用于甲壳类过敏治疗的核酸的制作方法

本发明涉及预期作为药物组合物的有效成分有用的核酸、例如预期对甲壳类过敏治疗有用的核酸。

背景技术：

食物过敏是指“通过由食物引起的抗原特异性免疫学机理而引起对生物体而言不良的症状的现象”，其特征在于，具有由摄取的食物导致的荨麻疹、湿疹、腹泻、咳嗽等症状。甲壳类过敏是成人中的主要食物过敏之一，作为引起甲壳类过敏的变应原，已知有以被分类为原肌球蛋白(tropomyosin)的litv1和penm1、被分类为精氨酸激酶(argininekinase)的litv2和penm2、被分类为肌球蛋白轻链(myosinlightchain)的litv3和penm3、被分类为肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmiccalciumbindingprotein)的litv4和penm4等为代表的多种多样的变应原(非专利文献1至4)。

目前，还没有甲壳类过敏的根本性治疗法，通过除去食物而避免变应原摄取是用于预防过敏反应等甲壳类过敏症状的唯一方法。虽然也进行了变应原特异性免疫治疗(allergenspecificimmunotherapy，asit)、dna质粒、基于肽的免疫治疗(peptide-basedimmunotherapy，pit)等的研究，但是尚未开发出临床上有效的治疗法，需要有效的治疗法(非专利文献4、europeanannalsofallergyandclinicalimmunology、2017、vol.49、p.252-256)。

过敏性疾病是如下发生的：1)摄取到体内的变应原被抗原提呈细胞所吞噬并被抗原提呈至初始t细胞；2)初始t细胞分化为th2细胞；3)由th2细胞等免疫细胞产生il-4等细胞因子；4)b细胞在il-4的作用下产生ige；5)结合了变应原的ige与肥大细胞结合。已知在过敏性疾病患者中，在产生ifn-γ等的th1细胞所参与的th1型免疫与产生il-4等的th2细胞所参与的th2型免疫的抗衡中th2型占优势，发生th2型的炎症免疫反应(middleton’sallergyseventheditionprinciples&practice、2009)。可见ifn-γ可用作th1型免疫的指标、il-4可用作th2型免疫的指标。另外，在小鼠中，ifn-γ使在被活化的b细胞中发生优先向igg2a同种型的类别转换，另一方面抑制对其他所有同种型的应答。即，igg2a抗体产生也可用作th1型免疫的指标。例如，已知在il-4缺陷小鼠中，igg2a抗体产生受到促进，在ifn-γ缺陷小鼠中，igg2a抗体产生受到抑制(arthritisres.、2002、vol.4、p.54-58)。另外，还有报道称由b细胞产生的抗体与变应原免疫疗法的作用机理相关。例如，已知在人体中，igg与同变应原结合的ige对抗，抑制变应原-ige复合物形成，抑制组胺从肥大细胞的游离(journalofallergyandclinicalimmunology、2017、vol.140、p.1485-1498)。

作为核酸疫苗的技术之一，进行了利用溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associatedmembraneprotein；lamp)的用于过敏治疗的核酸疫苗的研究。并且，已构建出含有编码包含作为lamp家族成员的lamp-1和作为日本柳杉(cryptomeriajaponica)的变应原的cryj1和/或cryj2的嵌合蛋白的核酸的质粒(专利文献1、非专利文献5)。并且，据报道，这样的质粒在不引起导致过敏反应的游离变应原向全身释放的情况下诱导th1型的免疫反应。另外，据报道，含有编码包含lamp-1以及作为花生的变应原的arah1、arah2和arah3的嵌合蛋白的核酸的质粒在小鼠模型中减少了ige的产生(专利文献2)。但是，尚未报道过用于甲壳类过敏治疗的核酸疫苗。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开号2013/187906号

专利文献2：国际公开号2015/200357号

非专利文献

非专利文献1：“アレルゴジャーナルインターナショナル(allergojournalinternational)”、(德国)、2016；25(7)：210-218

非专利文献2：“ザ·ジャーナル·オブ·アラージー·アンド·クリニカル·イムノロジー(thejournalofallergyandclinicalimmunology)”、(美国)、2009；124(1)：114-120

非专利文献3：“ザ·ジャーナル·オブ·アラージー·アンド·クリニカル·イムノロジー(thejournalofallergyandclinicalimmunology)”、(美国)、2008；122(4)：795-802

非专利文献4：“クリニカル·レビューズ·イン·アラージー·アンド·イムノロジー(clinicalreviewsinallergyandimmunology)”、(美国)、2015；49(2)：203-216

非专利文献5：“ジャーナル·オブ·イムノロジー·リサーチ(journalofimmunologyresearch)”、(埃及)、2016；articleid4857869

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供预期对甲壳类过敏治疗有用的核酸。

用于解决问题的方法

本发明人在用于甲壳类过敏治疗的核酸的制作方面反复进行了相当深入的研究，结果，制作出了lamp-litv1-litv4-litv3质粒(实施例1)，确认到嵌合蛋白由该质粒表达(实施例2)，并且发现在给药了该质粒的小鼠中诱导了th1型免疫反应(实施例3、实施例4)。其结果是，提供预期对甲壳类过敏治疗有用的核酸，从而完成了本发明。进一步发现，在给药了该质粒的小鼠中，由虾抗原引起的过敏症状得到了缓解(实施例5)。

