用于治疗胆道癌的靶向TGF-β抑制的给药方案的制作方法

用于治疗胆道癌的靶向tgf
‑
β
抑制的给药方案
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年6月22日提交的美国临时专利申请号62/688,476和2019年5月31日提交的美国临时专利申请号62/855,205的权益和优先权，其全部公开内容通过引用纳入本文。
3.序列表
4.本申请包含以ascii格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。于2019年6月3日创建的所述ascii拷贝命名为emd
‑
008wo_sl_st25.txt，大小为75,834字节。
技术领域
5.本发明一般涉及用于治疗患者的胆道癌(“btc”)或抑制患者中肿瘤生长的方法的采用双功能融合蛋白的靶向tgf
‑
β抑制的剂量方案，所述患者是未经治疗，或对一线全身化疗失败或不耐受的具有局部晚期或转移性btc的患者。


背景技术：

6.程序性死亡1(pd
‑
1)/pd
‑
l1轴是肿瘤免疫逃逸的重要机制。长期感应抗原的效应t细胞呈现由pd
‑
1表达为标志的衰竭表型，在这种状态下肿瘤细胞通过上调pd
‑
l1参与进来。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞，巨噬细胞，实质细胞和t细胞上调pd
‑
l1。阻断该轴可恢复这些t细胞中的效应功能。
7.美国专利申请公开号us 20150225483 a1，其通过引用纳入本文，描述了一个双官能团融合蛋白，结合抗程序性死亡配体1(pd
‑
l1)抗体及作为tgfβ中和“阱”的肿瘤生长因子贝塔受体ii型(tgfβrii)胞外可溶性域为一个单分子。具体地，该蛋白质是一个异四聚体，由抗
‑
pd
‑
l1的两条免疫球蛋白轻链和两个重链构成，两条重链包含抗
‑
pd
‑
l1重链和通过柔性甘氨酸
‑
丝氨酸接头与之基因融合的人tgfβrii胞外域(见图1)。此抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ陷阱分子被设计为靶向肿瘤微环境中的两个主要免疫抑制机制。美国专利申请公开号us20150225483a1记载了按照基于患者体重的剂量进行该阱分子的给药。
8.btc是一组异质性罕见肿瘤，包括肝内外胆管癌(cca)、胆囊癌(gc)和壶腹癌(ac)。不能切除的btc采用化疗治疗，但中位生存期<1年。本发明涉及用抗pd
‑
l1/tgfβ阱免疫疗法治疗btc。


技术实现要素：

9.本公开提供了施用靶向pd
‑
l1和tgfβ的双功能蛋白的给药方案。具体地，涉及以各种给药频率给予至少500mg(例如1200mg、1800mg、2400mg)所述双功能蛋白的非体重依赖性(非bw依赖性)给药方案和相关剂型可用作抗肿瘤和抗癌疗法。非bw依赖性给药方案确保所有患者，无论其体重如何，都在肿瘤部位有足够的药物暴露。
10.本公开的双功能蛋白(抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)包括第一和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(pd
‑
l1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够
结合转化生长因子β(tgfβ)的人转化生长因子β受体ii(tgfβrii)或其片段(例如可溶性片段)。第二多肽包括：能够结合pd
‑
l1的抗体的至少轻链可变区，其中，第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合pd
‑
l1的抗原结合位点(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。由于本公开的双功能蛋白与两个靶标结合：(1)pd
‑
l1，其大多与膜结合，和(2)tgfβ，其在血液和间质中为可溶形式，非bw依赖性给药方案需要不仅能在肿瘤位点抑制pd
‑
l1且能抑制tgf
‑
的剂量。
11.在一个方面，本发明提供了一种通过向有需要的患者给予本公开所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子来治疗未经治疗的患者中的胆道癌(btc)(例如，肝内胆管癌、肝外胆管癌和法特氏壶腹癌；胆囊癌)或抑制所述患者中的胆道肿瘤生长的方法。在一个方面，本公开提供了有需要的对象中的胆道癌(例如，晚期或转移性胆道癌)的治疗。在一方面，本发明提供治疗呈现阳性pd
‑
l1表达的btc的方法。
12.在某些实施方式中，本发明提供通过每两周向患者给予1200mg本发明的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子一次来在有需要的未经治疗患者中治疗胆道癌(btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法。在某些其他实施方式中，本发明提供通过每三周向患者给予2400mg本发明的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子一次来在有需要的未经治疗患者中治疗胆道癌(btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法。
13.在某些实施方式中，通过将吉西他滨和/或顺铂与本发明中公开的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。在一些实施方式中，通过将吉西他滨和顺铂与本发明中公开的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。
14.在某些实施方式中，本发明描述了治疗方法，其中在治疗周期中，在与蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)同一天(例如，第1天)将吉西他滨和顺铂给予未经治疗患者。在某些实施方式中，在治疗周期的第8天给予吉西他滨和顺铂而不给予蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)。在一些实施方式中，在一段时间(例如，24周)内重复(例如8个周期)治疗(例如，在第1天与吉西他滨和顺铂联合给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱，然后在第8天给予吉西他滨和顺铂)，接着单独给予蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)一段时间(例如，2年)。
15.本公开还包括一种促进tgfβ局部消减的方法。该方法包括施用上述蛋白质，其中该蛋白质在溶液中结合tgfβ，在细胞表面结合pd
‑
l1，并将结合的tgfβ带入细胞(例如胆道癌细胞)内。
16.本公开还包括抑制细胞(例如胆道癌细胞或免疫细胞)中smad3磷酸化的方法，该方法包括令肿瘤微环境中的细胞暴露于上述蛋白质。
17.本公开的其他实施方式和详细内容可见后文。
附图说明
18.图1是抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的示意图，包括一个抗pd
‑
l1抗体与两个tgfβ受体ii胞外域(ecd)通过(gly4ser)4gly(seq id no:11)接头融合。
19.图2显示了两步elisa，显示抗pd
‑
l1/tgfβ阱与pd
‑
l1和tgfβ都结合。
20.图3显示了抗pd
‑
l1/tgfβ阱诱导il
‑
2水平的急剧增加。
21.图4a是显示响应抗pd
‑
l1/tgfβ阱的tgfβ1体内消耗的图。线图表示未经治疗同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4b是显示响应抗pd
‑
l1/tgfβ阱的tgfβ2体内消耗的图。线图表示未经治疗，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4c是显示响应抗pd
‑
l1/tgfβ阱的tgfβ3体内消耗的图。线图表示未经治疗，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4d显示抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子对pd
‑
l1的占据支持emt
‑
6肿瘤系统中的受体结合模型。
22.图5显示了抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子(抗
‑
pd
‑
l1(mut)/tgfβ)在detroit 562异种移植模型中的抗肿瘤效力。
23.图6a是固定剂量(1200mg)对比mg/kg体重剂量(17.65mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
平均
分布箱形图。图6b是固定剂量(1200mg)对比mg/kg体重剂量(17.65mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体暴露auc分布箱线图。图6c是固定剂量(1200mg)对比mg/kg体重剂量(17.65mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
谷
分布箱线图。图6d是固定剂量(1200mg)对比mg/kg体重剂量(17.65mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
最大
分布箱线图。
24.图6e是固定剂量(500mg)对比mg/kg体重剂量(7.35mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
平均
分布箱线图。图6f是固定剂量(500mg)对比mg/kg体重剂量(7.35mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体暴露auc分布箱线图。图6g是固定剂量(500mg)对比mg/kg体重剂量(7.35mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
谷
分布箱线图。图6h是固定剂量(500mg)对比mg/kg体重剂量(7.35mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体c
最大
分布箱线图。
25.图7a
‑
7c是显示在与小鼠肿瘤停滞相关的剂量和方案中抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的预测的pk和pd
‑
l1受体占有(“ro”)的图。图7a是显示预测的血浆浓度对比时间的图。图7b是显示pbmc中预测的pd
‑
l1 ro对比时间的图。图7c是显示肿瘤中预测的pd
‑
l1 ro对比时间的图。
26.图8是实施例2中描述的用于治疗晚期或转移性btc的治疗方案的示意图。
27.图9是实施例4中描述的用于治疗晚期或转移性btc的治疗方案的示意图。
28.图10a
‑
10e是线图，显示在4t1鼠乳腺癌模型中，与同型对照相比，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和顺铂的组合，而非单独的抗pd
‑
l1/tgfβ阱或顺铂增强了抗肿瘤功效。图10a描绘了每个治疗组的平均肿瘤体积，如图所示。图10b
‑
10e是描绘各治疗组中单个小鼠的肿瘤体积的线图：图10b中的每条线表示用同型对照和pbs对照(标记为“同种型对照”)治疗的小鼠的肿瘤体积；图10c中的每条线表示用顺铂单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图10d中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图10e中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱和顺铂组合治疗的小鼠的肿瘤体积。
29.图11a
‑
11e是线图，显示在mb49膀胱癌模型中，与同型对照相比，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨的组合，而非单独的抗pd
‑
l1/tgfβ阱或吉西他滨增强了抗肿瘤功效。图11a描绘了每个治疗组的平均肿瘤体积，如图所示。图11b
‑
11e是描绘各治疗组中单个小鼠的肿瘤体积的线图：图11b中的每条线表示用同型对照和pbs对照(标记为“同种型对照”)治疗的小鼠的肿瘤体积；图11c中的每条线表示用吉西他滨单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图11d中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图11e中的每条线表示
用抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨组合治疗的小鼠的肿瘤体积。
具体实施方式
[0030]“tgfβrii”或“tgfβ受体ii”指具有野生型人tgfβ受体2型同种型a序列(例如ncbi参考序列(refseq)登录号np_001020018(seq id no:8)的氨基酸序列)的多肽，或具有野生型人tgfβ受体2型同种型b序列(例如ncbi参考序列(refseq)登录号np_003233(seq id no:9)的氨基酸序列)的多肽，或具有与seq id no:8或seq id no:9的氨基酸序列基本相同序列的多肽。tgfβrii可保留野生型序列tgfβ结合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％。表达的tgfβrii多肽没有信号序列。
[0031]“能结合tgfβ的tgfβrii片段”指ncbi refseq登录号np_001020018(seq id no:8)或ncbi refseq登录号np_003233(seq id no:9)的任何部分，或与seq id no:8或seq id no:9的氨基酸序列基本相同的序列，其长度为至少20(例如至少30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，175，或200)个氨基酸，并保留至少一些野生型受体或对应的野生型片段的tgfβ结合活性(例如至少0.1％，0.5％，1％，5％，10％，25％，35％，50％，75％，90％，95％，或99％)。通常，此类片段是可溶性片段。示例性片段之一是具有seq id no:10序列的tgfβrii胞外域。
[0032]“未经治疗(treatment)”是指未接受局部晚期或转移性btc的在先化疗或免疫治疗的对象或患者。
[0033]
化疗“失败”或对象经历“失败”化疗，意味着对象的癌症在接受化疗方案治疗时有进展。
[0034]
对化疗的“不耐受”或对象“不耐受”化疗，意味着例如对象经历与化疗相关的高水平毒性(例如，nci不良事件的通用术语标准毒性等级3至5级)，其因化疗导致计划外住院或功能下降，或预期与化疗相关的死亡率。
[0035]“pd
‑
l1阳性”或“pd
‑
l1+”表示例如通过dako ihc 22c3 pharmdx检测或ventana pd
‑
l1(sp263)检测测定≥1％pd
‑
l1阳性肿瘤细胞。
[0036]“pd
‑
l1高”或“高pd
‑
l1”指pd
‑
l1 ihc 73
‑
10检测(dako)测定≥80％pd
‑
l1阳性肿瘤细胞，或dako ihc 22c3 pharmdx检测测定肿瘤比例评分(tps)≥50％(tps是ihc 22c3检测相关术语，描述具有部分或完全膜染色(例如pd
‑
l1染色)的活肿瘤细胞百分数)。ihc 73
‑
10和ihc 22c3检测在各自临界值选取相似的患者群。在一些实施方式中，也可用与22c3 pharmdx检测高度相关的ventana pd
‑
l1(sp263)检测测定pd
‑
l1高表达水平(见sughayer等，appl.immunohistochem.mol.morphol.,(2018))。
[0037]“基本相同”表示多肽与参照氨基酸序列显示至少50％，优选60％、70％、75％或80％，更优选85％、90％或95％，最优选99％的氨基酸序列相同性。比较序列的长度一般至少10个氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，更优选至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续氨基酸，最好是全长氨基酸序列。
[0038]“患者”表示人或非人动物(例如哺乳动物)。“患者”，“对象”，“有需要的患者”和“有需要的对象”在本公开中可互换使用，指患有或易患可通过使用本公开中提供的方法和组合物给药来治疗的疾病或病症的活生物体。
[0039]
本公开中使用的术语“治疗”、“疗法”或其他语法上的等同形式包括减轻，缓解，改
善或预防疾病、病况或症状，预防其他症状，改善或预防症状潜在的代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，缓解疾病或状况，引起疾病或状况消退，缓解由疾病或病况引起的状况或停止疾病或病况的症状，并旨在包括预防。该术语还包括实现治疗获益和/或预防获益。治疗获益是指根除或改善所治疗的潜在疾病。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，由此在患者中观察到改善，尽管患者仍然可能患有潜在病症。
[0040]“癌症”是指晚期或转移性胆道癌(“btc”)。btc的非限制性示例包括胆囊癌(gbc)、胆管癌(cca(肝内胆管癌、肝外胆管癌))和法特氏壶腹癌(vac或壶腹癌)。
[0041]
在本申请文本的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的其他形式，例如“含有”和“包含”，意味着包括但不限于，并且不旨在排除例如其他组分。
[0042]“共同给药”和“共同给予”是指本文所述的组合物在给予另外疗法的同时、临近其前或紧接其后给予。本公开的蛋白质和组合物可以单独给予，或者可以与第二、第三或第四治疗剂共同给予患者。共同给予意在包括以单独或组合(多于一种治疗剂)的形式同时或依次给予蛋白质或组合物。
[0043]
术语“一个(种)”并不意味着限制为单数。在某些实施方式中，术语“一个(种)”可以指复数形式。如本文全文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，提及“组合物”包括多种这样的组合物，以及单一组合物。
[0044]“重建的”制剂是通过将冻干制剂溶解在水性载体中制备的制剂，使得双功能分子溶解在重建的制剂中。重建的制剂适合于对有需要的患者静脉内给药(iv)。
[0045]
术语“约”是指在制剂的制备以及在疾病或病症的治疗中不改变药物效力的药物浓度或量的任何最小改变。在实施方式中，术语“约”可包括指定数值或数据点的
±
15％。
[0046]
