，可以将核酸分子直接施用或作为基因递送载体施用给受试者。在一个实施方案中，作为疫苗的药物组合物可以包括核酸分子。在这种情况下，核酸分子可包含至少一个表达控制序列“mcs”、“mcs1”和“mcs2”，其包括病毒ires元件和可操作地连接至少一个表达控制序列mcs”、“mcs1”和“mcs2”并编码肽或蛋白质的至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”，以及任选地在至少一个表达控制序列“mcs”、“mcs1”和“mcs2”的上游的多个腺苷或多个胸苷中的至少一个。例如，作为疫苗的药物组合物中的核酸分子的至少一个表达控制序列“mcs”、“mcs1”和“mcs2”可以包含病毒的5'非翻译区(5’utr)。在这种情况下，核酸分子可以进一步包含位于5'utr的下游的病毒3'非翻译区(3'utr)，并且至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”可以是位于5'utr和3'utr之间。在一个实施方案中，至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”可以编码抗原或其片段，特别是选自由以下组成的组的肽或蛋白:病毒病原体、病毒抗原及其组合。备选地，所述至少一个编码区"cr"、"cr1”和"cr2”编码用于治疗疾病的蛋白质或其片段。备选地，作为疫苗的药物组合物中的核酸分子的至少一个表达控制序列“mcs”可以包含具有第一ires元件(例如5'utr1)第一表达控制序列“mcs1”和位于第一表达控制序列“mcs2”的下游并具有第二ires元件(例如5'utr2)的第二表达控制序列“mcs2”。在这种情况下，所述至少一个编码区(cr)可包括位于第一和第二表达控制序列“mcs1”和“mcs2”之间的第一编码区“cr1”和位于第二表达控制序列“mcs2”下游的第二编码区“cr2”。此外，所述核酸分子可进一步包含在第一表达控制序列"mcs1”和第二表达控制序列"mcs2”中至少一个的上游的多个腺苷或多个胸苷中的至少一个。作为实例，第一表达控制序列“mcs1”可包含源自柯萨奇b病毒或蟋蟀麻痹病毒的第一病毒ires元件，并且所述第二表达控制序列“mcs2”可包含源自脑心肌炎病毒的第二病毒ires元件。如果需要，核酸分子可以进一步包含在至少一个表达控制序列“mcs1”上游的转录控制序列(tcs)，以及在至少一个编码区(cr)的下游的多聚腺苷酸化信号序列或多聚腺苷序列(pa)。优选地，该核酸分子可以具有rna平台。在另一个实施方案中，作为佐剂的药物组合物可以包括核酸分子。在这种情况下，核酸分子可以充当佐剂。作为佐剂的核酸分子可以包含至少一个包含病毒ires元件的表达控制序列“mcs”、“mcs1”和“mcs2”。任选地，作为佐剂的核酸分子可以进一步包含与至少一个表达控制序列“mcs”，“mcs1”和“mcs2”可操作连接并编码肽或蛋白质的至少一个编码区“cr”，“cr1”和“cr2”，以及任选地位于至少一个表达控制序列“mcs”，“mcs1”和“mcs2”上游的多个腺苷或多个胸苷中的至少一个。作为实例，作为佐剂的核酸分子的至少一个表达控制序列“mcs”、“mcs1”和“mcs2”可以包含病毒5'非翻译区(5'utr)。在这种情况下，作为佐剂的核酸分子可以进一步包含位于5'utr的下游的病毒3'非翻译区(3'utr)，并且至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”可以是位于5'utr和3'utr之间。在一个实施方案中，至少一个编码区“cr”、“cr1”和“cr2”可以编码抗原或其片段，特别是选自由以下组成的组的肽或蛋白:病毒病原体、病毒抗原及其组合。备选地，所述至少一个编码区"cr"、"cr1”和"cr2”编码用于治疗疾病的蛋白质或其片段。备选地，作为佐剂的核酸分子的至少一个表达控制序列“mcs”可以包含具有第一ires元件(例如5'utr1)第一表达控制序列“mcs1”和位于第一表达控制序列“mcs2”的下游并具有第二ires元件(例如5'utr2)的第二表达控制序列“mcs2”。在这种情况下，所述至少一个编码区(cr)可包括位于第一和第二表达控制序列“mcs1”和“mcs2”之间的第一编码区“cr1”和位于第二表达控制序列“mcs2”下游的第二编码区“cr2”。此外，作为佐剂的核酸分子可进一步包含在第一表达控制序列"mcs1”和第二表达控制序列"mcs2”中至少一个的上游的多个腺苷或多个胸苷中的至少一个。作为实例，第一表达控制序列“mcs1”可包含源自柯萨奇b病毒或蟋蟀麻痹病毒的第一病毒ires元件，并且所述第二表达控制序列“mcs2”可包含源自脑心肌炎病毒的第二病毒ires元件。如果需要，作为佐剂的核酸分子可以进一步包含在至少一个表达控制序列“mcs1”上游的转录控制序列(tcs)，以及在至少一个编码区(cr)的下游的多聚腺苷酸化信号序列或多聚腺苷序列(pa)。优选地，该核酸分子可以具有rna平台。在一个实施方案中，当将包括该分子的核酸分子或基因递送载体用作疫苗时，药物组合物可进一步包含用于增强疫苗免疫原性的佐剂。此类佐剂可以通过其免疫原性和该成分的其他药学特性来选择。在一个示例性实施方案中，药物组合物被配制成液体，药学上可接受的载体可以包括但不限于无热原的水；和等渗盐水或缓冲(水)溶液，诸如磷酸盐或柠檬酸盐；植物油，诸如花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油和可可果油；二醇，例如丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；和多元醇，例如藻酸。在这种情况下，包括钠盐、钙盐和任选地钾盐的水性缓冲液可用于将液体药物组合物注射入体内。钠盐、钙盐和钾盐可以具有卤化类型(诸如碘或溴)、氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或磺酸盐。当药物组合物配制为固体时，药学上可接受的载体可以包含固体载体(例如固体过滤器，液体过滤器或稀释剂)，并且封装的化合物可以用作用于施用组合物的载体。例如，药学上可接受的载体可以包括但不限于糖(例如乳糖，葡萄糖和蔗糖)；淀粉(例如玉米淀粉或马铃薯淀粉)；纤维素或其衍生物(例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素)；黄芪胶粉；麦芽；明胶；动物脂；固体润滑剂(例如硬脂酸和硬脂酸镁)；和硫酸钙。药学上可接受的载体可以包括水凝胶，经调节的释放装置，经延迟的释放装置，用于注射的聚乳酸和胶原蛋白基质。适用于局部用途的药学上可接受的载体可以包括洗剂，霜剂，凝胶剂及其类似物。如果口服施用该组合物，则片剂，胶囊剂是优选的单位剂型。可以选择药学上可接受的载体作为组合物的施用类型。在一个实施方案中，该组合物可以全身施用。施用途径可包括口服，皮内，静脉内，肌肉内，关节内，滑膜内，鞘内，肝内，病变内，颅内，经皮，皮内，肺内(intrapumonal)，腹膜内，心内，动脉内，舌下局部和/或鼻内给药。药物组合物可以任何方便的类型施用，例如片剂，粉剂，胶囊剂，溶液剂，分散剂，混悬剂，糖浆剂，喷雾剂，栓剂，凝胶剂，乳剂和贴剂。药物组合物可以进一步包含常见的添加剂，例如缓冲剂，稳定剂，表面活性剂，湿润剂，润滑剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂，抗氧化剂，遮光剂，增滑剂，加工助剂，着色剂，甜味剂，香料，调味剂，稀释剂和其他添加剂。此外，药物组合物可以包含任何增强剂，例如细胞毒性剂，细胞因子，化学治疗剂，生长抑制剂或生长增强剂。例如，药物组合物可以包含乳化剂，例如吐温；润湿剂，如十二烷基硫酸钠；着色剂；增味剂；片剂形成剂，稳定剂；抗氧化剂和防腐剂。如上所述，药物组合物可以包含基因递送载体。为了传递和表达核酸分子，装配了基因递送载体。在一个实施方案中，goi的转录物可以在合适的表达构建体内，以装配基因递送载体，并且可以与转录控制序列(例如表达构建体中的启动子)可操作地连接。可操作地连接至goi的启动子可以在动物细胞，优选哺乳动物细胞内起作用，以调节核酸分子的转录，并且可以包含哺乳动物病毒来源的启动子、哺乳动物基因组来源的启动子和噬菌体来源的启动子。例如，启动子可以包含但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子，腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5k启动子，sv40启动子，hsv的tk启动子，t7启动子，t3启动子，sm6启动子，rsv启动子，ef1α启动子，金属硫蛋白启动子，β-肌动蛋白启动子，人il-2基因启动子，人ifn基因启动子，人il-4基因启动子，人淋巴毒素基因启动子，人gm-csf基因启动子，肿瘤细胞特异性启动子(例如tert启动子，psa启动子，psma启动子，cea启动子，e2f启动子和aft启动子)和组织特异性启动子(例如白蛋白启动子)。此外，表达构建体可包含多聚腺苷酸化信号序列(例如牛生长激素终止子和/或sv40衍生的多聚腺苷酸化信号序列)。如果核酸分子用作rna疫苗，则能够ivt的适当转录控制序列(tcs)可位于表达控制序列(ecs)，“ecs1”和(ecs)的上游。由于rna平台的核酸分子可以用作rna疫苗并可以通过ivt方法合成，因此无需处理用于装配普通活疫苗或灭活疫苗的活病毒或病原细菌，也无需培养宿主细胞，诸如用于表达重组肽或蛋白质的酵母、e.coli和/或昆虫细胞。例如，将dna平台的核酸分子插入质粒中，然后通过ivt过程转录为mrna，在该过程中，mrna通过rna聚合酶使用具有通过限制性内切核酸酶切割末端的线性dna而在体外合成，从而产生使用该核酸分子的rna疫苗。来源于噬菌体的转录控制序列(tcs)可以位于表达控制序列(ecs)的上游，用于将线性化的dna转录成rna。例如，转录信号序列(tcs)可以是可以将线性化的dna转录成mrna的任何启动子，并且可以包含但不限于t7噬菌体启动子、t3噬菌体启动子和sp6噬菌体启动子。在一个示例性实施方案中，转录控制序列(tcs)可以邻近表达控制序列(ecs)，优选在其上游。基因递送载体可以用多种形式装配，例如质粒，病毒载体和/或脂质体或含质粒的脂质体(niosome)。