即，本发明涉及下述[1]～[17]。

[1]一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

[2]一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

[3]如[1]或[2]所述的核酸，其中，信号肽为lamp的信号肽。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的核酸，其中，跨膜结构域为lamp的跨膜结构域。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的核酸，其中，信号肽由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成，细胞器内稳定化结构域由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成，变应原结构域为包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域，跨膜结构域由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成，内体/溶酶体靶向结构域由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成。

[6]一种核酸，其为包含编码由与序列号2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原的th1型免疫的作用。

[7]一种核酸，其为下述a)或b)的核酸：

a)包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸；

b)包含编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原的th1型免疫的作用。

[8]一种核酸，其包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列。

[9]一种表达载体，其包含[1]～[8]中任一项所述的核酸。

[10]一种表达载体，其包含[8]所述的核酸。

[11]一种宿主细胞，其利用[1]～[8]中任一项所述的核酸进行了转化。

[12]一种生产核酸的方法，其包括对利用[1]～[8]中任一项所述的核酸进行了转化的宿主细胞进行培养的步骤。

[13]一种药物组合物，其包含[10]所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。

[14]如[13]所述的药物组合物，其为甲壳类过敏的预防或治疗用药物组合物。

[15]一种预防或治疗甲壳类过敏的方法，其包括给药预防有效量或治疗有效量的[10]所述的表达载体的步骤。

[16]如[10]所述的表达载体，其用于甲壳类过敏的预防或治疗。

[17][10]所述的表达载体在制造甲壳类过敏的预防或治疗用药物组合物中的应用。

发明效果

本发明的核酸能够用于甲壳类过敏的预防或治疗。

附图说明

图1是示出对小鼠给药本发明的核酸时被诱导的litv1、litv3和litv4特异性igg2a抗体产生的图。纵轴表示血浆中抗体效价(mu/ml)，横轴表示各给药组。虚线表示检测限，水平线表示各给药组的几何平均值。

图2是示出用终浓度100μg/ml的虾提取液或终浓度10μg/ml的litv1蛋白刺激给药本发明的核酸后的小鼠的脾细胞时的ifn-γ产生的图。纵轴表示培养上清中ifn-γ浓度(pg/ml)，横轴表示各给药组。虚线表示检测限，水平线表示各给药组的算术平均值。

图3是示出用终浓度100μg/ml的虾提取液或终浓度10μg/ml的litv1蛋白刺激给药本发明的核酸后的小鼠的脾细胞时的il-4产生的图。纵轴表示培养上清中il-4浓度(pg/ml)，横轴表示各给药组。虚线表示检测限，水平线表示各给药组的算术平均值。

图4示出将本发明的核酸给药于虾抗原致敏小鼠时虾抗原腹腔内给药后的体温变化和过敏症状的评分。体温变化示出虾抗原腹腔内给药即将开始前、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟时与给药前体温相比的变化。纵轴表示直肠温度变化(℃)，横轴表示时间。散点表示在各时刻在同一处方内的算术平均值，竖线表示标准误差。过敏症状表示基于文献(thejournalofallergyandclinicalimmunology、2013、vol.131、p.213-221)的判定基准对虾抗原腹腔内给药后60分钟时确认到的症状进行判定而得到的各小鼠的评分。纵轴表示过敏反应症状评分，横轴表示各给药组。水平线表示各给药组的中央值。++表示在通过willcoxon秩和检验(willcoxonranksumtest)对非致敏组进行的显著性差异检验中p值小于0.01，**表示在通过steel多重比较检验(steelmultiplecomparisontest)对致敏组进行的显著性差异检验中p值小于0.01。

图5示出将本发明的核酸给药于虾抗原致敏小鼠时的血浆中的小鼠肥大细胞蛋白酶1(mmcpt-1)的浓度。纵轴表示mmcpt-1浓度(pg/ml)，横轴表示各给药组。水平线表示各给药组的几何平均值，++表示在通过非配对t检验(unpairedttest)对对数转换后的非致敏组进行的显著性差异检验中p值小于0.01，**表示在通过dunnett多重比较检验(dunnett’smultiplecomparisontest)对对数转换后的致敏组进行的显著性差异检验中p值小于0.01。

具体实施方式

以下对本发明进行详述。

<本发明的核酸>

本发明的核酸包括具有下述特征的核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

本发明中，核酸是指核苷酸聚合而成的由任意长度的碱基序列构成的高分子。核苷酸可以包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。本发明的核酸例如为dna、rna或对它们进行改造而得到的核酸。在一个实施方式中，本发明的核酸为dna。

在一个实施方式中，本发明的核酸为整合入表达载体中的核酸。另外，在一个实施方式中，本发明的核酸为整合入质粒载体中的核酸。

本说明书中，“嵌合蛋白”是指由使用基因重组技术将两个以上的基因融合而成的碱基序列所编码的蛋白质。本发明的核酸含有编码依次包含信号肽、lamp的细胞器内稳定化结构域、包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域、跨膜结构域以及lamp的内体/溶酶体靶向结构域的嵌合蛋白(以下称为“本发明的嵌合蛋白”)的碱基序列。

lamp是本领域技术人员公知的蛋白质(jbiolchem.、1991、vol.266、p.21327-21330)。本说明书中，lamp没有特别限定，包括lamp-1、lamp-2、cd63/lamp-3、dc-lamp和limpii、以及它们的同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体和改造体。在本发明的一个实施方式中，lamp为lamp-1。本发明中的lamp的来源动物没有特别限定，在一个实施方式中，lamp为人lamp。在一个实施方式中，人lamp为人lamp-1。作为人lamp-1的氨基酸序列，可以列举例如在序列号2的氨基酸编号1至380所示的氨基酸序列的c末端结合序列号2的氨基酸编号1047至1082所示的氨基酸序列而得到的氨基酸序列。