本公开中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相关以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。还应理解，本公开公开了多个数值，并且每个数值在本公开中除了作为该数值本身公开之外，还作为“约”该具体数值来公开。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据代表了各种终点和起点以及数据点任意组合而成的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为视为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及10至15之间。还应理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
[0047]“等渗”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂通常具有约250至350mosmol/kgh2o的渗透压。术语“高渗”用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如，可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性。
[0048]
术语“缓冲剂”是指一种或多种组分，当加入到水溶液中，当加入酸或碱时，或在用溶剂稀释时，能够保护溶液免于ph变化。除磷酸盐缓冲液外，还可以使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液等，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可用作反离子。
[0049]“酸”是在水溶液中产生氢离子的物质。“药学上可接受的酸”包括在其配制浓度和
方式上无毒的无机和有机酸。
[0050]“碱”是在水溶液中产生氢氧根离子的物质。“药学上可接受的碱”包括在其配制浓度和方式上无毒的无机和有机碱。
[0051]“冻干保护剂”是当与感兴趣的蛋白质结合时，防止或减少冻干和随后储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。
[0052]“防腐剂”是降低细菌作用的物质，并且可以任选地添加至本文的制剂中。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。可用防腐剂的示例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵，六甲基氯化铵，苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇如苯酚，丁醇和苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3
‑
戊醇和间甲酚。
[0053]“表面活性剂”是含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羧酸酯/盐基团)的表面活性分子。可以将表面活性剂添加到本发明的制剂中。适用于本发明制剂的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；曲通(triton)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基
‑
、肉豆蔻酰基
‑
、亚油基
‑
或硬脂基
‑
磺基丁二烯(sulfobetadine)；十二烷基
‑
、肉豆蔻酰基
‑
、亚油基
‑
或硬脂基
‑
肌氨酸；亚油基
‑
，肉豆蔻基
‑
或十六烷基
‑
甜菜碱；月桂酰胺丙基
‑
椰油酰胺丙基
‑
、亚油酰胺丙基
‑
、肉豆蔻酰胺丙基
‑
、棕榈酰胺丙基
‑
或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰氨丙基
‑
，棕榈胺酰丙基
‑
或异硬脂酰胺丙基
‑
二甲基胺；甲基椰油酰基
‑
牛磺酸钠，或甲基油酰基
‑
牛磺酸二钠；和monaquat
tm
系列(蒙钠工业公司(mona industries,inc.)，新泽西州帕特森(paterson,n.j.))，聚乙二醇，聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如pluronics，pf68等)。
[0054]
非体重依赖性给药方案
[0055]
根据分子的各种临床前和临床评估的结果，已经开发出了与体重无关的给药方案，该方案涉及向btc患者给予至少500mg的本文所述的双功能抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。有两项研究调查了该分子的安全性，耐受性和药代动力学，包括评估了从治疗的患者血液中获得的外周血单核细胞上的pd
‑
l1目标占有率，并测量了tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3的浓度。这些评估基于来自总共350名对象的数据(实体肿瘤中1，3，10和20mg/kg的剂量递增组，以及选择的肿瘤类型中3mg/kg，10mg/kg，500mg和1200mg的扩展组)。
[0056]
pk/功效模型(小鼠模型)
[0057]
还实验确定了抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子在肿瘤模型中的功效。用来自emt
‑
6异种移植体的功效结果建立pk/功效模型。在小鼠中建立的pk模型用于模拟抗pd
‑
l1/tgfβ阱血浆暴露以进行功效实验设置。估测参数见表1。估测kc50值为55.3μg/ml。该值代表平均血浆浓度，对于该浓度，可获得50％的抗pd
‑
l1/tgfβ陷阱分子最大抗肿瘤活性。
[0058]
该模型的基本诊断图显示没有模型错误。模型预测能够获取肿瘤体积分布。条件加权残差通常以0均值和1方差分布而没有趋势。然后使用pk/功效模型采用不同剂量的人预测浓度
‑
时间曲线来模拟肿瘤生长抑制(tgi)。
[0059]
表1：emt
‑
6异种移植小鼠中抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的小鼠pk/功效模型参数
[0060]
参数估计值stdcv％％iivk
g
(h
‑1)0.0680.00050.8240
k
tr
(h
‑1)0.0550.00244.476kc
50
(ng/ml)55324.6522.34.4232k
最大
20.09193基线(mm3)88.30.87147
[0061]
基于pd
‑
l1占用率的缓解分析(在小鼠模型中)
[0062]
使用功效实验，分析了小鼠中的效果并通过肿瘤消退或肿瘤停滞进行分选，并且基于整合pk/ro模型预测了pk和pd
‑
l1受体占用(ro)。该方法表明，要达到肿瘤消退需要40至100μg/ml的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子血浆浓度，该浓度关联瘤内pd
‑
l1 ro高于95％。达到肿瘤停滞状态需要外周的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的血浆浓度在10至40μg/ml之间，且pd
‑
l1 ro高于95％。
[0063]
小鼠中的效果分析和预测pk/ro见图7a
‑
7c，其总结了抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子在小鼠中的pk/ro/功效。在血浆浓度为40μg/ml时达到95％的pd
‑
l1 ro，预期/估测tgi仅为约65％。将浓度升至高于40μg/ml会导致肿瘤生长抑制的进一步增强。在平均血浆浓度为约100μg/ml时实现95％的肿瘤生长抑制。
[0064]
基于下面描述的群体pk模型，需要每两周给予一次至少500mg的平剂量(flat dose)以维持约100μg/ml的平均浓度，需要每两周给予一次约1200mg的平剂量以维持约100μg/ml的c
谷
。在某些实施方式中，向对象给予约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的本公开蛋白质产物(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)。一些实施方式中，每两周一次向对象给予约1200mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向对象给予约1,800mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。
[0065]
在某些实施方式中，向对象给予约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的蛋白质产物用于治疗btc或抑制胆道肿瘤生长，该蛋白质产物具有第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括氨基酸序列seq id no:3，所述第二多肽包括氨基酸序列seq id no:1。在某些实施方式中，向对象给予约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的蛋白质产物用于治疗btc或抑制胆道肿瘤生长，该蛋白质产物具有第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括氨基酸序列seq id no:35、36和37，所述第二多肽包括氨基酸序列seq id no:38、39和40。
[0066]
在某些实施方式中，将约1200mg具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象用于治疗btc或抑制胆道肿瘤生长。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象用于治疗btc或抑制胆道肿瘤生长。在某些实施方式中，将约1200mg具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象用于治疗btc或抑制胆道肿瘤生长。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象用于治疗btc或
抑制胆道肿瘤生长。
[0067]
建立非体重依赖性给药方案
[0068]
根据临床和临床前数据，已开发出一种新的非体重依赖性给药方案，用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的给药，以降低暴露差异，减少给药误差，减少进行剂量准备所需的时间，与mg/kg给药相比可减少药物浪费，从而促进实现良好的治疗效果。根据一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少500mg的平剂量。根据另一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少1200mg的平剂量。根据另一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少1800mg的平剂量。根据某些实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少2400mg的平剂量。通常，这些剂量可以重复给药，例如每两周一次或每三周一次。例如，为了治疗btc或抑制胆道肿瘤生长，可以每两周一次给予1200mg的平剂量，或者可以每三周一次给予1800mg的平剂量，或者可以每三周一次给予2400mg的平剂量。
[0069]
人中的药代动力学(pk)分析取样
[0070]
通过下述实验提供确定抗pd
‑
l1/tgfβ阱最佳平剂量的药代动力学分析实例。
[0071]
在第一剂量开始前和第一剂量后的下列时间点收集用于药代动力学(pk)数据分析的血清样品：在输注后即刻第1天和输注开始后4小时；在第1天输注结束后至少24小时的第2天；以及在第8天和第15天。在第15、29、43天，在给药前、输注结束时和输注结束后2至8小时的选定后续给药时机收集样品。对于第57，71和85天的后续时间点，收集或计划收集给药前样品，然后每6周一次pk取样直至12周，然后每12周一次pk取样。在延展阶段(expansion phase)，进行稀疏pk取样。
[0072]
上述pk数据用于生成群体pk模型并进行可能的给药方案模拟。将称为全方案模型(full approach model)(见gastonguay,m.，全协变量模型作为方法的替代方案，依赖于关于协变量效应的推论的统计显著性：方法学和42个案例研究综述(full covariate models as an alternative to methods relying on statistical significance for inferences about covariate effects:a review of methodology and 42case studies)，(2011)，第20页，摘要2229)的建模方法应用于由模拟获得的群体模型数据以获得具有以下特征的参数：具有线性消除的二室pk模型，cl，v1和v2的iiv，组合的加和和比例残差，cl和v1的全协变量模型。以下基线协变量包括在最终模型中：年龄，体重，性别，种族，白蛋白，crp，血小板计数，egfr，肝损伤，ecog评分，肿瘤大小，肿瘤类型和生物制剂先前治疗。获得了本公开的蛋白质(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)的以下药代动力学典型参数估值：清除率(cl)0.0177升/小时(6.2％)，中央分布体积(v1))3.64升(8.81％)，外周分布体积(v2)0.513升(25.1％)，室间清除率(q)0.00219升/小时(17.8％)。cl的患者间差异为22％，v1为20％，v2为135％。体重是cl和v1的相关协变量。为了支持统一给药方法，研究了给药策略对本发明蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱)的接触变动的影响。具体而言，进行模拟以比较暴露分布，采用每两周一次1200mg的平剂量给药方法，对比每两周一次17.65mg/kg(对应于68kg对象每两周一次1200mg)或每两周一次15mg/kg(对应于80kg对象1200mg)的bw调整给药方案。进行进一步模拟以比较每两周一次500mg平剂量给药方案对比每两周一次7.35mg/kg(对应于68kg对象每两周一次500mg)的bw调整给药方案的暴露分布。另外，进行模拟以评估以下每三周一次平剂量：1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，2000mg，2200mg，2400mg，2600mg，2800mg，和3000mg。
[0073]
使用以下模拟方法：使用最终pk模型方差
‑
协方差矩阵，从参数估测值的多元正态分布中抽取n＝200组参数估测值。对于每个参数估测，从$omega多变量正态分布中抽取200个iiv估测值，得到总共40000(200
×
200)个主题。对原始数据集(n＝380)进行重新替换取样生成每种给药方案的40000组匹配的协变量和稳态暴露指标(auc，c
平均
，c
谷
和c
最大
)。
[0074]
模拟显示，与固定剂量相比，宽bw范围的基于bw给药的暴露差异略高。图6a和6e分别显示了对于中位体重68kg，17.65mg/kg和1200mg平剂量或7.35mg/kg和500mg平剂量的暴露分布的示例。模拟还显示患者群体中四分位体重的暴露分布的相反趋势：低体重患者采用固定剂量具有较高暴露，而高体重患者采用bw调整剂量具有较高暴露。
[0075]
建立人的有效剂量/给药方案：每2周一次(q2w)给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱后二线非胆道癌(2l btc)中的初步剂量
‑
响应
[0076]
通过下述临床研究来建立抗pd
‑
l1/tgfβ阱的疗效的实例。
[0077]
在铂类一线(“1l”)治疗后进展的转移性或局部晚期btc患者每两周接受一次1200mg本发明抗pd
‑
l1/tgfβ阱，直到确认进展性疾病、不可接受的毒性或停药。主要目标是评估安全性/耐受性，而次要目标包括根据《实体瘤疗效评估标准1.1版》(recist v1.1)中的效果评估标准来评估总体最佳疗效(bor)。评估肿瘤细胞pd
‑
l1表达(抗体克隆73
‑
10；大科(dako))。
[0078]
截至分析时的截止数据，有30名具有预先治疗的btc的患者接受了抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗，中位时间为8.9周(范围2
‑
57.6周)。5名患者仍在接受治疗。最常见的治疗相关不良事件(trae)是发热，斑丘疹(都是13.3％)，皮疹和脂肪酶增加(都是10％)。10名患者(33.3％)经历了≧3级trae。报告3例因不良事件的死亡；1例因14次给药后感染性休克(菌血症可能因皮肤感染)的死亡，2例因间质性肺病的死亡，1例在3次给药后治疗时死亡，另1例在最后一次给药后6个月死亡。6名患者有明确的客观缓解(orr，20％)，其中5名患者有部分缓解(pr)，4名患者在3.9+、4.2+、5.5+和6.9+个月时仍在接受治疗，1名患者在5.5+个月时完全缓解(cr)。另外两名患者有持续的临床获益：一名患者在治疗1年后出现部分缓解(“pr”)，一名患者在首次假性进展后7.6+个月时出现持续的pr。pd
‑
l1阳性(≥1％)和pd
‑
l1阴性肿瘤患者pd
‑
l1表达证实的orr分别为25％和15.4％。
[0079]
这些结果表明，抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法在具有预治疗的btc的患者中具有可管理的安全性和有希望的疗效，包括30例患者中的8例(27％)的长期缓解。作为二线(“2l”)治疗观察到的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的这种有希望的活性有望转化为或增加为1l单一疗法或联合治疗(如与吉西他滨和顺铂)以治疗未经治疗的局部晚期或转移性btc患者。
[0080]
建立具有不同给药频率的给药方案
[0081]
创建了具有各种给药频率的数据方案以允许较低频率的给药和/或允许给药计划与相伴用药相协调。具体地，前述初步群体pk建模和模拟方法被用于模拟各种给药方案的暴露并基于暴露来进行方案之间的比较。
[0082]
基于这些模拟，对于一般对象，需要每两周给予一次至少500mg的平剂量以维持约100μg/ml的平均浓度，需要每两周给予一次约1200mg的平剂量以维持约100μg/ml的c
谷
。
[0083]
基于c
平均
的模拟，每两周一次1200mg相当于每三周一次1800mg，而对于c
谷
，每两周一次1200mg相当于每三周一次2,400mg。对于c
平均
来说，每两周一次500mg相当于每三周一次750mg；对于c
谷
来说，每两周一次500mg相当于每三周一次1167mg。
[0084]
抗pd
‑