在一个实施方案中，可以将goi的转录物应用于任何基因递送系统，例如质粒，腺病毒(lockettl.j.,等,clin.cancerres.3:2075-2080,1997)，腺伴随病毒(aav；lashfordl.s..,等,genetherapytechnologies,applicationsandregulationsed.a.meager,1999)，逆转录病毒(gunzburgw.h.,等,retroviralvectors.genetherapytechnologies,applicationsandregulationsed.a.meager,1999)，慢病毒(wangg.等,j.clin.invest.104(11):r55-62,1999)，单纯疱疹病毒(chamberr.,等,proc.natl.acad.sciusa92:1411-1415,1995)，牛痘病毒(puhlmannm.等,humangenetherapy10:649-657,1999),，脂质体(methodsinmolecularbiology,vol199,s.c.basuandm.basu(eds.),humanpress,2002)和/或脂质体。此外，可以通过已知的各种方法将基因递送载体转染到宿主细胞中。在一个实施方案中，如果基因递送载体是基于病毒载体装配的，则可以根据已知的病毒感染方法转染基因递送载体。在上述文献中描述了使用病毒载体对宿主细胞的感染，在此通过引用将其全部内容并入本文。例如，基因递送系统包含裸露的dna分子或质粒，可以使用显微注射方法(capecchi,m.r.,cell,22:479,1980；harlandandweintraub,j.cellbiol.101:1094-1099,1985)，磷酸钙沉淀法(graham,f.l.等,virology,52:456,1973；以及chenandokayama,mol.cell.biol.7:2745-2752,1987)，电穿孔方法(neumann,e.等,emboj.,1:841,1982；andtur-kaspa等,mol.cellbiol.,6:716-718(1986))，脂质体介导的转染方法(wong,t.k.等,gene,10:87,1980；nicolauandsene,biochim.biophys.acta,721:185-190,1982；以及nicolau等,methodsenzymol.,149:157-176,1987)，deae-葡聚糖处理方法(gopal,mol.cellbiol.,5:1188-1190,1985)和基因轰击(yang等,proc.natl.acad.sci.,87:9568-9572,1990)的任一种将其转染到宿主细胞中，所述文献每一个均通过引用整体并入本文。在一个示例性实施方案中，核酸分子和/或包括该分子的基因递送载体可以用作佐剂。例如，可以使用阳离子聚合物、阳离子肽或阳离子多肽将核酸分子稳定在药物组合物中。作为稳定剂的阳离子(多)肽可包含多种阳离子聚合物，例如聚赖氨酸和聚精氨酸，阳离子脂质或脂质转染剂(lipofectants)。更具体地，稳定剂可包括但不限于组蛋白，核仁蛋白，鱼精蛋白，寡转染胺，精胺或亚精胺，以及阳离子多糖，特别是壳聚糖，tdm，mdp，胞壁酰二肽，普流罗尼类(pluronics)和/或其衍生物。组蛋白和鱼精蛋白是为天然致密dna的阳离子蛋白。作为可以在本公开的上下文中用于与作为佐剂的核酸分子形成复合物的组蛋白可以由组蛋白h1，h2a，h3和h4制成。另外，作为可以在本公开的上下文中用于与核酸分子形成复合物的鱼精蛋白可由鱼精蛋白p1或p2或鱼精蛋白的阳离子部分序列制成。如果必要，可以与核酸分子形成复合物的其他化合物可以是另外使用的另一种佐剂。作为佐剂的核酸分子可诱导非抗原特异性免疫应答。t淋巴细胞分化为t辅助1(th1)细胞和t辅助2(th2)细胞，免疫系统能够通过th1细胞破坏细胞内病原体(例如抗原)并通过th2细胞破坏细胞外病原体。th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性t细胞来帮助细胞介导的免疫应答，而th2细胞通过增强b细胞用于转化进细胞质细胞并通过形成针对抗原的抗体来促进体液免疫应答。因此，th1细胞/th2细胞在免疫应答中的比例非常重要。核酸分子能够增强和诱导th1免疫应答，即细胞介导的免疫应答。在一个示例性的实施方案中，当将核酸分子与药物活性成分(例如，免疫增强组分)一起注射入体内时，核酸分子可以作为增强由药物活性成分诱导的特异性免疫应答的佐剂。因此，药物组合物可以包含药物活性成分以及作为佐剂的核酸分子。在一个示例性的实施方案中，药物活性成分可以是免疫增强剂，例如免疫原。例如，药物活性成分可以包含治疗和/或预防癌症，传染病，自身免疫性疾病和/或变态反应的化合物。在一个实施方案中，药物活性成分可包含但不限于肽，蛋白质，核酸，治疗活性的低分子有机或无机化合物，糖，抗原或抗体，本领域已知的治疗剂，抗原细胞，抗原细胞的片段，细胞碎片、化学或光辐照修饰的病原体(包括病毒或细菌)，诸如减毒或灭活的病原体。例如，作为药物活性成分的抗原可以是肽，多肽，蛋白质，细胞，细胞提取物，多糖，复合多糖，脂质，糖脂和碳水化合物。作为药物活性成分的抗原可以包括但不限于肿瘤抗原，动物抗原，植物抗原，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原，自身免疫抗原和/或过敏性抗原，它们各自可以从编码区“cr”、“cr1”和“cr2”表达。例如，抗原可能具有肿瘤细胞、病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体和/或原生动物病原体的表面抗原的分泌形式。如果必要，抗原可以在根据本公开内容的核酸分子中，也可以作为与适当载体结合的半抗原。可以使用其他抗原成分，例如灭活的或减毒的病原体。在另一个示例性实施方案中，可以将抗体，优选治疗有效的抗原用作药物活性成分。例如，针对癌症或传染性疾病的抗体，例如细胞表面蛋白，从肿瘤抑制基因或抑制剂基因表达的肽或蛋白，生长因子或延伸因子，凋亡相关蛋白，肿瘤抗原和上述抗原，蛋白或核酸可以优选用作药物活性成分。这样的抗原和/或抗体如上所述。例如，在将抗原用作药物活性成分的情况下，可以将该药物组合物用作疫苗，或者在将抗体用作药物活性成分的情况下，将该药物组合物用作疾病治疗剂。在一个示例性实施方案中，当编码区“cr”，“cr1”和“cr2”编码用作佐剂的核酸分子中的抗原，抗体及其片段时，药物活性成分可以是抗原，抗体及其片段。例如，药物活性成分可包含但不限于mers-cov的刺突肽(seqidno:20)，hpv的l1区域，例如hpv(诸如hpv-6,hpv-11,hpv-16,fhpv-18,hpv-31,hpv-33,hpv-35,hpv-45,hpv-52和/或hpv-58)的l1区域，流感病毒的表面抗原，诸如血细胞凝集素，例如ipr8(流感a/波多黎各/08/34；seqidno:24)，其片段和其等同物。药物组合物的量可以使用动物模型通过常规实验确定。这样的动物模型可以包括但不限于兔子，绵羊，小鼠，狗和非人灵长类动物。如果必要，药物组合物可以进一步包含至少一种辅助物质，以进一步提高由药物活性成分和/或作为佐剂的核酸分子诱导的免疫原性。例如，允许树突细胞(dc)成熟的物质，例如脂多糖，tnf-α或cd40配体，形成了这种辅助物质。通常，可以使用任何以“危险信号”(lps，gp96等)或细胞因子(例如gm-cfs)的方式影响免疫系统的试剂作为辅助物质，从而允许由该核酸分子产生的免疫应答。如果必要，药物组合物可以进一步包含额外的佐剂以及作为主要佐剂的核酸分子。额外的佐剂增强了药物活性成分和/或核酸分子的免疫学活性。在这种情况下，核酸分子与额外的佐剂结合。用于这些目的的合适试剂或佐剂尤其是那些(通过一种或多种机制)增强核酸分子的生物学特性的那些化合物。作为阳离子或聚阳离子化合物特别优选的是选自由以下各项组成的组的化合物:鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺，亚精胺，寡精氨酸，如上定义的，诸如arg7,arg8,arg9,arg7,h5r9,r9h5,h5r9h5,yssr9ssy,(rkh)4,y(rkh)2r等。此外，任何已知因其对以下toll样受体的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激性的化合物:tlr1,tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr6,tlr7,tlr8,tlr9,tlr10,tlr11,tlr12或tlr13可以合适地用作进一步刺激由本发明药物组合物中本发明的核酸诱导的免疫应答的其他组分。可以添加到本公开的药物组合物中的另一类化合物是cpg核酸，特别是cpg-rna或cpg-dna。cpg-rna或cpg-dna可以是单链cpg-dna(sscpg-dna)，双链cpg-dna(dsdna)，单链cpg-rna(sscpg-rna)或双链cpg-rna(dscpg-rna)。cpg核酸优选为cpg-rna的形式，更优选为单链cpg-rna(sscpg-rna)的形式。cpg核酸优选包含至少一个或更多个(促有丝分裂的)胞苷(胞嘧啶)/鸟嘌呤二核苷酸序列(cpg基序)。根据第一个优选的备选方案，这些序列中包含的至少一个cpg基序，即cpg基序的c(胞苷(胞嘧啶))和g(鸟嘌呤)，是未被甲基化的。这些序列中任选包含的所有其他胞苷(胞嘧啶)或鸟嘌呤可以是被甲基化的或未被甲基化的。然而，根据另一个优选的备选方案，cpg基序的c(胞苷(胞嘧啶))和g(鸟嘌呤)也可以甲基化形式存在。当核酸分子与另一佐剂混合时，混合比例没有特别限制。例如，可以将核酸分子与额外的佐剂以按重量计约100:1至约1:100，优选地约10:1至约1:10，更优选地约5:1至约1:5，最优选约3:1至1:3的比例混合。另外，作为佐剂的核酸分子的含量或浓度没有特别限定。特别地，当使用rna平台的核酸分子时，其可以在体内快速降解，从而获得改善的安全性和稳定性。在一个示例性的实施方案中，核酸分子可以以约1至约1000μg/ml，优选约10至约1000μg/ml的浓度包含在药物组合物中。