信号肽的一般结构是本领域技术人员公知的(annurevbiochem.、2003、vol.72、p.395-447)。信号肽具有指示蛋白质的运输和定位的功能。作为本发明中使用的信号肽，只要具有指示蛋白质的运输和定位的功能，则可以选择任意适当的信号肽。在一个实施方式中，本发明中使用的信号肽为lamp的信号肽。在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的信号肽为lamp-1的信号肽。

在一个实施方式中，本发明中使用的信号肽由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成。

(a)与序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列。

本说明书中的“一致性”是指使用embossneedle(nucleicacidsres.、2015、vol.43、p.w580-w584；https:www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/)利用默认设置的参数所得到的一致性(identity)的值。上述参数如下所述。

空位开放罚分(gapopenpenalty)＝10

空位延伸罚分(gapextendpenalty)＝0.5

矩阵(matrix)＝eblosum62

末端空位罚分(endgappenalty)＝假(false)

在一个实施方式中，本发明中使用的信号肽由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成。

lamp的细胞器内稳定化结构域的序列是本领域技术人员公知的(国际公开号2013/187906号)。lamp的细胞器内稳定化结构域具有保护变应原结构域免受蛋白水解酶、低ph、以及其他使蛋白质不稳定的物质和条件的影响的功能。作为本发明中使用的lamp的细胞器内稳定化结构域，只要具有保护变应原结构域免受蛋白水解酶、低ph、以及其他使蛋白质不稳定的物质和条件的影响的功能，则可以选择任意适当的lamp的细胞器内稳定化结构域。在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的细胞器内稳定化结构域为lamp-1的细胞器内稳定化结构域。

在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的细胞器内稳定化结构域由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：

(a)与序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的细胞器内稳定化结构域由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成。

本发明中使用的变应原结构域包含作为变应原的litv1、litv4和litv3。litv1、litv4和litv3是广泛见于甲壳类(crustaceans)的变应原(非专利文献1)。本发明中使用的litv1、litv4和litv3只要具有抗原性即可，可以为它们的突变体。任意蛋白质具有抗原性这一点例如可以通过对动物给药并观察针对该蛋白质的抗体产生或引起t细胞应答的情况来确认(bioanalysis.、2012、vol.4、p.397-406)。

在一个实施方式中，litv1由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：

(a)与序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列。

在一个实施方式中，litv1由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成。

在一个实施方式中，litv4由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：

(a)与序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列。

在一个实施方式中，litv4由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成。

在一个实施方式中，litv3由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：

(a)与序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列。

在一个实施方式中，litv3由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成。

在一个实施方式中，本发明中使用的变应原结构域以任意的顺序包含litv1、litv4和litv3。另外，在一个实施方式中，本发明中使用的变应原结构域按照litv1、litv4和litv3的顺序包含它们。

在一个实施方式中，本发明中使用的变应原结构域由序列号2的氨基酸编号383至1044的氨基酸序列构成。

跨膜结构域的一般结构是本领域技术人员公知的(annurevbiochem.、2007、vol.76、p.125-140)。跨膜结构域具有将蛋白质锚定在生物体膜中的功能。作为本发明中使用的跨膜结构域，只要具有将蛋白质锚定在生物体膜中的功能，则可以选择任意适当的跨膜结构域。在一个实施方式中，本发明中使用的跨膜结构域为lamp的跨膜结构域。在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的跨膜结构域为lamp-1的跨膜结构域。

在一个实施方式中，本发明中使用的跨膜结构域由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：

(a)与序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列；或者

(b)序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～2个氨基酸而得到的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本发明中使用的跨膜结构域由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成。

lamp的内体/溶酶体靶向结构域的结构是本领域技术人员公知的(国际公开号1994/017192号)。lamp的内体/溶酶体靶向结构域具有将蛋白质运输至溶酶体的功能。作为本发明中使用的lamp的内体/溶酶体靶向结构域，只要具有将蛋白质运输至溶酶体的功能，则可以选择任意适当的lamp的内体/溶酶体靶向结构域。在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的内体/溶酶体靶向结构域为lamp-1的内体/溶酶体靶向结构域。

在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的内体/溶酶体靶向结构域由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列、或者在序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1个氨基酸而得到的氨基酸序列构成。

在一个实施方式中，本发明中使用的lamp的内体/溶酶体靶向结构域由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成。

在本发明的嵌合蛋白中，信号肽、lamp的细胞器内稳定化结构域、变应原结构域中包含的各变应原、跨膜结构域和lamp的内体/溶酶体靶向结构域可以直接连接，或者也可以经由接头肽间接地连接。所使用的接头肽可以由本领域技术人员适当选择。在一个实施方式中，该接头肽由10个以下的氨基酸构成。在一个实施方式中，在lamp的细胞器内稳定化结构域与变应原结构域之间、各变应原之间、以及变应原结构域与跨膜结构域之间使用的接头肽为选自由leuglu、glyglyglygly和gluphethr组成的组中的接头肽。在一个实施方式中，在跨膜结构域与lamp的内体/溶酶体靶向结构域之间使用的接头肽为由序列号2的氨基酸编号1071至1078的氨基酸序列构成的接头肽。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码lamp的信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码lamp的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码lamp-1的信号肽的碱基序列；