l1/tgfβ阱与全身化疗(通常每三周给药一次)同时给药时，选择2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱每三周给药一次作为第2阶段剂量。对于每三周给药一次的选择，稳态给药间隔内的c
谷,ss
和平均浓度应与每两周给药一次1200mg相近或更高，并且大多数患者的c
谷,ss
应高于50μg/ml的目标浓度。在每三周给药一次2400mg的给药间隔期间，平均稳态浓度预计约为328μg/ml。在每两周给药一次1200mg的给药间隔期间，平均稳态浓度预计约为246μg/ml。
[0085]
tgfβ为癌症靶标
[0086]
本公开允许通过使用与抗体部分系连的可溶性细胞因子受体(tgfβrii)捕获tgfβ从而在肿瘤微环境中局部降低tgfβ，所述抗体部分靶向某些肿瘤细胞或免疫细胞外表面上的细胞免疫检查点受体。本公开抗体部分的一个例子是针对免疫检查点蛋白的如抗pd
‑
l1。该双功能分子，有时在本文中亦称“抗体
‑
细胞因子阱”，是确实有效的，因为抗受体抗体与细胞因子阱物理连接。由此产生的优势(例如相对于所述抗体和所述受体分开给药)部分归因于细胞因子通过自泌和旁泌作用成为局部环境中的主要作用。抗体部分将细胞因子阱引向肿瘤微环境，细胞因子阱在此可通过中和局部免疫抑制性自泌或旁泌作用而表现得最为有效。此外，当抗体的靶标一旦被抗体结合即被内化，则由此提供了清除细胞因子/细胞因子受体复合物的有效机制。显示了pd
‑
l1的抗体介导的靶标内化作用，抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示出与抗pd
‑
l1相似的内化率。与使用抗tgfβ抗体相比，这是一个明显的优势，因为首先抗tgfβ抗体可能无法完全中和；其次，抗体可以作为载体来延长细胞因子的半衰期。
[0087]
事实上，如下所述，由于阻断肿瘤细胞上pd
‑
l1和免疫细胞上pd
‑
1之间相互作用的同时中和肿瘤微环境中tgfβ，抗pd
‑
l1/tgfβ阱的治疗引发了协同抗肿瘤作用。不受理论的束缚，这大概是由于通过同时阻断两种主要的免疫逃逸机制而获得的协同作用，而且肿瘤微环境中的tgfβ被单分子实体耗竭。所述耗竭是通过(1)抗pd
‑
l1靶向肿瘤细胞；(2)肿瘤微环境中的tgfβ自泌/旁泌被tgfβ阱所结合和(3)被结合的tgfβ被pd
‑
l1受体介导的内吞作用所破坏。并且，tgfβrii融合于fc(igg的结晶片段)的c末端比将tgfβrii置于fc的n末端的tgfβrii
‑
fc强数倍。
[0088]
tgfβ由于其作为癌症“分子双面体”(“jekyll and hyde”)的自相矛盾作用在癌症免疫治疗中曾经是有些质疑的靶标(bierie等，nat.rev.cancer，2006；6：506
‑
20)。就像其他有些细胞因子，tgfβ活性具有发育阶段和背景依赖性。实际上，tgfβ可以充当肿瘤启动子或肿瘤抑制物，影响肿瘤的发生，发展和转移。tgfβ双重作用的潜在机制尚不清楚(yang等，trends immunol.2010；31:220
–
227)。尽管已经假设smad依赖性信号传导介导tgfβ信号传导的生长抑制，而smad非依赖性信号通路可促进其促肿瘤作用，但也有数据表明smad依赖性信号通路参与了肿瘤的发展(yang等，cancer res.2008；68:9107
‑
11)。
[0089]
tgfβ配体和受体都作为治疗靶标被深入研究。有三种配体同种型：tgfβ1、2和3，都是均二聚体。还存在三种tgfβ受体(tgfβr)，称为i，ii和iii型tgfβr(l
ó
pez
‑
casillas等，j cell biol.1994；124：557
‑
68)。tgfβri是信号传导链并但不结合配体。tgfβrii高亲合力地结合配体tgfβ1和3，对tgfβ2则不然。tgfβrii/tgfβ复合物募集tgfβri形成信号传导复合物(won等，cancer res.1999；59:1273
‑
7)。tgfβriii是tgfβ与其信号传导受体结合的正向调节物，并以高亲和性结合全部3种tgfβ同种型。在细胞表面上，tgfβ/tgfβriii复合物结合tgfβrii，然后募集tgfβri取代tgfβriii形成信号传导复合物。
[0090]
尽管三种不同的tgfβ同种型均通过同一受体传导信号，但已知它们在体内具有差
异表达模式和不重叠的功能。敲除了三种不同tgf
‑
β同种型的小鼠具有不同的表型，表明它们有许多非代偿行的功能(bujak等，cardiovasc res.2007；74:184
‑
95)。tgfβ1缺失的小鼠有造血和血管生成缺陷，tgfβ3缺失小鼠表现出肺部发育和颚发育缺陷，tgfβ2缺失小鼠表现出各种发育异常，最突出的是多发性心脏畸形(bartram等，circulation，2001；103：2745
‑
52；yamagishi等，anat rec.2012；295：257
‑
67)。此外，tgfβ还在缺血和再灌注损伤后的心肌损伤修复中起重要作用。在成人心脏中，心肌细胞分泌tgfβ作为自泌物维持自发搏动速率。重要的是，心肌细胞分泌的tgfβ的70
‑
85％是tgfβ2(roberts等，j clin invest.1992；90：2056
‑
62)。尽管tgfβri激酶抑制剂治疗引起心脏毒性问题，但本申请的申请人发现抗pd
‑
l1/tgfβ阱在猴中没有毒性，包括心脏毒性。
[0091]
中和tgfβ的治疗方法包括采用tgfβ受体的胞外域作为可溶性受体阱和中和抗体。在受体阱捕获方法中，可溶性tgfβriii似乎是显然的选择，因为它结合所有三种tgfβ配体。然而，tgfβriii的天然形式是280
‑
330kd的葡糖胺聚糖(gag)
‑
糖蛋白，具有762个氨基酸残基的胞外域，对于生物治疗开发来说是非常复杂的蛋白质。可在昆虫细胞中产生去gag的可溶性tgfβriii并已经显示是有效的tgfβ中和剂(vilchis
‑
landeros等biochem.j.,(2001),355:215)。tgfβriii的两个独立的结合域(内皮糖蛋白相关和尿调节蛋白相关)可以独立表达，但显示亲和力比可溶性tgfβriii低20至100倍，中和活性大大降低(mendoza等，biochemistry.，2009；48：11755
‑
65)。另一方面中，tgfβrii的胞外域长度仅为136个氨基酸残基，可以25
‑
35kd糖蛋白质的形式生产。重组可溶性tgfβrii还显示以200pm的k
d
结合tgfβ1，这与细胞上全长tgfβrii的50pm的kd相当近似(lin等，j.biol.chem.(1995),270:2747
‑
54)。对可溶性tgfβrii
‑
fc进行了作为抗癌剂的测试，在肿瘤模型中表现为能够抑制已建立鼠恶性间皮瘤生长(suzuki等，clin.cancer res.,(2004),10:5907
‑
18)。由于tgfβrii不结合tgfβ2，tgfβriii结合tgfβ1和3的亲和力低于tgfβrii，于是在细菌中生产tgfβriii的内皮糖蛋白结构域与tgfβrii胞外域的融合蛋白，该蛋白在细胞实验中表现为抑制tgfβ1和2的信号传导比tgfβrii或riii更有效(verona等，protein eng’g.des.sel.(2008),21:463
‑
73)。
[0092]
中和tgfβ配体所有三种同种型的另一种方法是筛选泛中和性抗tgfβ抗体，或阻断受体与tgfβ1、2和3结合的抗受体抗体。gc1008是对全部tgfβ同种型特异的人抗体，已进入晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌患者的i/ii期研究(morris等，j.clin.oncol.(2008),26:9028(会议摘要))。尽管发现该治疗是安全且耐受性良好的，但仅观察到有限的临床疗效，因此在未进一步表征免疫学作用的情况下难以解释抗tgfβ治疗的重要性(flavell等，nat.rev.immunol.(2010),10:554
‑
67)。也有tgfβ同种型特异性抗体进入临床试验。麦特丽珠单抗(metelimumab)是tgfβ1的特异性抗体，已在预防青光眼手术后瘢痕过多的2期临床试验中；在一项3期研究中，发现tgfβ2特异性抗体勒德立木单抗(lerdelimumab)是安全的，但在改善眼部手术后的瘢痕形成方面无效(khaw等，ophthalmology(2007),114:1822
–
1830)。阻断受体与全部三种tgfβ同种型结合的抗tgfβrii抗体，例如抗人tgfβrii抗体tr1和抗小鼠tgfβrii抗体mt1，也显示出对小鼠原发性肿瘤生长和转移的一些治疗功效(zhong等，clin.cancer res.(2010),16:1191
‑
205)。然而，在最近一项抗体tr1(ly3022859)的i期研究中，尽管是预防性治疗，超过25mg的更高剂量(平剂量)因为细胞因子释放失控被认为不安全(tolcher等，cancer chemother.pharmacol.(2017),79:673
‑
680)。迄今为止，绝大
多数对tgfβ靶向抗癌治疗的研究，包括通常具有相当毒性的tgfβ信号传导小分子抑制剂，大多数处于临床前阶段，并且抗肿瘤效果非常有限(calone等，exp.oncol.(2012),34:9
‑
16；connolly等，int.j.biol.sci.(2012),8:964
‑
78)。
[0093]
本公开的抗体
‑
tgfβ阱是双功能蛋白，其包含能够结合tgfβ的人tgfβ受体ii(tgfβrii)的至少部分。在一些实施方式中，tgfβ阱多肽是能够结合tgfβ的2型人tgfβ受体同种型a(seq id no:8)的可溶性部分。在某些实施方式中，tgfβ阱多肽包含至少seq id no:8的氨基酸73
‑
184。在某些实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:8的氨基酸24
‑
184。在一些实施方式中，tgfβ阱多肽是能够结合tgfβ的2型人tgfβ受体同种型b(seq id no:9)的可溶性部分。在某些实施方式中，tgfβ阱多肽包含至少seq id no:9的氨基酸48
‑
159。在某些实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:9的氨基酸24
‑
159。在某些实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:9的氨基酸24
‑
105。
[0094]
作用机制
[0095]
用治疗性抗体靶向t细胞抑制检查点来去抑制(dis
‑
inhibition)是一个具有深入研究的领域(综述可见pardoll,nat.rev.cancer(2012),12:253
‑
264)。方案之一中，抗体部分或其抗原结合片段靶向t细胞上的t细胞抑制哨点受体蛋白，例如：ctla
‑
4、pd
‑
1、btla、lag
‑
3、tim
‑
3和lair1。另一方案中，抗体部分靶向抗原呈递细胞和肿瘤细胞(它们选择这些反受体中的某些用于它们自身的免疫逃逸)上的反受体(counter
‑
receptor)，例如：pd
‑
l1(b7
‑
h1)、b7
‑
dc、hvem、tim
‑
4、b7
‑
h3或b7
‑
h4。
[0096]
本公开考虑通过其抗体部分或其抗原结合片段靶向t细胞抑制检查点的抗体tgfβ阱来去抑制。为此，申请人测试了tgfβ阱与靶向多种t细胞抑制哨点受体蛋白的抗体(例如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1、抗tim
‑
3和抗lag3)联合的抗肿瘤效果。
[0097]
程序性死亡1(pd
‑
1)/pd
‑
l1轴是肿瘤免疫逃逸的重要机制。长期感应抗原的效应t细胞呈现由pd
‑
1表达为标志的衰竭表型，在这种状态下肿瘤细胞通过上调pd
‑
l1参与进来。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞，巨噬细胞，实质细胞和t细胞上调pd
‑
l1。阻断该轴可恢复这些t细胞中的效应功能。抗pd
‑
l1/tgfβ阱还结合tgfβ(1、2和3个同种型)，其是在肿瘤微环境中由凋亡性中性粒细胞，髓样抑制细胞，t细胞和肿瘤等细胞产生的抑制性细胞因子。可溶性tgfβrii抑制tgfβ减少了恶性间皮瘤，其方式与cd8+t细胞抗肿瘤作用的增加有关。已经显示，由活化的cd4+t细胞和treg细胞产生的tgfβ1的缺失可抑制肿瘤生长，并保护小鼠免于自发性癌症。因此，tgfβ对于肿瘤免疫逃逸似乎是重要的。
[0098]
tgfβ对正常上皮细胞具有生长抑制作用，起着上皮细胞稳态调节剂作用，并且在早期癌症发生过程中起着抑瘤作用。随着肿瘤向恶性发展，tgfβ对肿瘤的生长抑制作用由于一种或多种tgfβ通道信号传导成分的突变或致癌性重编程而丧失。一旦失去对tgfβ抑制的敏感性，肿瘤就会继续产生高水平的tgfβ，从而促进肿瘤的生长。tgfβ细胞因子在多种癌症类型中过表达，与肿瘤分期相关。肿瘤微环境中许多类型的细胞都会产生tgfβ，包括肿瘤细胞本身，未成熟的髓样细胞，调节性t细胞和基质成纤维细胞；这些细胞在细胞外基质中共同产生大量的tgfβ储库。tgfβ信号传导通过促进转移，刺激血管生成以及抑制先天性和适应性抗肿瘤免疫力促进肿瘤进展。作为一种广泛的免疫抑制因子，tgfβ直接下调活化的细胞毒性t细胞和nk细胞的效应子功能，并有效诱导原初cd4+t细胞分化为免疫抑制调节性t细胞(treg)表型。另外，tgfβ使巨噬细胞和嗜中性粒细胞极化为伤口愈合表型，该表型与
免疫抑制细胞因子的产生有关。作为一种治疗策略，tgfβ活性的中和具有通过恢复有效的抗肿瘤免疫力，阻断转移和抑制血管生成来控制肿瘤生长的潜力。
[0099]
联合这些通路，pd
‑
1或pd
‑
l1和tgfβ，作为抗肿瘤方法是有吸引力的。伴随的pd
‑
1和tgfβ阻断可以恢复促炎性细胞因子。抗pd
‑
l1/tgfβ阱包括例如：人tgfβ受体tgfβrii的胞外域，其经由甘氨酸/丝氨酸接头共价连接至完全人igg1抗pd
‑
l1抗体的每条重链的c末端。鉴于抗pd
‑
1/pd
‑
l1类的新兴蓝图，其中响应明显但具有增加效应大小的空间，据信，共同靶向互补免疫调节步骤将改善肿瘤响应。一种类似的tgf
‑
靶向剂弗瑞索单抗(fresolimumab)是一种针对tgfβ1、2和3的单克隆抗体，在一项针对黑色素瘤患者的i期试验中显示出了肿瘤缓解的初步证据。
[0100]
本公开提供实验表明抗pd
‑
l1/tgfβ阱的tgfβrii部分(阱对照“抗
‑
pdl
‑
1(mut)/tgfβ阱)引起抗肿瘤活性。”例如，在detroit562人咽癌模型中皮下植入后，当以25μg，76μg或228μg的剂量给药时，抗pdl1(mut)/tgfβ阱引起肿瘤体积的剂量依赖性减小(图5)。
[0101]
本公开提供实验表明本公开的蛋白质同时结合pd
‑
l1和tgfβ(图2)。
[0102]
本公开提供实验表明，在体外，本公开的蛋白质(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)抑制pd
‑
l1和tgfβ依赖性信号传导。本公开提供实验，其证明本公开的蛋白质通过阻断pd
‑
l1介导的免疫抑制在体外增强t细胞效应功能，如通过超抗原刺激后的il
‑
2诱导测定所测量(图3)。在约100ng/ml时，本公开的蛋白质在体外诱导il
‑
2水平的显著增加(图3)。
[0103]
本公开提供实验表明，在体内，本公开的蛋白质(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)引起血液中tgfβ的消减。用55μg，164μg或492μg本公开的蛋白质处理jh小鼠中原位植入的emt
‑
6乳腺癌细胞有效且特异性地消减tgfβ1(图4a)，tgfβ2(图4b)和tgfβ3(图4c)。此外，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质占据pd
‑
l1靶标，支持本公开的蛋白质契合emt
‑
6肿瘤系统中的受体结合模型的概念(图4d)。
[0104]
本公开提供了实验，该实验证明了本公开的蛋白质有效地，特异性地同时与pd
‑
l1和tgfβ结合，在多种小鼠模型中具有有效的抗肿瘤活性，抑制了肿瘤的生长和转移，以及生存期延长和赋予长期的保护性抗肿瘤免疫力。
[0105]
抗pd
‑
l1抗体
[0106]
本公开的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子可以包括本领域中描述的任何抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。抗pd
‑
l1抗体是可购得的，例如29e2a3抗体(biolegend，批号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括fab、f(ab’)2、scfv和fv片段，详见后文。
[0107]
示例性抗体可见pct公开文本wo 2013/079174。这些抗体可包含含有hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3序列的重链可变区多肽，其中：
[0108]
(a)hvr
‑
h1序列是x1yx2mx3(seq id no:21)；
[0109]
(b)hvr
‑
h2序列是siypsggx4tfyadx5vkg(seq id no:22)；
[0110]
(c)hvr
‑
h3序列是iklgtvttvx6y(seq id no:23)；
[0111]
其中：x1是k、r、t、q、g、a、w、m、i或s；x2是v、r、k、l、m或i；x3是h、t、n、q、a、v、y、w、f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d。
[0112]
实施方式之一中，x1是m、i或s；x2是r、k、l、m或i；x3是f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d。
[0113]
另一个实施方式中，x1是m、i或s；x2是l、m或i；x3是f或m；x4是i；x5是s或t；x6是d。
[0114]
另一个实施方式中，x1是s；x2是i；x3是m；x4是i；x5是t；x6是d。
[0115]
另一方面中，所述多肽还包含位于hvr之间的可变区重链框架序列，如下所示：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)。
[0116]
另一个方面，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。
[0117]
另一方面中，所述框架序列至少之一如下所述：
[0118]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs(seq id no:24)；
[0119]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs(seq id no:25)；
[0120]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar(seq id no:26)；
[0121]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss(seq id no:27)。