在另一个实施方案中，药物组合物可以疫苗的形式提供。疫苗组合物可以包含免疫增强物质作为药物活性成分，其诱导针对特定抗原的调节的免疫应答。这种调节的免疫应答引起个体发展由针对特定病原体或特定肿瘤的主动或被动模式诱导的适应性免疫应答。疫苗作为药物组合物可用于治疗以下疾病和/或病症。作为疫苗的药物组合物可以用于治疗和/或预防肿瘤特异性疾病或病原体特异性疾病，感染疾病，过敏性疾病和/或自身免疫性疾病或病症。用于适当的免疫应答的重要因素是不同的t细胞亚群的刺激。t淋巴细胞通常分化为两个亚群，即t辅助细胞1(th1)和t辅助细胞2(th2)，用它们免疫系统能够破坏细胞内(th1)和细胞外(th2)病原体(例如抗原)。两个t辅助(th)细胞群体在它们产生的效应蛋白(细胞因子)的模式上有所不同。因此，th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性t细胞来辅助细胞免疫应答。另一方面，th2细胞通过b细胞的刺激转化为浆细胞并通过(例如针对抗原的)抗体的形成来促进体液免疫应答。因此，th1/th2比例在免疫应答中非常重要。在一个示例性的实施方案中，核酸分子可以刺激或增强th1免疫应答。在一个示例性实施方案中，药物组合物可用于诱导肿瘤特异性或病原体特异性免疫应答。在另一个示例性的实施方案中，包含核酸分子的药物组合物可以用于治疗传染病，但不限于诸如流感，疟疾，sars，黄热病，aids等。在又一个示例性的实施方案中，药物组合物可以用于制备用于治疗变态病症或疾病的药物。变态反应是通常涉及对某些外来抗原或变应原的异常的获得性免疫超敏反应的病况。变态反应通常导致对这些抗原或变应原的局部或全身性炎症反应，并导致在机体中针对这些变应原的免疫力。在这种情况下，变应原包括例如草，花粉，霉菌，药物或许多环境诱因等。不受理论的束缚，几种不同的疾病机制被认为与变态反应的发展有关。根据p.gell和r.coombs的分类方案，“变态反应”一词仅限于i型超敏反应，这是由经典ige机制引起的。i型超敏反应的特征是ige过度激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，导致可能导致全身性炎症反应，该全身性炎症反应导致流鼻涕等良性症状，至危及生命的过敏性休克和死亡。众所周知的变态反应的类型包括但不限于过敏性哮喘(导致鼻粘膜肿胀)，过敏性结膜炎(导致结膜发红和瘙痒)，过敏性鼻炎(“花粉症”)，过敏反应，血管性水肿(angiodema)，特应性皮炎(湿疹)，荨麻疹(麻疹)，嗜酸性粒细胞增多，呼吸道，对昆虫叮咬的变态反应，皮肤变态反应(导致并包括各种皮疹，如湿疹，麻疹(荨麻疹)和(接触性)皮炎)，食物变态反应，对药物变态反应之类的。例如，本公开的药物组合物可以治疗和/或预防源自变应原或作为蛋白质(例如猫变应原，粉尘变应原，螨虫抗原，植物抗原(例如桦木抗原)等)的过敏性病症或疾病。药物组合物可以将超出的免疫应答转变为更强的th1应答，从而抑制或减弱不想要的ige应答。在又一个实施方案中，药物组合物可用于制备用于治疗自身免疫疾病的药物。根据每种疾病的主要临床病理特征，自身免疫性疾病可大致分为全身性和器官特异性或局部性自身免疫性病症。可以通过药物组合物治疗或预防的自身免疫疾病可以分为全身综合征的类别，包括sle，舍格伦综合征，硬皮病，类风湿关节炎和多肌炎或可能是以下的局部综合征:内分泌病(dm1型，桥本甲状腺炎，艾迪生氏病等)，皮肤病学的(寻常性天疱疮)，血液病学的(自身免疫性溶血性贫血)，神经的(多发性硬化症)或实际上能够涉及任何限定团块(circumscribedmass)的身体组织。待治疗的自身免疫疾病可以选自由以下各项组成的组:i型自身免疫疾病或ii型自身免疫疾病或iii型自身免疫疾病或iv型自身免疫疾病，例如多发性硬化症(ms)，类风湿性关节炎，糖尿病，i型糖尿病(diabetesmellitus)，系统性红斑狼疮(sle)，慢性多发性关节炎，basedow病，慢性肝炎的自身免疫性形式，溃疡性结肠炎，i型变态反应疾病，ii型变态反应疾病，iii型变态反应疾病，iv型变态反应疾病，纤维肌痛，脱发，bechterew病，克罗恩病，重症肌无力，神经性皮炎，风湿性多肌痛，进行性全身性硬化症(pss)，牛皮癣，赖特氏综合征，风湿性关节炎，牛皮癣，血管炎等，或ii型糖尿病。根据另一个方面，本公开涉及一种刺激，增强或诱导免疫应答的方法，该方法包括将治疗有效量的核酸分子和/或包括该核酸分子的基因递送载体施用至受试者。如果必要，可以将核酸分子和/或基因递送载体与药学上可接受的载体和/或在药学或医学领域中通常使用的额外的添加剂一起施用。实施例1:rna平台的核酸分子的装配装配了一个包括源自辛德比斯病毒(sv)的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。设计了具有以下有序序列的模板dna:5'-kpni识别位点(ggtacc)-t7启动子(seqidno:14)-sv5'utr(seqidno:1)作为ires元件-nsp1中的dlp结构(seqidno:11)-bamhi识别位点和kozak序列(ggatccgacc)-作为orf的海肾萤光素酶(r/l)(seqidno:16)-ecorⅴ-saci-ecori识别位点(gatatcgcgagcgaattc)-sv3'utr(seqidno:7)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3’。使用正向和反向引物扩增海肾萤光素酶编码序列，该引物覆盖了用于将mcs插入每个rna平台的限制性位点。使用限制性核酸内切酶(newenglandbiolabs,usa)将goi插入rna平台的mcs中。使用大肠杆菌dh5α感受态细胞进行质粒制备，并通过限制性酶切图谱和直接dna测序检查所有质粒克隆(cosmogenetech，韩国)。使用labopass质粒微型纯化试剂盒，根据制造商的说明(cosmogenetech)，获得了转染级质粒。将模板dna克隆到pgh载体中，并使用限制性核酸内切酶线性化。使用ribomax大规模rna生产系统t7(美国promega)进行体外转录(ivt)。为了进行体外转录，所有平台均用noti线性化。转录反应包含3μgnoti切割质粒dna，t7转录缓冲液(5х)，25mmrntp，无核酸酶的水和t7酶混合物，并在37℃下温育4小时。将转录物与每1μg质粒dna1μl无rnase的dnasei(promega)在37℃下温育15分钟，然后在65℃温育10分钟以终止反应。根据制造商的说明书，始终使用高产量rna超纯化试剂盒(中国台湾rbc)(promega)进行dnasei处理以去除rna纯化过程中的任何dna污染。使用nanodrop-2000分光光度计(thermofisher-scientific，美国)评价dna和rna的纯度和浓度。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pnon-sv-r/l”。实施例2:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是经历arca反应并使用以下有序模板dna，装配了包括源自柯萨奇b病毒(cvb3)的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-cvb35'utr(seqidno:2)作为ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-sali识别位点和kozak序列(gtcgacgacc)-r/l作为orf(seqidno:16)-sacⅱ-pvui识别位点(ccgcggcgatcg)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在体外转录后，通过arca反应处理模板dna，以将其在rna序列的5'末端加帽。对于加帽的转录物，包括40mm3'-o-me-m7g,(5')ppp(5')gacra，将rgtp的浓度降至3mm。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcap-cvb3-r/l”。实施例3:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是使用以下有序模板dna，装配了包括源自脑心肌炎病毒(emcv)的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-ecori识别位点(gaattc)-t7启动子(seqidno:14)-emcv5'utr(seqidno:3)作为ires元件-bamhi识别位点和kozak序列(ggatccgacc)-r/l作为orf(seqidno:16)-sacⅱ-pvui识别位点(ccgcggcgatcg)-emcv3'utr(seqidno:9)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'.在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pemcv-r/l”。实施例4:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是经历arca反应并使用以下有序模板dna，装配了包括源自日本脑炎病毒(jev)的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-kpni识别位点(ggtacc)-t7启动子(seqidno:14)-jev5'utr(seqidno:5)作为ires元件-部分jev核心(seqidno:13)-bamhi识别位点和kozak序列(ggatccgacc)-r/l作为orf(seqidno:16)-sacⅱ-pvui识别位点(ccgcggcgatcg)-jev3'utr(seqidno:10)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。如实施例2那样，用arca反应处理模板dna。