编码lamp-1的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码lamp-1的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp-1的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1071至1078的氨基酸序列构成的肽接头的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码lamp的信号肽的碱基序列；

编码lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码lamp的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码lamp-1的信号肽的碱基序列；

编码lamp-1的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码lamp-1的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码lamp-1的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码依次包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1071至1078的氨基酸序列构成的肽接头的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

本发明的核酸只要编码本发明的嵌合蛋白且在将该核酸给药于人或动物的情况下具有诱导针对选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原的th1型免疫的作用，则没有特别限定。在将某一核酸给药于人或动物的情况下，该核酸是否具有诱导针对上述变应原的th1型免疫的作用例如可以通过实施例3和/或实施例4中记载的方法来确认。另外，本发明的核酸可以是将该核酸给药于人或动物的情况下具有诱导th1细胞优势型免疫反应的作用的核酸。在将某一核酸给药于人或动物的情况下，该核酸是否具有诱导th1细胞优势型免疫反应的作用例如可以通过实施例4中记载的方法来确认。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：包含编码由与序列号2所示的氨基酸序列的一致性为90％、92％、94％、96％、98％或99％以上的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：包含编码由与序列号2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白、或者由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码由与序列号2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原的th1型免疫的作用。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为下述a)或b)的核酸：

a)包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸；

b)包含编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原的th1型免疫的作用。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为包含编码由与序列号2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对litv1、litv4和litv3的th1型免疫的作用。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：

一种核酸，其为下述a)或b)的核酸：

a)包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸；

b)包含编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸，

该核酸具有诱导针对litv1、litv4和litv3的th1型免疫的作用。

在一个实施方式中，本发明的核酸为下述核酸：包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸。

在一个实施方式中，编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列为序列号1所示的碱基序列。

本发明的核酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列使用该领域中公知的方法容易地制作。例如，本发明的核酸可以利用该领域中公知的基因合成方法来合成。作为这样的基因合成方法，可以使用国际公开号90/07861号中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。

本发明的核酸一旦合成出来后，可以由本领域技术人员使用该领域中公知的方法容易地进行复制。例如，本发明的核酸可以通过后述的<本发明的生产核酸的方法和能够利用该方法生产的核酸>中记载的方法进行复制。

<本发明的表达载体>

本发明的表达载体包括包含本发明的核酸的表达载体。

作为用于使嵌合蛋白由本发明的核酸表达的表达载体，只要能够在动物细胞中由本发明的核酸表达嵌合蛋白，则没有特别限制。在一个实施方式中，用于使嵌合蛋白由本发明的核酸表达的表达载体为能够用于使嵌合蛋白在人体内表达的表达载体。作为本发明中使用的表达载体，可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒)等。在一个实施方式中，本发明中使用的表达载体为质粒载体。本说明书中，“质粒”是指质粒载体。

本发明的表达载体可以包含以能够发挥功能的方式与本发明的核酸连接的启动子。作为用于使嵌合蛋白在动物细胞中由本发明的核酸表达的启动子，可以列举例如来源于cmv(巨细胞病毒，cytomegalovirus)、rsv(呼吸道合胞病毒，respiratorysyncytialvirus)、sv40(猴病毒40，simianvirus40)等病毒的启动子、肌动蛋白启动子、ef(延伸因子，elongationfactor)1α启动子、热休克启动子等。在一个实施方式中，本发明的表达载体中包含的启动子为cmv启动子。本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。这种情况下，也可以包含增强子序列、非翻译区、剪接接头、多腺苷酸化位点或可复制单元等。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为包含下述核酸的表达载体

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为包含下述核酸的表达载体：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1071至1078的氨基酸序列构成的肽接头的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸的表达载体。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为含有包含序列号1所示的碱基序列的核酸的表达载体。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为含有由序列号3所示的碱基序列构成的核酸的表达载体。

<本发明的宿主细胞>

本发明的宿主细胞包括利用本发明的核酸进行了转化的宿主细胞。在一个实施方式中，本发明的宿主细胞为利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。在一个实施方式中，本发明的宿主细胞为利用作为质粒载体的本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。

作为利用本发明的核酸进行转化的宿主细胞，没有特别限定，只要是能够用于核酸的复制的细胞，则可以选择该领域中公知的细胞。

作为能够用于核酸的复制的宿主细胞，可以列举例如在本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如动物细胞(例如chok1sv细胞等)、昆虫细胞(例如sf9等)、细菌(大肠杆菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)。在一个实施方式中，可以使用大肠杆菌作为宿主细胞。转化本身可以利用公知的方法来实施。

<本发明的生产核酸的方法和能够利用该方法生产的核酸>

本发明的生产核酸的方法包括下述生产核酸或表达载体的方法，该方法包括对利用本发明的核酸或表达载体进行了转化的宿主细胞进行培养的步骤。在一个实施方式中，本发明的生产核酸的方法包括对利用本发明的核酸进行了转化的宿主细胞进行培养、并对本发明的核酸进行复制的步骤。在一个实施方式中，本发明的生产核酸的方法包括对利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞进行培养、并对本发明的表达载体进行复制的步骤。