[0122]
另一方面中，重链多肽进一步与包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3的可变区轻链组合，其中：
[0123]
(a)hvr
‑
l1序列是tgtx7x8dvgx9ynyvs(seq id no:28)；
[0124]
(b)hvr
‑
l2序列是x
10
vx
11
x
12
rps(seq id no:29)；
[0125]
(c)hvr
‑
l3序列是ssx
13
tx
14
x
15
x
16
x
17
rv(seq id no:30)；
[0126]
其中：x7是n或s；x8是t、r或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是i、n或s；x
12
是d、h或n；x
13
是f或y；x
14
是n或s；x
15
是r、t或s；x
16
是g或s；x
17
是i或t。
[0127]
另一实施方式中，x7是n或s；x8是t、r或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0128]
另一实施方式中，x7是s；x8是s；x9是g；x
10
是d；x
11
是s；x
12
是n；x
13
是y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是s；x
17
是t。
[0129]
另一方面中，所述轻链还包含位于hvr之间的可变区轻链框架序列，如下所示：(lc
‑
fr1 mhvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0130]
另一方面中，所述轻链框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。
[0131]
另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。
[0132]
另一方面中，所述框架序列至少其一如下所述：
[0133]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc(seq id no:31)；
[0134]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy(seq id no:32)；
[0135]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc(seq id no:33)；
[0136]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl(seq id no:34)。
[0137]
另一实施方式中，本公开提供抗pd
‑
l1抗体或包含重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：
[0138]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，并且其中：(i)hvr
‑
h1序列是x1yx2mx3(seq id no:21)；(ii)hvr
‑
h2序列是siypsggx4tfyadx5vkg(seq id no:22)；(iii)hvr
‑
h3序列是iklgtvttvx6y(seq id no:23),且；
[0139]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，并且其中：(iv)hvr
‑
l1序列是tgtx7x8dvgx9ynyvs(seq id no:28)；(v)hvr
‑
l2序列是x
10
vx
11
x
12
rps(seq id no:29)；(vi)hvr
‑
l3序列是ssx
13
tx
14
x
15
x
16
x
17
rv(seq id no:30)；其中:x1是k、r、t、q、g、a、w、m、i或s；x2是v、r、k、l、m或i；x3是h、t、n、q、a、v、y、w、f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d；x7是n或s；x8是
t，r或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是i，n或s；x
12
是d、h或n；x
13
是f或y；x
14
是n或s；x
15
是r、t或s；x
16
是g或s；x
17
是i或t。
[0140]
实施方式之一中，x1是m、i或s；x2是r、k、l、m或i；x3是f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d；x7是n或s；x8是t，r或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0141]
另一实施方式中，x1是m、i或s；x2是l、m或i；x3是f或m；x4是i；x5是s或t；x6是d；x7是n或s；x8是t、r或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0142]
在另一个实施方式中，x1是s；x2是i；x3是m；x4是i；x5是t；x6是d；x7是s；x8是s；x9是g；x
10
是d；x
11
是s；x
12
是n；x
13
是y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是s；x
17
是t。
[0143]
另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于hvr之间的一个或多个框架序列：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于hvr之间的一个或多个框架序列：(lc
‑
fr1 mhvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0144]
另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系序列。
[0145]
另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：
[0146]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs(seq id no:24)；
[0147]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs(seq id no:25)；
[0148]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar(seq id no:26)；
[0149]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss(seq id no:27)。
[0150]
另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。
[0151]
另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：
[0152]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc(seq id no:31)；
[0153]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy(seq id no:32)；
[0154]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc(seq id no:33)；
[0155]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl(seq id no:34)。
[0156]
另一方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含至少c
h
1结构域。
[0157]
在一更具体的方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含c
h
1、c
h
2和c
h
3结构域。
[0158]
另一方面中，可变区轻链、抗体或抗体片段还包含c
l
结构域。
[0159]
另一方面中，抗体还包括c
h
1、c
h
2、c
h
3和c
l
结构域。
[0160]
另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。
[0161]
另一方面中，人恒定区选自igg1、igg2、igg2、igg3和igg4。
[0162]
在一更具体的方面中，人或鼠恒定区是lgg1。
[0163]
另一实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0164]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，它们分别与syimm(seq id no:35)、siypsggitfyadtvkg(seq id no:36)和iklgtvttvdy(seq id no:37)具有至少80％总体序列相同性，且
[0165]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，它们分别与tgtssdvggynyvs(seq id no:38),dvsnrps(seq id no:39),和ssytssstrv(seq id no:40)具有至少80％总体序列相同性。
[0166]
在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0167]
另一实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0168]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，它们分别与mymmm(seq id no:41)、siypsggitfyadsvkg(seq id no:42)和iklgtvttvdy(seq id no:37)具有至少80％总体序列相同性，且
[0169]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，它们分别与tgtssdvgaynyvs(seq id no:43),dvsnrps(seq id no:39),和ssytssstrv(seq id no:40)具有至少80％总体序列相同性。
[0170]
在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0171]
另一方面中，本公开的抗体或抗体片段中，相比hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：
[0172]
(a)在hvr
‑
h1中：syimm(seq id no:35)，
[0173]
(b)在hvr
‑
h2中：siypsggitfyadtvkg(seq id no:36)，
[0174]
(c)在hvr
‑
h3中：iklgtvttvdy(seq id no:37)；
[0175]
并且其中，相比hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：
[0176]
(a)hvr
‑
l1 tgtssdvggynyvs(seq id no:38)
[0177]
(b)hvr
‑
l2 dvsnrps(seq id no:39)
[0178]
(c)hvr
‑
l3 ssytssstrv(seq id no:40)。
[0179]
另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于hvr之间的一个或多个框架序列：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于hvr之间的一个或多个框架序列：(lc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0180]
另一方面中，所述框架序列源自人种系序列。
[0181]
另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：
[0182]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs(seq id no:24)；
[0183]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs(seq id no:25)；
[0184]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar(seq id no:26)；
[0185]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss(seq id no:27)。
[0186]
另一方面中，所述轻链框架序列源自λ轻链序列。
[0187]
另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：
[0188]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc(seq id no:31)；
[0189]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy(seq id no:32)；
[0190]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc(seq id no:33)；
[0191]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl(seq id no:34)。
[0192]
另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。
[0193]
在另一个方面中，人恒定区选自下组：igg1、igg2、igg2、igg3、igg4。
[0194]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0195]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0196]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmvwrqapgkglewvssiypsggitfyadwkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvss(seq id no:44)，并且
[0197]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0198]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvl(seq id no:45)。
[0199]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:44具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少97％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:44具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:45具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:44，轻链序列包含seq id no:45。
[0200]
在某些实施方式中，本公开提供一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0201]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0202]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsmymmmwvrqapgkglevwssiypsggitfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtaiyycariklgtvttvdywg qgtlvtvss(seq id no:46)，并且
[0203]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0204]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvgaynyvswyqqhpgkapklmiydvsnr
[0205]
psgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvl(seq id no:47)。
id no:38),dvsnrps(seq id no:39)和ssytssstrv(seq id no:40)具有至少80％序列相同性。
[0217]
在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0218]
另一方面，重链的核酸序列是：
[0219][0220]
(seq id no:48)
[0221]
并且轻链的核酸序列是：
[0222][0223]
(seq id no:49).
[0224]
可用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的其它示例性抗
‑
pd
‑
l1抗体可见美国专利申请公开us 2010/0203056。本公开的实施方式之一中，抗体部分是yw243.55s70。在另一实施方式中，抗体部分是mpdl3289a。
[0225]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0226]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0227]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss(seq id no:12),且
[0228]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0229]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seq id no:13)。
[0230]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:12具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少97％的序列相同