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcap-jev-r/l”。实施例5:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是使用以下有序模板dna，装配了使用源自蟋蟀麻痹病毒(crpv)的ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-kpni识别位点(ggtatc)-t7启动子(seqidno:14)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-起始密码子(cctgct)-r/l作为orf(seqidno:16)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-r/l”。比较例1:rna平台的核酸分子的装配根据wo2015/101414(转让给curevacag)，通过重复与实施例1相同的过程，不同的是经历arca反应并使用以下有序模板dna，装配了包括源自人核糖体蛋白的真核utr的帽依赖rna平台的人工核酸分子:5'-kpni识别位点(ggtacc)-t7启动子(seqidno:14)-人核糖体蛋白大325'utr(seqidno:26)-接头序列((aagcttgagg)-bamhi识别位点和kozak序列(ggatccgacc)-r/l作为orf(seqidno:16)-ecori识别位点(gaattc)-接头序列(gactagt)-人核糖体蛋白小93'utr(seqidno:27)-接头序列(agatct)-polya64-接头序列(atgcatc)-组蛋白茎-环序列(seqidno:28)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。如实施例2那样，用arca反应处理模板dna。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcap-curevac-r/l”。实验例1:核酸分子表达效率的测量rna平台的实施例1-5(pnon-sv-r/l,pcap-cvb3-r/l,pemcv-r/l,pcap-jev-r/l和pcrpv-r/l)和比较例(pcap-curevac-r/l)中的每种核酸分子被转染到人肌细胞a204和人胚肾细胞293t中。人a204横纹肌肉瘤细胞和人293t胚肾细胞获自koreancelllinebank(韩国)。将a204细胞保持在补充有10％胎牛血清(fbs；gibco)和1％抗生素(aas，gibco)的mccoy's5a培养基(gibco，thermofisherscientific)中。将293t细胞维持在含有10％fbs和1％氨基酸的dulbecco改良的eagle培养基(hyclone，gehealthcare，uk)中。将所有细胞用5％co2保持在37℃的湿润气氛中。对于萤光素酶测定，将2x105细胞的等分试样接种到48孔板中，并在37℃下培养24小时，然后在转染前用缺少fbs的培养基替换培养基。根据制造商的说明书，使用lipofectamine2000(invitrogen,thermofisherscientific)转染试剂在80％-90％融合度转染细胞。在测定中，将500ngrna(r/l)，5ng质粒dna(f/l，来自prof.yoonhw,medicalcenter,seouluniversity)和1.25μg的lipofectamine与每孔50μl的opti-mem培养基(gibco)混合并在室温下温育5分钟。随后，将稀释的rna和dna与稀释的lipofectamine混合，在室温下温育15分钟，然后共转染到准备的48孔板中。另外，引入1μg对照绿色荧光蛋白质粒以标准化转染效率。转染24小时后收获细胞，并使用双重萤光素酶测定法(promega)进行萤光素酶测定。如制造商所描述的制备所有试剂。5x被动裂解缓冲液(plb)由制造商提供，用于细胞裂解。简而言之，将细胞重悬于80μl/孔的1xplb中。使裂解持续15分钟后，将每种裂解液的20μl转移到96孔白色测定板(corningcostarcorp.,usa)，并使用glomaxdiscover系统(promega)进行测量。将等分试样的100μl萤火虫萤光素酶(f/l)试剂(larii)加入测试样品中，并测量发光度；然后添加100μl海肾萤光素酶试剂和萤火虫萤光素酶淬灭试剂(stop&glo；promega)，以10秒的积分时间测量发光。数据报告为萤火虫与海肾萤光素酶活性的比例。此比例由对照rna(pcap-curevac-r/l)的结果除以从其他rna平台获得的结果生成。结果表示为至少三个独立重复的平均相对光单位和标准差(sd)。为了评估各个治疗组之间萤光素酶活性和mrna表达水平差异的统计显著性，使用kruskal-wallis检验分析了结果，然后使用bonferronipost-hoc检验对多个组进行比较。<0.05的两尾p值被认为具有统计学显著性。数据表示为平均值±sd。使用sas软件(v,9.4；sasinstitute,cary,usa)对数据进行统计分析。图3a和3b示出r/l在a204细胞和293t细胞中的表达水平。如图3a和3b中所示，pemcv-r/l具有更好的表达效率，其在a204和293t细胞中均具有帽依赖性表达平台pcap-curevac-r/l。而且，与pcap-curevac-r/l相比，pcrpv-r/l显示出略低或相似的表达模式。综上所述，至少当与商业开发的pcap-curevac-r/l表达系统相比时，受病毒ires元件(特别是来自emcv5'utr和crpv5'igr的那些)控制的rna表达平台并不逊色于帽依赖性rna表达平台。实施例6:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例2相同的过程并使用与实施例2相同的模板dna，不同的是不进行arca反应，装配了包括源自cvb3的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcvb3-r/l”。实施例7:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例6相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和cvb35'utr之间的多个腺苷(ma-50)的模板dna，制造了包括源自cvb3的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个腺苷(ma-50)-cvb35'utr(seqidno:2)作为ires元件-表达增强序列(atggcagctcaa)-ecori识别位点和kozak序列(gaattcgacc)-r/l作为orf(seqidno:16)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-cvb3-r/l”。实验例2:核酸分子表达效率的测量实施例2(pcap-cvb3-r/l)，实施例6(pcvb3-r/l)，实施例7(pma-cvb3-r/l)和比较例1(pcap-curevac-r/l)的每种核酸序列均被转染到人肌细胞a204中。以与实验例1相同的过程测量细胞系中海肾萤光素酶(r/l)的表达水平。图4示出了a204细胞中r/l的表达水平。如图4所示，与不带有多个腺苷的cvb3ires(pcvb3-r/l)相比，在cvb3ires(pma-cvb3-r/l)的5'末端添加多个腺苷提高了ires依赖性翻译的效率。此外，与结合帽的cvb3ires(pcap-cvb3-r/l)相比，在cvb3ires(pma-cvb3-r/l)的5'末端添加多个腺苷导致更好的表达水平。实施例8:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是使用以下有序模板dna，制造了包括源自cvb3和emcv的多个病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-hpai识别位点(gttaac)-多个腺苷(ma-50)-hpai识别位点(gttaac)-cvb35'utr(seqidno:2)作为第一ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-r/l作为第一orf(seqidno:17)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-r/l作为第二orf(seqidno:16)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-cvb3-r/l-emcv-r/l”。实施例9:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例1相同的过程，不同的是使用以下模板dna，制造了包括源自crpv和emcv的多个病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-pmei识别位点(gtttaaac)-crpvigrires(seqidno:6)作为第一ires元件-起始密码子(cctgct)-ecori识别位点(gaattc)-r/l作为第一orf(seqidno:17)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-r/l作为第二orf(seqidno:16)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-r/l-emcv-r/l”。