在一个实施方式中，本发明的生产核酸的方法中使用的宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌的培养可以选择适当的培养基、例如lb培养基、m9培养基、terrificbroth培养基、sob培养基、soc培养基或2×yt培养基等。另外，该大肠杆菌的培养可以在将碳(只要是能够同化的碳化合物则没有特别限定，例如甘油等多元醇类、或者丙酮酸、琥珀酸或柠檬酸等有机酸类)、氮(只要是大肠杆菌能够利用的氮化合物则没有特别限定，例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕碱提取物、或者氨或其盐)、无机物和无机离子(没有特别限定，例如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰和锌)、维生素源以及消泡剂等控制为适当浓度的环境中进行。另外，培养的控制包括ph、温度、搅拌、空气流、溶解氧等参数的控制。在一个实施方式中，培养的条件为ph6.7～7.5、温度20℃～37℃以及搅拌速度200～300rpm的范围。

本发明的生产核酸的方法可以包括从回收的培养液中得到裂解物(溶菌液)的步骤。裂解物例如可以通过将回收的培养液利用碱溶解法或煮沸法进行处理而得到。另外，得到裂解物的步骤可以包括对最终溶解物进行灭菌过滤的步骤。

本发明的生产核酸的方法可以进一步包括从裂解物中纯化核酸或表达载体的步骤。核酸或表达载体从裂解物中的纯化可以使用离子交换色谱法和/或疏水作用色谱法。从裂解物中纯化核酸或表达载体的步骤可以包括进行超滤和/或透析过滤的步骤。另外，可以包括进行灭菌过滤的步骤作为纯化步骤的最终处理。

在一个实施方式中，本发明的核酸为利用本发明的生产核酸的方法生产的核酸。

在一个实施方式中，本发明的表达载体为利用本发明的生产核酸的方法生产的表达载体。

<本发明的药物组合物>

本发明的药物组合物包括包含本发明的核酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂或药剂用载体等，利用通常使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的示例，可以列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药等进行给药。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的核酸或表达载体、和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本发明的核酸或表达载体的给药量根据患者的症状的程度、年龄、所使用的制剂的剂型等而不同，例如可以使用约0.001mg/kg～约100mg/kg。另外，可以添加与这样的给药量相当的量的本发明的核酸或表达载体而进行制剂化。

本发明的药物组合物能够用作由选自litv1、litv4和litv3中的变应原引起的过敏的预防或治疗剂。另外，本发明的药物组合物能够用作甲壳类过敏的预防或治疗剂。

本发明包括包含本发明的核酸的过敏的预防或治疗用药物组合物。另外，本发明包括一种预防或治疗过敏的方法，该方法包括给药预防有效量或治疗有效量的本发明的核酸的步骤。另外，本发明包括用于过敏的预防或治疗的本发明的核酸。另外，本发明包括本发明的核酸在制造过敏的预防或治疗用药物组合物中的应用。在一个实施方式中，上述过敏为由选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原引起的过敏。另外，在一个实施方式中，上述过敏为具有与选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原发生反应的抗体的过敏患者所患的过敏。此外，在一个实施方式中，上述过敏为甲壳类过敏。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物为包含下述核酸和药学上可接受的赋形剂的过敏的预防或治疗用药物组合物：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸和药学上可接受的赋形剂的过敏的预防或治疗用药物组合物。

本发明包括包含本发明的表达载体的过敏的预防或治疗用药物组合物。另外，本发明包括一种预防或治疗过敏的方法，该方法包括给药预防有效量或治疗有效量的本发明的表达载体的步骤。另外，本发明包括用于过敏的预防或治疗的本发明的表达载体。另外，本发明包括本发明的表达载体在制造过敏的预防或治疗用药物组合物中的应用。在一个实施方式中，上述过敏为由选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原引起的过敏。另外，在一个实施方式中，上述过敏为具有与选自由litv1、litv4和litv3组成的组中的变应原发生反应的抗体的过敏患者所患的过敏。此外，在一个实施方式中，上述过敏为甲壳类过敏。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物为含有包含下述核酸和药学上可接受的赋形剂的表达载体的过敏的预防或治疗用药物组合物：

一种核酸，其为包含编码嵌合蛋白的碱基序列的核酸，该碱基序列为依次包含下述碱基序列的碱基序列：

编码由序列号2的氨基酸编号1至27的氨基酸序列构成的信号肽的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号28至380的氨基酸序列构成的lamp的细胞器内稳定化结构域的碱基序列；

编码包含由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1、由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4和由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3的变应原结构域的碱基序列；

编码由序列号2的氨基酸编号1048至1070的氨基酸序列构成的跨膜结构域的碱基序列；以及

编码由序列号2的氨基酸编号1079至1082的氨基酸序列构成的lamp的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物为一种过敏的预防或治疗用药物组合物，其包含表达载体和药学上可接受的赋形剂，该表达载体含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列的核酸。

为了进一步理解本发明，在此提供参考的特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并非对本发明进行限定。

实施例

在没有特别声明的情况下，下述实施例中记载的步骤可以按照公知的方法来实施。另外，在使用市售的试剂或试剂盒等的情况下，该步骤可以按照市售品的说明书来实施。

[实施例1：lamp-litv1-litv4-litv3质粒的构建]