性；重链序列与seq id no:12具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:12具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:12，轻链序列包含seq id no:13。
[0231]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0232]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0233]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvsa(seq id no:14),和
[0234]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0235]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seq id no:13)。
[0236]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:14具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少97％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:14具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:14，轻链序列包含seq id no:13。
[0237]
可用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的其它示例性抗
‑
pd
‑
l1抗体可见美国专利申请公开us 2018/0334504。
[0238]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0239]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0240]
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsisndywtwirqhpgkgleyigyisytgstyynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycarsggwlapfdywgrgtlvtvss(seq id no:55),和
[0241]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0242]
divmtqspdslavslgeratinckssqslfyhsnqkhslawyqqkpgqppklliygastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyygypytfgggtkveik(seq id no:56)。
[0243]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:55具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少97％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:55具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:56具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:55，轻链序列包含seq id no:56。
[0244]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0245]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0246]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgrigpnsgftsynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarggssydyfdywgqgttvtvss(seq id no:57),和
[0247]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0248]
divltqspaslavspgqratitcrasesvsihgthlmhwyqqkpgqppklliyaasnlesgvparfsgsgsgtdftltinpveaedtanyycqqsfedpltfgqgtkleik(seq id no:58)。
[0249]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:57具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少93％的序
列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少97％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:57具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:58具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:57，轻链序列包含seq id no:58。
[0250]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0251]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0252]
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsisndywtwirqhpgkgleyigyisytgstyynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycarsggwlapfdywgrgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seq id no:59),和
[0253]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0254]
divmtqspdslavslgeratinckssqslfyhsnqkhslawyqqkpgqppklliygastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyygypytfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:60)。
[0255]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:59具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少97％的序列相同
性；重链序列与seq id no:59具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:59具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:60具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:59，轻链序列包含seq id no:60。
[0256]
在某些实施方式中，本公开包括一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0257]
(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0258]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgrigpnsgftsynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarggssydyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslga(seq id no:61),和
[0259]
(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0260]
divltqspaslavspgqratitcrasesvsihgthlmhwyqqkpgqppklliyaasnlesgvparfsgsgsgtdftltinpveaedtanyycqqsfedpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:62)。
[0261]
在各种实施方式中，重链序列与seq id no:61具有至少86％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少86％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少87％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少87％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少88％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少88％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少89％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少89％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少90％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少90％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少91％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少91％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少92％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少92％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少93％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少93％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少94％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少94％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少95％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少95％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少96％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少96％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少97％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少97％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少98％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少98％的序列相同性；重链序列与seq id no:61具有至少99％的序列相同性，轻链序列与seq id no:62具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含seq id no:61，轻链序列包含seq id no:62。
[0262]
可用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的其它示例性抗
‑
pd
‑
l1抗体可见美国专利公开文本us 7,
943,743。
[0263]
在本公开实施方式之一中，抗pd
‑
l1抗体是mdx
‑
1105。
[0264]
在一些实施方式中，抗pd
‑
l1抗体是medi
‑
4736。
[0265]
恒定区
[0266]
本公开的蛋白质和肽可包括免疫球蛋白的恒定区或恒定区片段、类似物、变体、突变体或衍生物。在某些实施方式中，恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如igg1、igg2、igg3、igg4或其他类。在某些实施方式中，恒定区包括ch2结构域。另些实施方式中，恒定区包括ch2和ch3结合域或包括铰链
‑
ch2
‑
ch3。或者，恒定区可包括全部或部分铰链区、ch2结构域和/或ch3结构域。
[0267]
实施方式之一中，恒定区包含降低对fc受体亲和力或降低fc效应功能的突变。例如，恒定区可包含消除igg重链恒定区中糖基化位点的突变。一些实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于igg1的leu234、leu235、gly236、gly237、asn297或pro331的突变、缺失或插入(氨基酸根据eu命名法编号)。具体实施方式之一中，恒定区在对应于igg1 asn297的氨基酸位置含有突变。另一实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于igg1的leu281、leu282、gly283、gly284、asn344或pro378的突变、缺失或插入。
[0268]
一些实施方式中，恒定区含有源自人igg2或igg4重链的ch2结构域。优选地，ch2结构域包含消除ch2结构域中糖基化位点的突变。实施方式之一中，突变改变igg2或igg4重链ch2结构域内gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列内的天冬酰胺。优选地，突变将天冬酰胺变成谷氨酰胺。或者，突变改变gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列内苯丙氨酸和天冬酰胺两者。在实施方式之一中，gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列被gln
‑
ala
‑
gln
‑
ser(seq id no:16)氨基酸序列取代。gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列内的天冬酰胺对应于igg1的asn297。
[0269]
另一实施方式中，恒定区包括ch2结构域和至少部分铰链区。铰链区可以是源自免疫球蛋白重链例如igg1、igg2、igg3、igg4或其他类。优选地，铰链区源自人igg1、igg2、igg3、igg4或其他合适的类。更优选地，铰链区源自人igg1重链。实施方式之一中，igg1铰链区pro
‑
lys
‑
ser
‑
cys
‑
asp
‑
lys(seq id no:17)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。在某些实施方式中，pro
‑
lys
‑
ser
‑
cys
‑
asp
‑
lys(seq id no:17)氨基酸序列被pro
‑
lys
‑
ser
‑
ser
‑
asp
‑
lys(seq id no:18)氨基酸序列取代。在某些实施方式中，恒定区包括源自第一抗体同种型的ch2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。在某些实施方式中，ch2结构域源自人igg2或igg4重链，而铰链区源自经改变的人igg1重链。
[0270]
fc部分与非fc部分连接处附近的氨基酸改变会显著提高fc融合蛋白的血清半衰期(pct公开文本wo 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本公开的蛋白质或多肽的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链和促红细胞生成素天然序列的改变，优选距连接点约10个氨基酸以内。这些氨基酸改变会引起疏水性增强。实施方式之一中，恒定区源自igg序列，其中c末端的赖氨酸残基被替换。优选地，igg序列的c末端赖氨酸被替换成非赖氨酸的氨基酸(例如丙氨酸或亮氨酸)以进一步提高血清半衰期。另一实施方式中，恒定区源自igg序列，其中，恒定区c末端附近的leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)氨基酸序列具有消除潜在接合性t细胞表位的改变。例如，实施方式之一中，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)氨基酸序列被ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)氨基酸序列取代。其他实施方式中，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)段内的氨基酸被例如甘氨酸或脯氨酸等其他氨基酸替换。在igg1、igg2、igg3、igg4或他类免疫球蛋白分子的c
‑
末端附近产生leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)段氨基酸取代的方法可详见美国专利公开号20030166877，其公开内容通过引用纳入本文。
[0271]
本公开的适宜铰链区可源自igg1、igg2、igg3、igg4及其他免疫球蛋白类别。igg1铰链区有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两重链之间的二硫键。这些半胱氨酸使得fc部分之间二硫键的形成高效且一致。因此，本公开的铰链区之一源自igg1，例如，人igg1。优选实施方式中，人igg1铰链区内的第一个半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选丝氨酸。igg2同种型铰链区有四个二硫键，它们倾向于促成重组系统分泌期间的寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可源自igg2铰链，优选其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。已知igg4的铰链区形成链间二硫键不大有效。然而，本公开的合适铰链区可以源自igg4铰链区，优选含有增强重链衍生部分之间正确形成二硫键的突变(angal s等，(1993)mol.immunol.,30:105