实施例10:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例8相同的过程，不同的是使用萤火虫萤光素酶orf(f/l)作为第二个orf外，制造了包括源自cvb3和emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-hpai识别位点(gttaac)-多个腺苷(polya-50)-hpai识别位点(gttaac)-多个腺苷(ma-50)-hpai识别位点(gttaac)-cvb35'utr(seqidno:2)作为第一ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-ecori识别位点和kozak序列(gattcgacc)-r/l作为第一orf(seqidno:17)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-f/l作为第二orf(seqidno:18)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-cvb3-r/l-emcv-f/l”。实施例11:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例9相同的过程，不同的是使用萤火虫萤光素酶orf(f/l)作为第二个orf外，制造了包括源自crpv和emcv的多个病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下序列:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-pmei识别位点(gtttaaac)-crpvigrires(seqidno:6)作为第一ires元件-起始密码子(cctgct)-ecori识别位点(gaattc)-r/l作为第一orf(seqidno:17)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-f/l作为第二orf(seqidno:18)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-r/l-emcv-f/l”。实验例3:核酸分子表达效率的测量将实施例8至9(pma-cvb3-r/l-emcv-r/l,和pcrpv-r/l-emcv-r/l)和比较例1(pcap-curevac-r/l)中的每种核酸分子均转染到293t细胞和小鼠nor10肌肉成纤维细胞中。小鼠nor10肌肉成纤维细胞获自koreancelllinebank(韩国)。将293t细胞和nor10成纤维细胞维持在含有10％fbs和1％氨基酸的dulbecco改良的eagle培养基(hyclone，gehealthcare，uk)中。以与实验例1相同的过程测量细胞系中海肾萤光素酶(r/l)的表达水平。图5示出了295t细胞中r/l的表达水平。如图5中所示，在293t细胞中pma-cvb3-r/l-emcv-r/l显示远高于crpv-r/l-emcv-r/l的表达水平，甚至高于pcap-curevac-r/l的表达水平。此外，在293t细胞中pcrpv-r/l-emcv-rl显示出了高于pcap-curevac-r/l的表达水平。然后，将实施例5(pcrpv-r/l0，实施例7(pma-cvb3-r/l)，实施例10至11(pcrpv-r/l-emcv-f/l和pma-cvb3-r/l-emcv-f/l)中的每个核酸分子均转染到293t细胞小鼠nor10肌肉成纤维细胞中。小鼠nor10肌肉成纤维细胞获自koreancelllinebank(韩国)。将293t细胞和nor10成纤维细胞维持在含有10％fbs和1％氨基酸的dulbecco改良的eagle培养基(hyclone，gehealthcare，uk)中。以与实验例1相同的过程测量细胞系中海肾萤光素酶(r/l)的表达水平。图6a和6b示出在295t细胞和nor10细胞中r/l和f/l的表达水平。如图6a和6b中所示，来自pcrpv-r/l-emcv-f/l和pma-cvb3-r/l-emcv-f/l的r/l的表达与从pcrpv-r/l和pma-cvb3-r/l观察到的r/l的表达没有显著性差异。然而，在nor10和293t细胞中，在pcrpv-r/l-emcv-f/l中受emcvires调控的f/l表达水平高于在pcrpv-r/l-emcv-f/l中的表达水平。实施例12:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例7相同的过程，不同的是使用仅包含多克隆位点(mcs)而不包含orf(r/l)的模板dna，装配了包括源自cvb3的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个腺苷(ma-50)-cvb35'utr(seqidno:2)作为ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-ecori-clai-paci-saci识别位点的mcs(gaattcatcgatttaattaagagctc)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-cvb3”。实施例13:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例3相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和emcv5'utr之间的多个腺苷(ma50)和只有mcs而没有orf(r/l)的模板dna，制造了包括源自emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-ecori识别位点(gaattc)-t7启动子(seqidno:14)-多个腺苷(ma-50)-emcv5'utr(seqidno:4)作为ires元件-bamhi-clai-paci-saci识别位点的mcs(ggatccatcgatttaattaagagctc)-emcv3'utr(seqidno:9)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-emcv”。实施例14:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例5相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和crpvigrires之间的多个腺苷(ma-50)和只有mcs而没有orf(r/l)的模板dna，装配了包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个腺苷(ma-50)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-bamhi-ecori-paci-saci识别位点的mcs(ggatccgaattcttaattaagagctc)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-crpv”。实施例15:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例12相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和emcv5'utr之间的多个胸苷(mt-50)的模板dna，制造了包括源自cvb3的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个胸苷(mt-50)-cvb35'utr(seqidno:2)作为ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-ecori-clai-paci-saci识别位点的mcs(gaattcatcgatttaattaagagctc)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pmt-cvb3”。实施例16:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例13相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和emcv5'utr之间的多个胸苷(mt-50)的模板dna，装配了包括源自emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-ecori识别位点(gaattc)-t7启动子(seqidno:14)-多个胸苷(mt-50)-emcv5'utr(seqidno:4)作为ires元件-bamhi-clai-paci-saci识别位点的mcs(ggatccatcgatttaattaagagctc)-emcv3'utr(seqidno:9)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pmt-emcv”。实施例17:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例14相同的过程，不同的是使用包含插入在t7启动子和crpvigrires之间的多个胸苷(mt-50)的模板dna，装配了包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个胸苷(mt-50)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-bamhi-ecori-paci-saci识别位点的mcs(ggatccgaattcttaattaagagctc)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pmt-crpv”。实施例18:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例6相同的过程，不同的是使用仅包含多克隆位点(mcs)而不包含orf(r/l)的模板dna，装配了包括源自cvb3的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-cvb35'utr(seqidno:2)作为ires元件-表达增强子序列-sali-ecorⅴ-sacⅱ-pvui识别位点的mcs(gtcgacgatatcccgcggcgatcg)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcvb3”。