构建由序列号3所示的碱基序列构成的lamp-litv1-litv4-litv3质粒(包含下述核酸的表达载体，该核酸包含依次含有下述碱基序列的碱基序列(即，编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的嵌合蛋白的碱基序列)：编码lamp-1的信号肽的碱基序列、编码lamp-1的细胞器内稳定化结构域的碱基序列、编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列、编码lamp-1的跨膜结构域的碱基序列、以及编码lamp-1的内体/溶酶体靶向结构域的碱基序列)。该质粒可以通过在日本专利第5807994号的序列号6中记载的质粒的ecori-xhoi位点插入在序列号1的碱基编号1147至3132的碱基序列(编码依次包含litv1、litv4和litv3的变应原结构域的碱基序列)的5’末侧添加xhoi识别序列、在3’末侧添加ecori识别序列而得到的合成dna来构建。利用所构建的lamp-litv1-litv4-litv3质粒转化大肠杆菌，并进行液体培养。利用离心分离法从培养液中回收菌体，利用基于通常的质粒提取纯化法(小量制备法)的方法得到扩增后的lamp-litv1-litv4-litv3质粒。

[实施例2：lamp-litv1-litv4-litv3嵌合蛋白的表达]

使用来源于人胎儿肾的293t细胞株，对lamp-litv1-litv4-litv3嵌合蛋白(由序列号1所示的碱基序列所编码的氨基酸序列(即序列号2所示的氨基酸序列)构成的嵌合蛋白)的体外表达进行评价。

(1)细胞培养和质粒导入

将来源于人胎儿肾的293t细胞(thermofisherscientific公司cat.hcl4517)在含有10％胎牛血清(hyclone公司、cat.sh30070.03)和100倍稀释的青霉素-链霉素(thermofisherscientific公司、cat.15070063)的d-mem培养基(sigma-aldrich公司、cat.d5796)中悬浮、并以3×10⁵细胞/孔的方式接种到6孔板(iwaki公司、cat.3810-006)中。将接种后的细胞在37℃、5％co2存在下培养一晩后，添加lamp-litv1-litv4-litv3质粒:lipofectamine2000(thermofisherscientific公司、cat.11668027)＝2.5(μg):10(μl)的混合液250μl。进一步将细胞在37℃、5％co2存在下培养一晩后，除去培养基，用pbs清洗一次后，供于蛋白质印迹。

(2)蛋白质印迹

样品制作：用含有蛋白酶抑制剂(罗氏诊断公司、cat.11873580)的ripa缓冲液(pierce公司、cat.89900)溶解细胞，进行20000×g、5分钟的离心分离，使用dc蛋白检测试剂盒ii(bio-rad公司、cat.500-0112)测定离心分离后的上清的蛋白浓度。用含有蛋白酶抑制剂的pbs进行稀释以使蛋白浓度达到200μg/ml，在所得到的上清5μl中添加含有100mmdtt的lds样品缓冲液(thermofisherscientific公司、cat.np0007)5μl，在70℃下加热处理10分钟，制作供于sds-page的样品。

sds-page：将上述样品施加到nupage(注册商标)4-12％bis-tris胶(thermofisherscientific公司、cat.np0323)中，在nupage(注册商标)mopssdsruning缓冲液(thermofisherscientific公司、cat.np0001)中以200v的恒压进行电泳。

印迹：使pvdf膜(thermofisherscientific公司、cat.lc2005)与sds-page后的胶接触，在充满含有20％甲醇的nupage(注册商标)转印缓冲液(thermofisherscientific公司、cat.np0006)的xcellii印迹模块(thermofisherscientific公司、cat.ei9051)中以180ma通电70分钟，进行印迹。

封闭：将通电后的膜浸渍于blockingone(nacalaitesque公司、cat.03953-95)中，在室温下振荡1小时。

一次抗体：将抗人lamp1抗体(sinobiological公司、cat.11215-rp01)用含有10％blockingone的tbstween-20缓冲液(thermofisherscientific公司、cat.28360)稀释1000倍，将膜浸渍于所得到的溶液中，在4℃下振荡一晩。

二次抗体：用tbstween-20缓冲液对膜进行清洗。将抗兔igg(h+l链)pab-hrp(mbl公司、cat.458)用含有10％blockingone的tbstween-20缓冲液稀释3000倍，将膜浸渍于所得到的溶液中，在室温下振荡1小时。

检测：用tbstween-20缓冲液对膜进行清洗。将膜浸渍于eclprime蛋白质印迹检测试剂(gehealthcare公司、cat.rpn2232)中，利用lumivisionpro400ex(爱信精机株式会社)对图像进行检测。在该图像中，检测到相当于嵌合蛋白的与抗人lamp1抗体反应的条带。

上述试验的结果确认到，通过在来源于人胎儿肾的293t细胞株中导入lamp-litv1-litv4-litv3质粒，lamp-litv1-litv4-litv3嵌合蛋白在细胞内进行表达。

[实施例3：基于lamp-litv1-litv4-litv3质粒给药的igg2a抗体的产生诱导]