‑
8)。
[0272]
根据本公开，恒定区可包含源自不同抗体同种型的ch2和/或ch3结构域和铰链区，例如杂交(hybrid)恒定区。例如，实施方式之一中，恒定区含有源自igg2或igg4的ch2和/或ch3结构域和源自igg1的突变铰链区。或者，杂交恒定区中可采用源自其他igg亚类的突变铰链区。例如，可以采用能够有效形成两重链间二硫键的igg4铰链突变形式。突变型铰链也可源自igg2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。杂交恒定区的组装可见美国专利公开号20030044423，其公开内容通过引用纳入本文。
[0273]
根据本公开，恒定区可包含一处或多处本文所述的突变。fc部分中突变的组合对延长血清半衰期和提高双功能分子体内效力具有累加或协同效应。因此，示例性实施方式之一中，恒定区可包含(i)衍生自igg序列的区域，其中leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)氨基酸序列被ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)氨基酸序列替换；(ii)c
‑
末端丙氨酸残基代替赖氨酸；(iii)衍生自不同抗体同种型的ch2结构域和铰链区，例如igg2 ch2结构域和改变的igg1铰链区；和(iv)消除igg2衍生的ch2结构域内的糖基化位点的突变，例如igg2衍生的ch2结构域内的gln
‑
ala
‑
gln
‑
ser(seq id no:16)氨基酸序列而不是gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列。
[0274]
抗体片段
[0275]
本公开的蛋白质和多肽还可包括抗体的抗原结合片段。示例性抗体片段包括scfv、fv、fab、f(ab’)2和单域vhh片段，例如来自骆驼科动物的那些。
[0276]
单链抗体片段，也称为单链抗体(scfv)，是重组多肽，它们通常结合抗原或受体；这些片段包含用或不用一个或多个互连接头相连的至少一个抗体可变轻链序列(v
l
)片段和至少一个抗体可变重链氨基酸序列(v
h
)片段。这样的接头可以是短的柔性肽，选来确保vl和vh结构域相连后正确的三维折叠，从而保留作为单链抗体片段来源的全抗体的靶分子结合特异性。通常，v
l
或v
h
序列的羧基末端通过这样的肽接头共价连接至互补v
l
和v
h
序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体文库展示或类似技术来产生。这些蛋白质可以在真核细胞中也可以在原核细胞(包括细菌)中生产。
[0277]
单链抗体片段包含具有本文所述完整抗体可变区或cdr中至少其一的氨基酸序列，但缺失那些抗体的全部或部分恒定域。这些恒定域对于抗原结合来说不是必需的，但是
构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服采用包含部分或全部恒定区的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于不在生物分子与重链恒定区之间发生不希望有的相互作用或其他不希望有的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更高的毛细血管通透性，这令单链抗体片段能够更高效地寻址并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其生产。此外，单链抗体片段相对较小使得它们比完整抗体更不会在接受者中引发免疫反应。
[0278]
还可以有与完整抗体具有相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个fab片段或f(ab’)2片段。抗体片段可包含完整抗体的全部六个cdr，但包含少于全部这些区域、例如含三、四或五个cdr的片段同样具有功能。
[0279]
药物组合物
[0280]
本公开还包括包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可配制成适用于多种药物递送系统。组合物中还可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体以制成合适的制剂。可用于本公开的合适制剂可见《雷明顿药物科学》第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(mack publishing company)，1985。关于药物递送方法的综述可见例如langer，science(1990),249:1527
‑
1533。
[0281]
在一个方面，本公开提供了用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂，其包含500mg
‑
2400mg的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质，所述第一多肽包含：(a)至少重链可变区，所述重链可变区是结合人蛋白程序性死亡配体1(pd
‑
l1)的抗体重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(tgfβ)的人转化生长因子β受体ii(tgfβrii)或其片段，所述第二多肽至少包含结合pd
‑
l1的抗体轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合pd
‑
l1的抗原结合位点。
[0282]
在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列。
[0283]
在本公开的某些实施方式中，用于在癌症患者内治疗btc或抑制肿瘤生长的方法的静脉内药物递送制剂可包含约500mg至约2400mg剂量(例如，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至2400mg，约700mg至2400mg，约800mg至2400mg，约900mg至2400mg，约1000mg至2400mg，约1100mg至2400mg，约1200mg至2400mg，约1300mg至2400mg，约1400mg至2400mg，约1500mg至2400mg，约1600mg至2400mg，约1700mg至2400mg，约1800mg至2400mg，约1900mg至2400mg，约2000mg至2400mg，约2100mg至2400mg，约2200mg至2400mg，或约2300mg至2400mg)的本公开内容的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500
‑
2000mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二
多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，且第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1200mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，且第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1800mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，且第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约2400mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，且第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽))。
[0284]
在某些实施方式中，用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)的本公开的蛋白质产物(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)。在某些实施方式中，用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg
至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)的蛋白质产物，其具有包括seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包括seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。
[0285]
在某些实施方式中，用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱)，其包含具有seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和具有seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽。
[0286]
用于在癌症患者中治疗btc或抑制肿瘤生长的方法中的本公开的静脉内药物递送制剂可以包含在袋，笔或注射器中。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。在某些实施方式中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方式中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并包含在约12
‑
60个小瓶中。在某些实施方式中，制剂可以是冷冻干燥的，并且约45mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，约40mg
‑
约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自12，27或45个小瓶的冷冻干燥制剂合并以获得静脉内药物制剂中治疗剂量的蛋白质。在某些实施方式中，制剂可以是蛋白质产物的液体制剂，该产物具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物，并储存为约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1300mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约250mg/小瓶至约
1100mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约300mg/小瓶，约300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约400mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约900mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1000mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1100mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1200mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1400mg/小时小瓶至约2000mg/小瓶，约1500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，或约1900mg/小瓶至约2000mg/小瓶)。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约600mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1200mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1800mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约2400mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约250mg/小瓶。
[0287]
本公开提供了液体水性药物制剂，其于缓冲溶液中包含治疗有效量的本公开的蛋白质(例如，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱)而形成制剂，该制剂用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法。
[0288]
这些用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的组合物可用常规灭菌技术灭菌或可进行无菌过滤。所得水性溶液可包装成原样使用(“use as
‑
is”)型产品或冻干，冻干制剂在给药之前与无菌水性运载体合并。制剂的ph通常在3至11之间，5至9之间或6至8之间更好，7至8之间例如7至7.5之间最好。得到的固体形式的组合物可以包装成多个单剂量单位，每个单剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量。
[0289]
在某些实施方式中，本公开提供了用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的具有延长的保质期的制剂，所述制剂包括本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽))，联合甘露醇，柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，聚山梨醇酯80，水和氢氧化钠。
[0290]
在某些实施方式中，本公开用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的水性制剂制备成在ph缓冲溶液中包含本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽)；或具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。本发明的缓冲液的ph可以为约4至约8，例如约4至约8，约4.5至约8，约5至约8，约5.5至约8，约6至约8，约6.5至约8，约7至约8，约7.5至约8，约4至约7.5，约4.5至约7.5，约5至约7.5，约5.5至约7.5，约6至约7.5，约6.5至约7.5，约4至约7，约4.5至约7，约5至约7，约5.5至约7，约6至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约5至约6.5，约5.5至约6.5，约4至约6.0，约4.5至约6.0，约5至约6，或约4.8至约5.5，或可具有约5.0至约5.2的ph。上述ph的中间范围也是本公开的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将ph控制在该范围内的缓冲剂的示例包括乙酸盐(例如乙
酸钠)，琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，葡糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。
[0291]
在某些实施方式中，用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐、将ph维持在约4至约8的范围内的缓冲系统。在某些实施方式中，ph范围可以为约4.5至约6.0，或约ph4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的ph范围内。在某些实施方式中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1.3mg/ml的柠檬酸(例如，1.305mg/ml)，约0.3mg/ml的柠檬酸钠(例如，0.305mg/ml)，约1.5mg/ml的二水合磷酸氢二钠(例如，1.53mg/ml)，约0.9mg/ml的二水合磷酸二氢钠(例如，0.86)，和约6.2mg/ml的氯化钠(例如，6.165mg/ml)。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1
‑
1.5mg/ml的柠檬酸，约0.25至约0.5mg/ml的柠檬酸钠，约1.25至约1.75mg/ml的二水合磷酸氢二钠，约0.7至约1.1mg/ml的二水合磷酸二氢钠，和6.0至6.4mg/ml的氯化钠。在某些实施方式中，用氢氧化钠调节制剂的ph。
[0292]
用作调理剂并可稳定抗体的多元醇也可包括在制剂中。多元醇加入到制剂中的量可以根据制剂的所需等渗性而不同。在某些实施方式中，水性制剂可以是等渗的。加入的多元醇的量也可以相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以加入较低量的单糖(例如甘露醇)。在某些实施方式中，可以在制剂中用作张力剂的多元醇是甘露醇。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约7.5至约15mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约10至约14mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约12mg/ml。在某些实施方式中，制剂中可包含多元醇山梨糖醇。
[0293]
清洁剂或表面活性剂也可以加入到制剂中。示例性清洁剂包括非离子清洁剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的清洁剂的量使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方式中，制剂可包括表面活性剂聚山梨醇酯。在某些实施方式中，制剂可含有清洁剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80用于表示聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(参见fiedler，《辅料百科》(lexikon der hilfsstoffe)，editio cantor verlag aulendorf出版，第4版，1996)。在某些实施方式中，制剂可含有约0.1mg/ml至约10mg/ml，或约0.5mg/ml至约5mg/ml的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。