实施例19:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例3相同的过程，不同的是使用仅包含多克隆位点(mcs)而不包含orf(r/l)的模板dna，装配了包括源自emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-ecori识别位点(gaattc)-t7启动子(seqidno:14)-emcv5'utr(seqidno:4)作为ires元件-bamhi-saci-sali-pvui识别位点的mcs(ggatccccgcgggtcgaccgatcg)-emcv3'utr(seqidno:9)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“p-emcv”。实施例20:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例5相同的过程，不同的是使用仅包含多克隆位点(mcs)而不包含orf(r/l)的模板dna，装配了包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-多个胸苷(mt-50)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-bamhi-ecori-paci-saci识别位点的mcs(ggatccgaattcttaattaagagctc)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv”。实验例4:核酸分子的免疫测定使用实施例12至20中合成的核酸分子进行免疫测定，以研究rna平台的分子作为佐剂。对6周龄的c57bl/6小鼠通过肌内注射，以1周的间隔接种2次，分别接种20μgmers刺突(s)可溶性蛋白疫苗(seqidno:21；skbioscience，韩国)和明矾120μg，含或不含下表1所示的5μg的每种核酸分子。[表1]rna和mers蛋白的制剂在第二次免疫后两周，取所有实验小鼠的血液样品，并使用elisa测量收集的小鼠血清中的igg1和igg2c。通过elisa测量小鼠血清中的抗原特异性igg1和igg2c。将96孔板用50ng/孔mers刺突可溶性蛋白疫苗于4℃包被过夜。温育后，将该孔用200μl封闭缓冲液(pbs-1％bsa)在室温下封闭1小时。将稀释的血清样品加入板中，并在室温下温育1小时。温育后，将孔用200μlpbs-t(pbs-0.05％吐温20)洗涤3次。将在pbs中以1/1000-1/10000稀释的抗小鼠igg1和igg2c-hrp(分别为bethyl，invitrogen和novus)加入板中，并在室温下温育1小时。用pbs-t洗涤3次后，加入tmb底物并温育15分钟，然后使用2nh2so4终止反应。使用glomaxexplorer817酶标仪(promega)在450nm下测量o.d.值。如图7中所示，明矾配制组(g3)和明矾和rna配制组(g4-g12)中的igg1水平(其主要指示th2免疫应答)高于仅merss可溶性蛋白组(g2)。这意味着仅包含病毒ires元件而没有任何编码区的核酸分子可以充当诱导th2免疫应答即体液免疫应答的免疫刺激剂。相反，如图8中所示，明矾和rns配制组，尤其是g6(明矾+pma-crpv)，g7(明矾+pmt-cvb3)，g10(明矾+pcvb3)和g12(明矾+pcrpv)中的igg2c水平(其主要指示th1免疫应答)高于仅有明矾的配制组(g3)。考虑到图7和8中的结果，仅包含病毒ires元件而没有任何编码区的核酸分子可以充当这样的免疫刺激剂:其通过th1免疫应答和th2免疫应答诱导t细胞活化，并显示出优异的佐剂性。实验例5:核酸分子的免疫测定进行了使用实施例5中的核酸分子(pcrpv-r/l)的免疫测定，以研究作为佐剂等免疫刺激成分的分子。雌性c57bl/6小鼠购自dae-hanbio-link(韩国)。将来自c57bl/6小鼠的骨髓细胞以3x107细胞/ml置于100mm细胞培养皿中的树突状细胞(dc)条件培养基中，该条件培养基由补充有10％热灭活的fbs(lifetechnologies)、2.05mll-谷氨酰胺(hyclone)的rpmi(hyclonelaboratories)和含有10ng/ml重组鼠gm-csf(bdpharmingen)、1ng/ml重组鼠il-4(bdpharmingen)和0.05mmβ-巯基乙醇的抗-抗溶液(gibco)组成。在第3天和第6天更换一半的dc培养基，并在第7天收获细胞。在第7天mbmdc完全分化，然后将5x106细胞/mlmbmdc再次分配至孔板。用鱼精蛋白(sigmaaldrich)以2:1的比例配制rna，即pcrpv-r/l，然后用鱼精蛋白配制的pcrpv-r/l处理完全分化的mbmdc，以使用免疫测定法分析由此分泌的细胞因子。pbs(磷酸缓冲盐水)处理的mbmdc，lps(脂多糖)处理的mbmdc和仅鱼精蛋白处理的mbmdc被用作对照，如下表2所示。[表2]rna的配制组g1g2g3g4lps-+--pcrpv-r/l---+鱼精蛋白--++如下进行流式细胞术分析:对于表面染色，mbmdc在室温下用以下抗体染色15分钟:cd40-apc(克隆1c10)，cd80-pe(克隆16-10a1)和cd86(克隆gl1)。使用facsaccuri流式细胞仪(bdbioscience)分析染色的细胞。如图9a至9c中所示，g4(用鱼精蛋白配制的pcrpv-r/l)激活树突状细胞，例如cd11c+cd40+细胞、cd11c+cd80+和cd11c+cd86+细胞。依照制造商的方案，使用elisa试剂盒(ebiosceince针对il-6且il-12并且invitrogen针对tnf-α)进行elisa测定，以测量培养上清液中的细胞因子水平。如图10a和10b所出的，g4(用鱼精蛋白配制的pcrpv-r/l)激活il-12和il-6的分泌，其中il-12和il-6的每一个是与th1免疫应答相关的细胞因子。此外，进行图像处理以研究通过接种用鱼精蛋白配制的核酸分子的组织变化。使用激光扫描活体内共聚焦显微镜(ivm-c，ivimtechnology)对小鼠的肾脏组织、肺组织、脾脏组织和肝组织进行可视化。如图11所示，用核酸分子处理的小鼠组织内没有炎症。这意味着该核酸分子在宿主中快速降解并具有高的稳定性，尽管它像lps一样激活了免疫细胞，lps尽管具有很强的佐剂性，但在宿主中引起强烈的炎症反应。实施例21:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例5相同的过程，不同的是使用包含编码merss可溶蛋白的核苷酸(seqidno:19)代替海肾萤光素酶作为orf的模板dna，来装配包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-kpni识别位点(ggtatc)-t7启动子(seqidno:14)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-起始密码子(cctgct)-merss作为orf(seqidno:20)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-mers”。实验例6:核酸分子的免疫测定使用实施例21中合成的核酸分子进行免疫测定，以研究作为如实验例4的佐剂的rna平台的分子。将6周龄的c57bl/6小鼠用以下制剂通过肌内注射或鼻内注射以2周的间隔接种3次:用或不用佐剂配制的5μg/小鼠mers刺突(s)可溶性蛋白疫苗，所述佐剂为用10μg鱼精蛋白预先配制的20μg/小鼠rna(pcrpv-mers)和/或120μg/小鼠的明矾(thermoscientific)，如下表3和图12所示。肌内注射100μl/小鼠免疫原，鼻内注射45μl/小鼠免疫原。[表3]rna和mers蛋白的配制我们使用merss可溶性蛋白疫苗与或不与rna免疫的小鼠血清进行免疫测定。图13a，13b，14a和14c通过elisa说明了merss-特异性igg水平。如图13a所示，igg1水平(其主要指示th2免疫应答)第二次免疫后在肌内免疫组(g1-g4)中比在鼻内免疫组(g5-g8)中略高。pbs处理组中未诱导igg1。除此之外，如图13b所示，肌内免疫组(g1-g4)的igg1水平是鼻内免疫组(g5-g8)的约1.5至两倍。在所有pcrpv-mers免疫组(g2，g3，g6和g7)中，第三血清中的igg1水平较高。相反，如图14a中所示，在小鼠第二次血清中，在肌肉内免疫组(g2-g4)中igg2a水平(其主要指示th1免疫应答)比在经鼻内免疫组中的高得多。同样，仅用merss可溶性蛋白疫苗(g1和g7)免疫的组中igg2a水平非常低。这意味着仅用明矾配制的蛋白质疫苗不会诱导th1免疫应答，即细胞介导的免疫应答。也如图14b中所示，小鼠的第三次血清中的igg2a水平通常与第二次血清中的igg2a水平相似。但是，不像在小鼠的第三次血清中的igg1水平，小鼠的第三次血清中的igg2a水平在通过肌肉内免疫的组(g2-g4)中要在比经鼻内免疫的组(g6-g8)中高得多。此外，仅用merss可溶性蛋白疫苗免疫的组显示出极低的igg2a水平(g1和g5)，这再次证实仅用明矾配制的蛋白疫苗不会诱导th1免疫应答，即细胞介导的免疫应答。这样的结果表明蛋白质疫苗或抗原就体液免疫反应而言诱导th2免疫反应以产生抗体，而就细胞介导的免疫反应而言却较差地诱导th1免疫反应。然而，使用诸如用本公开内容的核酸分子作为佐剂配制的药物活性成分如蛋白质或肽疫苗或抗原免疫能够诱导th1免疫应答以及th2免疫应答。这意味着使用蛋白质和肽作为免疫原以及所述核酸分子的免疫是诱导由免疫原引起的平衡免疫应答的极佳策略。将脾细胞(1x106细胞/100ul/孔)转移到96孔板中，并在37℃下用2ug/孔的mers刺突t细胞表位刺激48小时。根据制造商的说明书(mabtech)进行ifn-γ的elispot检测。如图15中所示，组2和组6，其使用merss蛋白疫苗以及明矾和rna(pcrpv-mers)进行了免疫，显示出最高的mersspiket细胞表位特异性ifn-γ分泌的t细胞群。