在小鼠体内进行igg2a抗体产生诱导的评价。作为各组的8例，在给药开始时为6周龄的balb/c雌性小鼠(日本查尔斯河公司)的耳部每隔1周共计3次(第0、7、14天)皮内给药作为多价质粒组的含有5μglamp-litv1-litv4-litv3质粒的pbs溶液25μl，在最后给药3周后(第35天)采血，获得血浆样品。对于比较对照，作为单价质粒混合物组，给药含有分别为5μg的各质粒的lamp-litv1质粒(包含下述核酸的表达载体，该核酸包含依次含有下述碱基序列的碱基序列：编码序列号2的氨基酸编号1至380的氨基酸序列(以下在实施例3和4中称为lamp-1的n末端)的碱基序列、编码由序列号2的氨基酸编号383至666的氨基酸序列构成的litv1变应原结构域的碱基序列、以及编码序列号2的氨基酸编号1048至1082的氨基酸序列(以下称为lamp-1的c末端)的碱基序列)、lamp-litv3质粒(包含下述核酸的表达载体，该核酸包含依次含有下述碱基序列的碱基序列：编码lamp-1的n末端的碱基序列、编码由序列号2的氨基酸编号868至1044的氨基酸序列构成的litv3变应原结构域的碱基序列、以及编码lamp-1的c末端的碱基序列)和lamp-litv4质粒(包含下述核酸的表达载体，该核酸包含依次含有下述碱基序列的碱基序列：编码lamp-1的n末端的碱基序列、编码由序列号2的氨基酸编号671至863的氨基酸序列构成的litv4变应原结构域的碱基序列、以及编码lamp-1的c末端的碱基序列)的混合物(以下称为单价质粒混合物)的pbs溶液25μl，作为对照组，给药pbs25μl。关于抗体效价，使用以含有1％bsa(sigma-aldrich公司、cat.a8022)的pbs稀释至10倍、100倍或1000倍的血浆样品利用elisa法进行测定。抗体效价的计算通过将由进行了虾抗原(greer公司、cat.rmf34p)免疫的小鼠制备的大量含有litv1、litv3和litv4特异性抗体的血浆作为标准血浆，对该标准血浆进行连续稀释，制作校准曲线来进行。此时，将标准血浆中的各变应原特异性igg2a抗体效价定为100u/ml。elisa测定使用f96maxisorpnunc-immunoplate(nunc公司、cat.439454)作为试验板，基于通常的elisa法来实施。将作为天然虾提取纯化蛋白的litv1(indoorbiotechnologies公司、cat.na-stm-1)用pbs制备成1μg/ml，将作为重组纯化蛋白的litv4(sysmex公司、uniprotkb：c7a639)和litv3(sysmex公司、uniprotkb：b7sni3)用pbs制备成2μg/ml，以50μl/孔添加到试验板中，在4℃下静置一晩。使用清洗缓冲液(pbstween-20缓冲液、thermofisherscientific公司、cat.28352)将试验板清洗3次后，以100μl/孔添加含有1％bsa的pbs，在室温下静置1小时。使用清洗缓冲液将试验板清洗3次后，以50μl/孔添加血浆样品，在室温下静置1小时。使用清洗缓冲液将试验板清洗3次后，以50μl/孔添加用含有1％bsa的pbs稀释50000倍的二次抗体抗小鼠igg2a检测抗体(bethyllaboratories公司、cat.a90-107p)，在室温下静置1小时。使用清洗缓冲液将试验板清洗3次后，以50μl/孔添加作为底物溶液的tmb微孔过氧化物酶底物系统(seracare公司、cat.50-76-03)，在室温下litv1静置10分钟、litv3静置30分钟、litv4静置60分钟，然后以50μl/孔添加反应终止液(2mh2so4)，测定450nm的吸光度。

上述试验的结果，通过将lamp-litv1-litv4-litv3质粒(多价质粒)给药于小鼠，确认到与单价质粒混合物给药同等程度的litv1、litv3和litv4特异性igg2a抗体产生(图1)。由以上的结果暗示，lamp-litv1-litv4-litv3质粒对质粒所编码的所有变应原诱导th1免疫应答，引起被活化的b细胞的向igg2a同种型的类别转换。

[实施例4：基于lamp-litv1-litv4-litv3质粒的ifn-γ和il-4产生诱导]

进行了将从给药lamp-litv1-litv4-litv3质粒后的小鼠采集的脾细胞用变应原刺激时的ifn-γ和il-4产生诱导的评价。将实施例3中使用的、给药lamp-litv1-litv4-litv3质粒后的小鼠在最后给药3周后(第35天)处死，摘取脾脏。按照常规方法，从摘取的脾脏中制备脾细胞。将所制备的脾细胞悬浮于含有10％胎牛血清(hyclone公司、cat.sh30070.03)和100倍稀释的青霉素-链霉素(thermofisher公司、cat.15070063)的rpmi-1640培养基(sigma公司、cat.r8758)中，以8×10⁵细胞/孔的细胞数接种到96孔板中。变应原刺激使用虾提取液(诊断用过敏划痕提取物、torii公司、许可号(40a)4688)或litv1(indoorbiotechnologies公司、cat.na-stm-1)。变应原刺激通过在接种有脾细胞的孔中添加虾提取液或litv1使终浓度分别为100μg/ml或10μg/ml，在37℃、5％co2下培养72小时的方法来进行，利用elisa法测定通过刺激由脾细胞释放到培养上清中的ifn-γ和il-4的浓度。ifn-γ的测定使用以含有0.1％bsa和0.05％tween20的tbs缓冲液稀释10倍的上清样品，il-4的测定使用以含有1％bsa的pbs缓冲液稀释3倍的上清样品。作为elisa测定的试验板，使用f96maxisorpnunc-immunoplate。作为elisa试剂盒，使用小鼠ifn-γduosetelisa(r&dsystems公司、cat.dy485)和小鼠il-4duosetelisa(r&dsystems公司、cat.dy404)。实验依照elisa试剂盒附带的操作规程进行。上述试验中确认到，通过lamp-litv1-litv4-litv3质粒(多价质粒)给药，诱导了与单价质粒混合物给药同等程度的虾提取液和litv1特异性ifn-γ产生(图2)。另一方面，在该小鼠中，通过多价质粒和单价质粒混合物给药诱导的虾提取液和litv1特异性il-4产生量为检测下限值(图3)。由以上的结果暗示，lamp-litv1-litv4-litv3质粒诱导th1细胞优势型th1型免疫应答。