[0294]
冻干制剂
[0295]
本公开的用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的冻干制剂包含抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子和冻干保护剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方式中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包含缓冲剂，表面活性剂，填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。
[0296]
可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖重量比。在某些实施方式中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。
[0297]
在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的ph。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。
[0298]
在冻干之前，含有本公开的蛋白质的溶液的ph可以调节为约6至约8之间。在某些实施方式中，冻干药物产品的ph范围可以为约7至约8。
[0299]
在某些实施方式中，可以约10mm
‑
约200mm的量加入盐或缓冲组分。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。
[0300]
在某些实施方式中，可以添加“填充剂”。“填充剂”是这样一种化合物，它增加冻干混合物的量并有助于冻干块体的物理结构(例如，有助于生产保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼体)。示例性填充剂包括甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有此类填充剂。
[0301]
可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。
[0302]
在某些实施方式中，用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的冻干药物产品可以用水性运载体来复溶。本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(例如对人给药安全无毒)并且可在冻干后用于制备液体制剂。示例性稀释剂包括无菌注射用水(swfi)，抑菌性注射用水(bwfi)，ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。
[0303]
在某些实施方式中，本公开的冻干药物产品用无菌注射用水，usp(swfi)或0.9％氯化钠注射液，usp重建。在复溶过程中，冻干粉末溶解成溶液。
[0304]
在某些实施方式中，本公开的冻干蛋白质产物溶于约4.5ml注射用水并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。
[0305]
液体制剂
[0306]
一些实施方式中，将本公开的蛋白质产物配制成用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的液体制剂。液体制剂可以10mg/ml浓度存在于usp/ph eur i型50r小瓶中，小瓶用橡皮塞封口并用铝卷边包封来密封。塞子可以由符合usp和ph eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以填充有约61.2ml的蛋白质产物溶液，以允许有60ml的可提取体积。在某些实施方式中，液体制剂可以用0.9％盐水溶液稀释。在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2ml的约20mg/ml至约50mg/ml(例如，约20mg/ml，约25mg/ml，约30mg/ml，约35mg/ml，约40mg/ml，约45mg/ml或约50mg/ml)的蛋白质产物(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱)(例如，具有包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)溶液，以允许有60ml的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约
3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱，如具有包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物)至对象。
[0307]
在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2ml的约20mg/ml至约50mg/ml(例如，约20mg/ml，约25mg/ml，约30mg/ml，约35mg/ml，约40mg/ml，约45mg/ml或约50mg/ml)的蛋白质产物(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱，如具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)溶液，以允许有60ml的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物至未经治疗的对象。
[0308]
在某些实施方式中，本公开的用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的液体制剂可以制备成10mg/ml浓度的溶液，并与稳化水平的糖组合。在某些实施方式中，液体制剂可以制备在水性运载体中。在某些实施方式中，可以加入稳定剂，其加量不大于可能导致粘度对静脉内给药来说不合适或不理想的量。在某些实施方式中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方式中，液体制剂还可包含缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
[0309]
在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的ph。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，碱可以是氢氧化钠。
[0310]
除聚集外，脱酰胺是肽和蛋白质的常见产物变体，可发生于发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物/药物产品储存期间和样品分析期间。脱酰胺作用是蛋白质中丢失nh3形成可水解的琥珀酰亚胺中间体。琥珀酰亚胺中间体导致亲本肽质量减少17u。随后的水解导致质量增加18u。由于在水性条件下的不稳定性，难以分离琥珀酰亚胺中间体。因此，脱酰胺通常可测知为1u质量增加。天冬酰胺脱酰胺形成天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数
包括ph，温度，溶剂介电常数，离子强度，一级序列，局部多肽构象和三级结构。肽链中与asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中asn后的gly和ser导致更易脱酰胺。
[0311]
在某些实施方式中，本公开用于癌症患者中btc治疗或肿瘤生长抑制的方法的液体制剂可以在ph和湿度条件下保存以防止蛋白质产物脱酰胺基。
[0312]
本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给药安全无毒)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(swfi)，抑菌性注射用水(bwfi)，ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。
[0313]
可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。
[0314]
特定情况下，静脉内(iv)制剂可以是优选的给药途径，例如当患者在移植后在医院中通过iv途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在给药前用0.9％氯化钠溶液稀释液体制剂。在某些实施方式中，用于注射的稀释药物产品是等渗的并且适于通过静脉内输注给药。
[0315]
在某些实施方式中，盐或缓冲组分可以约10mm
‑
约200mm的量加入。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。
[0316]
可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。
[0317]
本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给药安全无毒)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(swfi)，抑菌性注射用水(bwfi)，ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。
[0318]
可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。
[0319]
治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法
[0320]
在一个方面，本公开提供治疗有需要的对象中btc或抑制所述对象中肿瘤生长的方法，该方法包括向对象给予至少500mg的蛋白质的剂量，该蛋白质包括第一多肽和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能与人蛋白程序性死亡配体1(pd
‑
l1)结合的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(tgfβ)的人转化生长因子β受体ii(tgfβrii)或其片段。所述第二多肽至少包括结合pd
‑
l1的抗体轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合pd
‑
l1的抗原结合位点。
[0321]
在某些实施方式中，本公开的治疗btc或抑制肿瘤生长的方法包括向对象给予包含两种肽的蛋白质，其中第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，蛋白质是抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。
[0322]
在一些实施方式中，根据本文公开的方法治疗的对象在用本公开的双功能蛋白(抗pd
‑
1/tgfβ阱分子)治疗前未接受过先前治疗。在一个实施方式中，根据本文公开的方法治疗的对象在尚未接受用于治疗btc的先前化疗或免疫疗法。
[0323]
在另一实施方式中，根据本文所公开的方法治疗的对象已接受先前的全身化疗但继续经历肿瘤进展，即，先前的全身化疗(例如，基于铂的化疗)已失败。在另一实施方式中，
根据本文公开的方法治疗的对象对全身化疗(例如，基于铂的化疗)不耐受。
[0324]
在某些实施方式中，本公开治疗btc或抑制肿瘤生长的方法包括向对象给予蛋白质(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子(如具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物))，其剂量为约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)。一些实施方式中，每两周一次向对象给予约1200mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向对象给予约1800mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子。在某些实施方式中，将约1200mg具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。在某些实施方式中，每三周一次给予对象约1800mg具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。在某些实施方式中，将约2400mg具有包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。在某些实施方式中，每三周一次给予对象约2400mg具有包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。
[0325]
在某些实施方式中，给予对象的剂量可以是约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2025mg，约2050mg，约2075mg，约2100mg，约2125mg，约2150mg，约2175mg，约2200mg，约2225mg，约2250mg，约2275mg，约2300mg，约2325mg，约2350mg，约2375mg，或约2400mg。
[0326]
在某些实施方式中，给予对象的剂量可以每两周给予一次。在某些实施方式中，给
予对象的剂量可以每三周给予一次。在某些实施方式中，蛋白质可以通过静脉内给药，例如用预填充袋、预填充笔或预填充注射器给药。在某些实施方式中，蛋白质从250ml盐水袋静脉内给予，并且静脉内输注可以持续约1小时(例如，50至80分钟)。在某些实施方式中，袋连接包括管和/或针的通道。
[0327]
在一些实施方式中，btc是局部晚期或转移性的。例如，在一个实施方式中，所述方法治疗晚期btc。在一些实施方式中，所述方法治疗转移性btc。btc的非限制性示例包括胆囊癌(gbc)、胆管癌(cca)和法特氏壶腹癌(vac)。可用本文所述的方法治疗gbc、cca和vac。
[0328]
在某些实施方式中，通过静脉内给予约至少500mg(例如，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者，其中该抗pd
‑
l1/tgfβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含seq id no:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内给予约至少500mg(例如，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者，其中该抗pd
‑
l1/tgfβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内给予2400mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者，其中该阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列。
[0329]
在某些实施方式中，具有晚期或转移性btc的对象或患者通过静脉内给予约1200mg
‑
约2400mg(例如，约1200mg
‑
约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗，其中该阱分子包括第一多肽，该多肽具有seq id no：3的氨基酸序列，以及第二多肽，其包含seq id no：1的氨基酸序列。在某些实施方式中，具有晚期或转移性btc的对象或患者通过静脉内给予约1200mg
‑
约2400mg(例如，约1200mg
‑
约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗，其中该阱分子包括第一多肽，该多肽具有seq id no：35、36和37的氨基酸序列，以及第二多肽，其包含seq id no：38、39和40的氨基酸序列。
[0330]
在一些实施方式中，通过每2周一次静脉给予约1200mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每2周一次静脉给予1200mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每3周一次静脉给予约1800mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每3周一次静脉给予1800mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每3周一次静脉给予约2400mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每3周一次静脉给予2400mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。
[0331]
本文所设想的是治疗方法，其中向未经治疗的患者给予联合疗法(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和化疗)。例如，在一些实施方式中，通过将吉西他滨和/或顺铂与抗pd
‑
l1/tgfβ阱共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。例如，在一些实施方式中，通过将吉西他滨和顺铂与抗pd
‑
l1/tgfβ阱共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。在一些实施方式中，通过将吉西他滨与抗pd
‑
l1/tgfβ阱共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。在一些实施方式中，通过将顺铂与抗pd
‑
l1/tgfβ阱共同给药来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗对象或患者。
[0332]