考虑到这样的结果，在用编码肽或蛋白质的核酸分子配制的肽或蛋白质作为免疫原进行免疫的情况下，编码的orf诱导由免疫原引起的细胞毒性t细胞应答。实施例22:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例9相同的过程，不同的是使用包含编码merss可溶蛋白的核苷酸(seqidno:19)代替海肾萤光素酶作为orf的模板dna，来制备包括源自crpv和emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-pmei识别位点(gtttaaac)-crpvigrires(seqidno:6)作为第一ires元件-起始密码子(cctgct)-ecori识别位点(gaattc)-merss蛋白作为第一orf(seqidno:19)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-merss蛋白作为第二orf(seqidno:19)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-mers-emcv-mers”。实验例7:核酸分子的免疫测定使用实施例22中合成的核酸分子进行免疫测定，以如实验例6研究作为佐剂的rna平台的分子。将6周龄的c57bl/6小鼠用以下制剂通过肌内注射至大腿上部，以2周的间隔接种2次；使用用或不用以下佐剂配制的5μg/小鼠mers刺突(s)可溶性蛋白疫苗:用10μg鱼精蛋白预先配制的20μg/小鼠rna(pcrpv-mers-emcv-mers)和/或120μg/小鼠明矾(thermoscientific)，如下表4和图16所示。[表4]rna和mers蛋白的配制我们使用具有或不具有rna的merss可溶性蛋白疫苗(pcrpv-mers-emcv-mers)免疫的小鼠血清进行免疫测定。每次免疫2周后，通过prnt测定第1次和第2次免疫后mers-cov特异性中和抗体水平。用无血清培养基将mcrs-cov感染小鼠的血清从1:10连续稀释到1:5120。通过将100pfumers-cov与经稀释的血清样品混合来制备病毒-血清混合物，并在37℃下温育1小时。将病毒-抗体混合物接种到vero细胞上。将板在5％co2中于37℃温育1小时。病毒吸附后，添加琼脂覆盖培养基，并将平板在5％co2中于37℃温育3天。细胞用0.1％结晶紫溶液(sigma)染色。用肉眼计数斑块。中和百分比代表降低值，该降低值计算为100x在100pfu病毒感染的孔中斑块的数量/病毒-血清混合物感染的孔中斑块的数量。如图17中所示，组s1-2(用merss蛋白+明矾免疫)和s1-4(用rna以及merss蛋白和明矾免疫)在第1次和第2次免疫后显示了高mers-cov刺突蛋白特异性中和抗体值。同样，如图18a和18b中所示，指示主要th2免疫应答的igg1水平在组s1-2和s1-4中均较高。特别地，如图19a和19b中所示，主要指示th1免疫应答的igg2a水平在用rna以及用明矾配制的merss蛋白免疫的组(s1-4)中显著高于用仅以明矾配制的merss蛋白免疫的组(s1-2)。该结果表明rna(pcrpv-mers-emcv-mers)诱导了极好的th1免疫应答。实施例23:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例21相同的过程，不同的是使用包含编码hpv-16的l1的核苷酸(seqidno:21)的模板dna代替merss可溶性蛋白作为orf，来装配包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-kpni识别位点(ggtatc)-t7启动子(seqidno:14)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-起始密码子(cctgct)-hpv-16的l1作为orf(seqidno:21)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-hpv16”。实施例24:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例21相同的过程，不同的是使用包含编码hpv-18的l1的核苷酸(seqidno:22)的模板dna代替merss可溶性蛋白作为orf，来装配包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-kpni识别位点(ggtatc)-t7启动子(seqidno:14)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-起始密码子(cctgct)-hpv-18的l1作为orf(seqidno:22)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-hpv18”。实验例8:核酸分子的免疫测定使用实施例23和24中合成的核酸分子进行免疫测定，以研究作为如实验例4的佐剂的rna平台的分子。将6周龄的balb/c小鼠(dae-hanbio-link)小鼠用以下制剂通过肌内注射以2周的间隔接种3次到大腿上部中:6μg/只小鼠10价的hpv疫苗(用6、11、16、18、31、33、35、45、52和58l1混合；skbioscience)作为具有或不具有以下佐剂的病毒样颗粒(vlp)疫苗，用10μg鱼精蛋白预先配制和/或120μg/小鼠的明矾(thermoscientific)，如下表5和图20所示。100μl/小鼠的免疫原被肌内注射。[表5]rna和hpvvlp的配制组g1g2g3hpvvlp+明矾-++pcrpv-hpv16，pcrpv-hpv18--+鱼精蛋白--+我们使用具有或不具有rna的hpvvlp(pcrpv-hpv16和pcrpv-hpv18)免疫的小鼠的血清进行免疫分析。如图21a至23c中所示，总igg水平(其指示th1免疫应答为先天免疫应答)，igg1水平和igg2a水平在用rna和鱼精蛋白配制的hpvvlp免疫的组中通常高于仅用hpvvlp免疫的组(g2)。这样的结果表明rna(pcrpv-hpv16和/或pcrpv-hpv18)诱导了极好的th1免疫应答。将脾细胞(1x106细胞/100ul/孔)转移到96孔板中，并在37℃下用2ug/孔的mers刺突t细胞表位刺激48小时。根据制造商的说明书(mabtech)进行ifn-γ的elispot检测，并进行il-2，il-7，ifn-γ和tnf-α的elisa分析，它们每种均是与th1免疫应答相关的细胞因子。如图24a，24b中所示，用rna和鱼精蛋白配制的hpvvlp免疫的组(g3)显示出高得多的hpvl1蛋白特异性ifn-γ分泌的t细胞群。该结果表明rna有效地诱导了ctl。此外，如图25a至25d所示，与仅用hpvvlp(g2)进行免疫的组相比，用rna和鱼精蛋白(g3)配制的hpvvlp免疫的组可大量激活th1免疫应答相关细胞因子，即ifn-γ，il-2，il-6和tnf-α的分泌。。实施例25:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例9相同的过程，不同的是使用包含编码流感病毒的血细胞凝集素(ha)的核苷酸(seqidno:25)代替海肾萤光素酶作为orf的模板dna，来制备包括源自crpv和emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-pmei识别位点(gtttaaac)-crpvigrires(seqidno:6)作为第一ires元件-起始密码子(cctgct)-ecori识别位点(gaattc)-ha作为第一orf(seqidno:23)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-ha作为第二orf(seqidno:23)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-ha-emcv-ha”。实施例26:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例8相同的过程，不同的是使用包含编码流感病毒的血细胞凝集素(ha)代替海肾萤光素酶作为orf的核苷酸(seqidno:23)的模板dna，来制备包括源自cvb3和emcv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下核苷酸:5'-bamhi识别位点(ggatcc)-t7启动子(seqidno:14)-hpai识别位点(gttaac)-多个腺苷(polya-50)-hpai识别位点(gttaac)-多个腺苷(ma-50)-hpai识别位点(gttaac)-cvb35'utr(seqidno:2)作为第一ires元件-表达增强子序列(atggcagctcaa)-ecori识别位点和kozak序列(gattcgacc)-ha作为第一orf(seqidno:23)-saci识别位点(gagctc)-emcv5'utr(seqidno:4)作为第二ires元件-ecorⅴ-sali-paci识别位点和kozak序列(gatatcgtcgacttaattaagacc)-ha作为第二orf(seqidno:23)-sacⅱ识别位点(ccgcgg)-cvb33'utr(seqidno:8)-polya50-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pma-cvb3-ha-emcv-ha”。实验例9:核酸分子的免疫测定如实验例6使用实施例25和26中合成的核酸分子进行免疫测定，以研究作为佐剂的rna平台的分子。将5周龄的balb/小鼠(samtakobiokorea)用以下制剂通过肌内注射(i.m.)或电穿孔注射(ep)以2周的间隔接种3次:含或不含以下佐剂的2.5x105pfu/50μl/小鼠灭活的流感病毒疫苗(seqidno:24；skycellflu；ipr8):120μg/小鼠的明矾(thermoscientific)、预先用250μg鱼精蛋白配制的50μg/小鼠的rna(pcrpv-ha-emcv-ha或pcvb3-ha-emcv-ha)和/或lnp，如下表6和图26所示。