[实施例5：lamp-litv1-litv4-litv3质粒对虾抗原诱发过敏反应症状的抑制作用]

为了判定lamp-litv1-litv4-litv3质粒对过敏的治疗效果，利用以下详述的方法进行过敏反应症状的抑制作用的评价。

(1)虾抗原经皮致敏

用剃刀剃去7周龄balb/c雌性小鼠(日本查尔斯河)背部的毛，使用移液器在麻醉下对小鼠的背部涂布以milliq水制备的4％sds(invitrogen公司、cat.15553035)各60μl。放回笼中使其自然干燥后，使用移液器在麻醉下对小鼠的背部涂布用1.5％nahco3/pbs以蛋白质浓度为5mg/ml的方式制备的虾抗原(greer公司、cat.rnf34p)各0.3mg/60μl。作为对照，对6例小鼠涂布1.5％nahco3/pbs各60μl来代替虾抗原。该一系列操作从涂布开始日起每周3次实施2周(第0、2、4、7、9、11天)。为了使各组的致敏水平均一，在第14天采集血浆试样，依据实施例3记载的方法和书籍(免疫测定法从基础到先端、生物化学测定研究会、小林典裕、2014)中记载的通常测定法测定litv1特异性ige、igg1、igg2a抗体效价，利用等数法进行分组。

(2)lamp-litv1-litv4-litv3质粒的皮内免疫

在(1)中分组的各组8例的虾抗原致敏小鼠的耳部每隔一周共计4次皮内给药0.5μg、5μg、50μg/20μlpbs的lamp-litv1-litv4-litv3质粒或作为对照的20μlpbs(第21、28、35、42天)。另外，对6例非致敏小鼠也同样地皮内给药20μlpbs。

(3)由虾抗原所致的过敏症状的诱发

在第50天，对每只小鼠腹腔内给药用1.5％nahco3/pbs制备成0.5mg/ml的虾抗原各0.1mg/200μl，使用小鼠用体温记录仪(a&d公司、cat.ad-1687)测定抗原给药前、给药后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟时的直肠温度。另外，按照1分至5分对抗原给药后60分钟确认到的过敏症状进行评分。症状的判定依据文献(thejournalofallergyandclinicalimmunology、2013、vol.131、p.213-221)的判定基准进行。

为了测定肥大细胞脱颗粒的程度，采集过敏症状诱发60分钟后的血浆，测定小鼠肥大细胞蛋白酶1(mmcpt-1)的血浆中浓度。elisa试剂盒使用小鼠mcpt-1uncoatedelisa(thermofisherscientific公司、cat.88-7503)，依照附带的操作规程进行测定。作为elisa测定的试验板，使用f96maxisorpnunc-immunoplate。制备利用试剂盒附带的稀释液稀释10倍、200倍、40000倍的血浆样品来进行测定，采用落入试剂盒附带的标准样品校准曲线范围的稀释倍率的测定结果作为测定值。

由上述试验的结果表明，在小鼠中，与对照组相比，lamp-litv1-litv4-litv3质粒抑制了虾抗原给药所致的体温降低并且缓解了过敏症状(图4)。此外还确认到，通过lamp-litv1-litv4-litv3质粒给药，抑制了症状诱发60分钟后的血浆中脱颗粒(图5)。这些结果表明，lamp-litv1-litv4-litv3质粒能够用于治疗处置。

产业上的利用可能性

本发明的核酸预期对甲壳类过敏的预防或治疗有用。另外，本发明的生产核酸的方法在上述核酸的生产中有用。

序列表自由文本

下述序列表的数字标题<223>中记载了“人工序列(artificialsequence)”的说明。具体而言，序列表的序列号1所示的碱基序列为编码lamp-litv1-litv4-litv3嵌合蛋白的碱基序列，序列表的序列号2所示的氨基酸序列为由序列号1编码的氨基酸序列。另外，序列号3所示的碱基序列为lamp-litv1-litv4-litv3质粒的碱基序列。

序列表

<110>安斯泰来制药株式会社（astellaspharmainc.）

<120>用于甲壳类过敏治疗的核酸（nucleicacidfortreatmentofcrustaceanallergy）

<130>a19003a00

<150>jp2018-091989

<151>2018-05-11

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3249

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>编码嵌合蛋白的核酸

<220>

<221>cds

<222>(1)..(3249)

<400>1

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<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体（syntheticconstruct）

<400>2

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leuleuleuglyleumethiscysalaseralaalametphemetval

202530

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65707580

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