肌内注射100μl/小鼠免疫原，除了使用lnp(脂质纳米颗粒)(120μl/小鼠免疫原)，45μl/小鼠免疫原被电穿孔注射。[表6]rna和流感蛋白的配制我们使用具有或不具有rna的merss可溶性蛋白疫苗(pcrpv-ha-emcv-ha或pma-cvb3-ha-emcv-ha)免疫的小鼠血清进行免疫测定。如实验例7，通过prnt确定第一次免疫后的流感特异性中和抗体水平。如图27中所示，除组“ha2”外，流感病毒特异性中和抗体在所有组中均未诱导，组“ha2”在第一次免疫后用明矾配制的ipr8病毒进行免疫。但是，组ha1(ipr8病毒)、ha3(ipr8+pcrpv-ha-emcv-ha)和ha4(ipr8+pma-cvb3-ha-emcv-ha)以及ha2显示了通过第二次免疫(第1次加强免疫)和第三次免疫显示出增加的流感病毒特异性中和抗体。这些结果意味着通过肌内注射免疫由流感疫苗和明矾配制的核酸分子可以通过第二次免疫(第一次加强免疫)诱导出足够的抗体。在第三次免疫后八天，将流感病毒疫苗攻击至免疫的小鼠中。攻击后四天，将脾细胞(1x106细胞/100ul/孔)转移到96孔板，并用mhci肽(pr8t细胞表位)和2ug/孔的重组pr8蛋白刺激，对获得的ha特异性th1细胞进行elispot检测。如图28中所示，在用mhci肽刺激的情况下，组“ha2”(ipr8+明矾)、“ha3”和“ha4”(ipr8病毒+rna)显示出相对高的ifn-γ分泌性t细胞群。此外，各自由rna和lnp配制的组“ha9”和“ha10”与仅由rna配制的组“ha5”和“ha6”或由用rna和鱼精蛋白配制的组“ha7”和“ha8”相比，是较高的ifn-γ分泌t细胞群。相反，用ipr8病毒和rna配制的组“ha3”和“ha4”显示出比用ipr8病毒和明矾配制的组“ha2”更高的il-4分泌的t细胞群，如图29所示。此外，用ipr8病毒和rna配制的组“ha3”和“ha4”比仅用rna配制的组“ha5”和“ha6”以及用rna和鱼精蛋白的配制的组“ha7”和“ha8”显示出更高的il-6分泌t细胞群体，如图30所示。特别地，用ipr8病毒和明矾配制的“ha2”组在用肽刺激的情况下显示出相对低的il-6分泌的t细胞群体。另外，如图31中所示，其显示了elisa测定法，用ipr8病毒和rna配制的组“ha3”和“ha4”比用ipr8病毒和明矾配制的组“ha2”显示出极高的ifn-γ分泌。在用mhci肽刺激的情况下，组“ha2”(ipr8+明矾)，组“ha3”和“ha4”(ipr8病毒+rna)显示出相对高的ifn-γ分泌性t细胞群。此外，各自由rna和lnp配制的组“ha9”和“ha10”与仅由rna配制的组“ha5”和“ha6”或由用rna和鱼精蛋白配制的组“ha7”和“ha8”相比，是较高的ifn-γ分泌t细胞群。实施例10:核酸分子的免疫测定如实验例6使用实施例21中合成的核酸分子进行免疫测定，以证实作为佐剂的rna平台的分子。将6周龄的c57bl/6小鼠用以下制剂通过肌内注射以2周的间隔接种1次或2次；用或不用以下佐剂配制的1μg/小鼠mers刺突(s)可溶性蛋白疫苗:用10μg鱼精蛋白预先配制的20μg/小鼠rna(pcrpv-mers)和/或500μg/小鼠的明矾(thermoscientific)，如下表7所示。[表7]rna和mers蛋白的配制组g1g2g3g4g5merss蛋白-++++明矾--+-+rna(pcrpv-mers)---++我们使用具有或不具有rna的merss可溶性蛋白疫苗(pcrpv-mers)免疫的小鼠血清进行免疫分析。如图32a和32b中所示，在第一次免疫后2周，g5(s蛋白+明矾+rna佐剂)显示最高的igg1水平(表明主要是th2应答)，g4(s蛋白+rna佐剂)和g3(s蛋白+明矾)显示出与g2(s蛋白)相比，igg1有所增加。但是，加强免疫后(第二次免疫后2周)，g2至g5显示相似的igg1水平。另一方面，如图33a和33b所示，igg2c水平(主要表示th1应答)仅在g4和g5中被诱导，表明rna(pcrpv-mers)能够诱导th1应答。此外，g5显示出最高的中和抗体水平(表明强烈的th2应答)，而g3和g4显示相似的水平，如图34所示。另外，在用merss蛋白刺激后，g5和g4显示出比g2和g3更高的分泌ifn-γ的细胞(参见图35)，表明该rna诱导了merss蛋白特异的th1应答。为了进行流式细胞术测定，使用cd4(clonegk1.5,862ebioscience；cloneh129.19,biolegend)对脾细胞和从肌肉分离的免疫细胞染色进行表面染色。使用cytofix/cytoperm试剂盒(ebioscience)渗透经染色的细胞，然后用抗ifn-γ-apc，抗tnf-α-fitc和抗il-2-pe(clonexmg1.2,bdbiosciences；clonemp6-xt22,invitrogen；clonejes6-5h4,ebioscience)染色。用1％低聚甲醛固定细胞，使用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences)分析，并使用flowjo(treestar)中的布尔门控功能分析和量化对各种细胞因子和脱粒组合呈阳性的t细胞。图36示出通过流式细胞术评估产生ifn-γ、il-2和tnf-α-1319的多功能cd4t细胞的频率。如图36中所示，分泌多种222种免疫相关细胞因子例如ifn-γ、il-2和tnf-α的多功能cd4t细胞在g5中也高度增加。这些结果表明，rna佐剂促进cd4t细胞应答，特别是th1，从而诱导抗原特异性细胞免疫应答。此外，将明矾与rna佐剂一起施用产生协同作用，从而通过刺激平衡的th1/th2应答导致在中和抗体水平方面的提高。实施例27:rna平台的核酸分子的装配通过重复与实施例5相同的过程，不同的是使用包含编码vzvge亚基的核苷酸(seqidno:25)代替海肾萤光素酶作为orf的模板dna，来装配包括源自crpv的病毒ires元件的rna平台的人工核酸分子。模板dna具有以下有序核苷酸:5'-kpni识别位点(ggtatc)-t7启动子(seqidno:14)-crpvigrires(seqidno:6)作为ires元件-起始密码子(cctgct)-vzvge亚基作为orf(seqidno:20)-sv40晚期多聚腺苷酸化信号序列(seqidno:15)-noti识别位点(gcggccgc)-3'。在该实施例中装配的核酸分子将被称为“pcrpv-zvz”。实验例11:核酸分子的免疫测定如实验例6使用实施例27中合成的核酸分子进行免疫测定，以证实作为佐剂的rna平台的分子。首先，我们研究了编码vzvge基因的rna佐剂(pcrpv-zvz)是否会增强vzvge作为亚单位蛋白疫苗的免疫应答。我们用2000pfu的减毒活vzvbulk343(oka/sk；skbioscience(称为lav))引发c57bl/6小鼠，以模拟vzv血清阳性个体的免疫系统。引发后5周，所有组均用以下制剂免疫；10μgvzvge蛋白，具有或不具有20μgrna(pcrpv-zvz)。另外，用含有大约5000780pfu/小鼠的vzvbulk(oka/sk)引发6周龄的豚鼠，并在引发后第35天通过皮下注射接种，用以下制剂以2周的间隔接种两次；人剂量(0.5ml)的skyzoster，skyzoster是一种具有/不具有rna佐剂-vzv(50μg)减毒的带状疱疹活疫苗。制剂组如下表8所示。[表8]rna和zvz蛋白的配制组g1g2g3g4lav引发-+++vzvge蛋白--+-pcrpv-vzv---+在第2次免疫后第4周，用来自经引发的小鼠的血清分析igg1和igg2a的水平。如图37a和37b所示，g4的igg1和igg2a水平高于g3。另外，通过elispot测量了从脾细胞释放的已知的th1细胞因子vzv特异性细胞因子(ifn-γ和il-2)，以确认vzv特异性th1应答。在培养的脾细胞中il-2和ifn-γ分泌细胞的频率在g4中比在g3中增加了约2-3倍，如图38a和38b所示。特别地，分泌il-2的免疫细胞的增加表明t细胞活化、扩增、发育和维持以及cd8t细胞的分化为末端效应细胞和记忆细胞的增加。这些结果表明，rna佐剂-vzv可以是针对vzv的理想佐剂，以通过诱导t细胞活化和细胞免疫应答来增加ge亚单位疫苗的效力。接下来，我们测试了减毒活疫苗skyzoster(skbioscience)中的rna佐剂vzv用于常规带状疱疹疫苗的效果。用5000pfu的vzvbulk(oka/sk)进行5周的引发(lav)后，对豚鼠(gp)(dunkin-hartley品系，kosabio)使用人类剂量(0.5ml)的活的减毒疫苗和50μgrna(pcrpv-vzv)的不同组合进行皮下免疫。以2周的间隔施用两次剂量。使用rna中抗膜抗原(fama)的荧光抗体进行测量vzv特异性中和抗体。为了确定抗vzvigg，将30μldpbs加入u型底96孔板中。将来自豚鼠的血清从1/2连续稀释至1/1024。将来自感染细胞的细胞相关病毒(30μl)添加到孔中，并在37℃下温育30分钟。在886322000rpm离心5m后，除去上清液，并用1％明胶-dpbs(2:1)缓冲液洗涤细胞，并加入30μl1/200稀释度的抗人igg-fitc缀合物至所有孔，并将板在37℃下温育30分钟。用1％明胶-dpbs缓冲液洗涤后，将4μl甘油-dpbs(2:1)添加到每个孔中，并通过共聚焦显微镜观察。如图39中所示，rna佐剂-vzv中的vzv特异性中和抗体水平比减毒活疫苗中高约2倍。因此，类似于蛋白亚基疫苗，rna(pcrpv-zvz)可以激活减毒活疫苗中的体液免疫应答。虽然已经参考示例性实施方案和实施例描述了本公开，但是这些实施方案和实施例并不旨在限制本公开的范围。而是，对于本领域技术人员将显而易见的是，在不违背本发明的精神或范围的情况下，可以对本公开进行各种修改和变型。因此，意图是本发明覆盖本公开的修改和变型，只要它们落入权利要求及其等同方案的范围内。工业适用性本公开涉及核酸分子，更具体地，涉及增强表达效率的核酸分子，包含该核酸分子的表达载体及其药学用途。当前第1页12