在某些实施方式中，本发明描述了治疗方法，其中在治疗周期中，在与蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)同一天(例如，第1天)将吉西他滨和顺铂给予未经治疗患者。在某些实施方式中，在治疗周期的第8天给予吉西他滨和顺铂而不给予蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)。在一些实施方式中，在一段时间(例如，24周)内重复(例如，8个周期)治疗(例如，在第1天与吉西他滨和顺铂联合给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱，然后在第8天给予吉西他滨和顺铂)，接着单独给予蛋白质(例如，本文所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子)一段时间(例如，2年)。在一些实施方式中，在24周内重复总共8个周期的治疗(例如，在第1天与吉西他滨和顺铂联合给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱，然后在第8天给予吉西他滨和顺铂)，接着从第25周开始单独给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱。
[0333]
吉西他滨联合顺铂被认为是晚期或转移性btc患者1l化疗的全球护理标准(nccn，esmo指南)。因此，用于吉西他滨和顺铂给药的给药方案是本领域的常规并且在本文中预期。在一些实施方式中，以约1000mg/m2的剂量给予吉西他滨。在一些实施方式中，以约25mg/m2的剂量给予顺铂。在一些实施方式中，可重复治疗用联合疗法治疗的患者。例如，在一些实施方式中，每3周在第1天和第8天以约1000mg/m2的剂量给予吉西他滨和以约25mg/m2的剂量给予顺铂。在一些实施例中，在第1天和第8天，吉西他滨以约1000mg/m2的剂量给予，顺铂以约25mg/m2的剂量给予，每3周给予一次，直到第24周为止，随后每两周以约1000mg/m2的剂量给予任选的双周吉西他滨，加或不加约25mg/m2的剂量的顺铂。
[0334]
在某些实施方式中，通过每2周一次静脉内注射抗pd
‑
l1/tgfβ阱(剂量约为1200mg)，联合每3周一次在第1天和第8天吉西他滨(剂量约为1000mg/m2)以及顺铂(剂量约为25mg/m2)，直至第24周，然后每2周任选双周吉西他滨(剂量约1000mg/m2)加或不加顺铂(剂量约25mg/m2)，来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗的对象或患者。在某些实施方式中，通过每3周一次静脉内注射抗pd
‑
l1/tgfβ阱(剂量约为1,800mg)，联合每3周一次在第1天和第8天吉西他滨(剂量约为1000mg/m2)以及顺铂(剂量约为25mg/m2)，直至第24周，然后
每2周任选双周吉西他滨(剂量约1000mg/m2)加或不加顺铂(剂量约25mg/m2)，来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗的对象或患者。在某些实施方式中，通过每3周一次静脉内共同给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱(剂量约为2400mg)，与在第1天吉西他滨(剂量约为1000mg/m2)以及顺铂(剂量约为25mg/m2)；然后在第8天静脉内给予吉西他滨(剂量约1000mg/m2)和顺铂(剂量约25mg/m2)，每3周，直至第24周，来治疗患有晚期或转移性btc的未经治疗的对象或患者(参见例如图8和表2)。从第25周到随后的周(例如，大约2年)，每三周一次给予2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱继续治疗，其中不共同给予吉西他滨或顺铂。
[0335]
在一些实施方式中，待治疗的btc(例如，晚期btc，转移性btc)为pd
‑
l1阳性。例如，在某些实施方式中，待治疗的btc(例如，晚期btc、转移性btc)表现出≥1％的pd
‑
l1阳性肿瘤细胞，例如通过dako pd
‑
l1 73
‑
10ihc pharmdx分析测定。在一些实施方式中，待治疗的btc(例如，晚期btc，转移性btc)为pd
‑
l1阴性。待治疗的btc(例如，晚期btc，转移性btc)可显示高pd
‑
l1表达(或高pd
‑
l1)。
[0336]
检测例如btc(例如，晚期btc，转移性btc)或胆道肿瘤上的生物标志物例如pd
‑
l1的方法是本领域常规的并且纳入本文。非限制性实例包括免疫组织化学，免疫荧光和荧光活化细胞分选(facs)。在一些实施方式中，通过静脉给予约至少500mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每两周一次静脉给予约1200mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。在一些实施方式中，通过每3周一次静脉给予约2400mg剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱来治疗具有晚期或转移性btc的对象或患者。
[0337]
在一些实施方式中，本文公开的治疗方法导致对象或患者疾病缓解或生存期改善。例如，在一些实施方式中，疾病缓解可以是完全缓解，部分缓解或病情稳定。例如，在一些实施方式中，提高的生存期可以是无进展生存期(pfs)或总生存期。在一些实施方案中，相对于开始用本发明的抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗之前的时期来确定改善(例如，在pfs中)。确定针对btc(例如，晚期btc，转移性btc)或胆道肿瘤治疗的疾病缓解(例如，完全缓解，部分缓解或病情稳定)和患者生存期(例如，pfs，总生存期)的方法在本领域中是常规的，并且纳入本文。在一些实施方式中，接受治疗的患者在患病区域(例如，覆盖胸膜入口至耻骨联合的上方范围的胸部/腹部和骨盆)接受相差增强计算机断层摄影(ct)或磁共振显影(mri)之后，根据recist 1.1评估疾病缓解。
[0338]
递送装置
[0339]
在一个方面，本公开提供用于癌症患者中btc(例如，晚期btc，转移性btc)治疗或肿瘤生长抑制的方法的药物递送装置，其中该装置包括制剂，该制剂包含约500mg
‑
3000mg的蛋白质，该蛋白质包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能与人蛋白程序性死亡配体1(pd
‑
l1)结合的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(tgfβ)的人转化生长因子β受体ii(tgfβrii)或其片段，第二多肽至少包含结合pd
‑
l1的抗体的轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合pd
‑
l1的抗原结合位点。
[0340]
在某些实施方式中，该装置可以是袋，笔或注射器。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。
[0341]
在某些实施方式中，用于癌症患者中btc(例如，晚期btc，转移性btc)治疗或胆道肿瘤生长抑制的方法的药物递送装置可包含约500mg至约3000mg(例如，约500mg至约
3000mg，约500mg至约2900mg，约500mg至约2800mg，约500mg至约2700mg，约500mg至约2600mg，约500mg至约2500mg，约500mg至约2400mg，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约500mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约3,000mg或约3000mg)的本公开的蛋白质(例如抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其具有包括seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包括seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽；或包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500
‑
1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或包含seq id no：35、36和37的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。
[0342]
在某些实施方式中，药物递送装置可包含约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽；或包含seq id no:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，本公开提供了用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的递送装置，包括约1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，本公开提供了用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的递送装置，包括约2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，本公开提供了用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的递送装置，包括约1200mg，约1800mg或约2400mg剂量的蛋白质产物，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。
[0343]
在某些实施方式中，本公开提供了用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转
移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的递送装置，包括约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，本公开提供了用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的递送装置，包括约1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗pd
‑
l1/tgfβ阱，其包括包含seq id no：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含seq id no：1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含seq id no:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:38、39和40的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，用于在癌症患者内治疗btc(例如，晚期btc，转移性btc)或抑制胆道肿瘤生长的方法的药物递送装置可包含约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱，例如包含具有seq id no：35、36和37的氨基酸序列的第一多肽，和具有seq id no：38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。
[0344]
蛋白质生产
[0345]
抗体
‑
细胞因子阱蛋白质一般采用包含经工程改造以表达所述蛋白质的核酸的哺乳动物细胞通过重组技术来生产。尽管在us20150225483a1的实施例1和2中描述了合适的细胞系和蛋白质生产方法的一个例子，但是已有大量合适的载体、细胞系和蛋白质生产方法用来生产基于抗体的生物药物并可以用于合成本文的抗体
‑
细胞因子阱蛋白。
[0346]
治疗适应症
[0347]
本申请中描述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱蛋白(例如，包括包含seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:1的氨基酸序列的第二多肽)以及包括所述抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱蛋白的本公开的静脉药物递送制剂和递送装置可用于治疗未经治疗的患者或先前全身化疗失败或不耐受的患者中的btc(例如，晚期btc，转移性btc)或降低胆道肿瘤生长。
[0348]
在具体实施方式中，用本公开的方法治疗具有pd
‑
l1阳性的晚期或转移性btc的未经治疗的患者。在另一实施方式中，根据本发明的方法治疗对先前具有pd
‑
l1阳性的晚期或转移性btc的全身化疗失败或不耐受的患者。
[0349]
实施例
[0350]
以上是对本公开的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本公开的某些方面和实施方式，无意于以任何方式限制本公开的范围。
[0351]
实施例1：静脉内药物制剂包装
[0352]
抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱制剂按冻干制剂或液体制剂制备。为了制备冻干制剂，冷冻
‑
干燥的抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子被灭菌并储藏于一次性玻璃药瓶中。然后将几个这样的玻璃药
瓶包装在试剂盒中，用于向经诊断患有癌症或肿瘤的对象递送特定非体重依赖性剂量。根据剂量要求，该试剂盒包含12
‑
60个小瓶。或者，制备制剂并包装为液体制剂，并按250mg/瓶至1000mg/瓶储存。例如，制剂是液体制剂并按600mg/瓶储存，或按250mg/瓶储存。在另一个实例中，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱被制备成10mg/ml的溶液，以usp/ph eur i型50r小瓶提供，装满小瓶以允许有60ml(600mg/60ml)的可提取体积，遵守usp和ph eur要求用橡胶塞以血清格式封口并用铝质锯齿形焊缝封闭。
[0353]
对一名诊断为btc(例如，局部晚期或转移性btc)的对象静脉内给予含500mg至2400mg抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子的制剂。例如，对该对象静脉内给予1200mg抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱，每两周给药一次，或给予1800mg抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱，每三周给药一次。通过盐水袋进行静脉内给药。抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子给药量是不依赖于对象体重的。
[0354]
实施例2：未经治疗的局部晚期或转移性btc患者组的抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱bw
‑
依赖性给药方案
[0355]
在一个示例性实施方式中，每两周一次向具有局部晚期或转移性btc(包括肝内外胆管癌、胆囊癌和壶腹癌)的癌症患者给予1200mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的bw非依赖剂量。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次向患有局部晚期或转移性btc的未经治疗的癌症患者给予2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱的bw非医疗剂量。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。在各种实施方式中，癌症患者具有亚洲血统和/或是亚裔。在各种实施方式中，癌症患者没有亚洲血统和/或不是亚裔。
[0356]
为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25
‑
50mg苯海拉明和500
‑
650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。第二次输注后任选进行预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。
[0357]
在一个示例性实施方式中，具有局部晚期或转移性btc的癌症患者，除了给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱之外，每21天(每3周一次)在第1天和第8天静脉内联合给予剂量为1000mg/m2的吉西他滨和剂量为25mg/m2的顺铂，持续8个周期，直至第24周。对于联合治疗，在吉西他滨和顺铂给药之前给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱。根据标准操作规程，在顺铂输注过程中给予术前用药、除类固醇外的止吐药和静脉补液，以防止肾毒性。从第25周到随后的周(例如，大约2年)，每三周一次给予2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱继续治疗，其中不共同给予吉西他滨或顺铂。
[0358]
在一项随机双盲临床研究中，当给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱联合吉西他滨和顺铂，然后给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法时，评估未经治疗的局部晚期或转移性btc患者的总生存期和无进展生存期。作为本研究的一部分，治疗分配/随机化根据以下因素进行分层：
[0359]
1.btc类型：肝内胆管癌；肝外胆管癌和法特氏壶腹癌；胆囊癌。2.局部晚期或先前手术切除对比诊断时最初转移。3.有腹膜播散对比无腹膜播散。
[0360]
下面是该实施例中患者的纳入标准。患者：
[0361]
‑
年龄≥18岁
[0362]
‑
有组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性btc，包括肝内外胆管癌、胆囊癌和壶腹癌
[0363]
‑
未接受过局部晚期或转移性btc的化疗或免疫治疗(不允许辅助治疗)
[0364]
‑
有依据recist 1.1版至少1个一维可测量病灶(见eisenhauer等，ejc.2009；45:228
‑
247)可测量的疾病
[0365]
‑
有至少12周的预期寿命
[0366]
‑
具有存档(<6月期)肿瘤物质(原发性或转移性)或进行新的活检
[0367]
‑
东部合作肿瘤协作组(ecog ps)表现状态为0
‑1[0368]
‑
具有足够的血液学功能，其定义为白细胞(wbc)计数≥3
×
109/l，中性粒细胞绝对计数(anc)≥1.5
×
109/l，淋巴细胞计数≥0.5
×
109/l，血小板计数≥75
×
109/l，血红蛋白(hgb)≥9g/dl(无输血时)
[0369]
‑
具有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5
×
正常上限(uln)，天冬氨酸转氨酶(ast)水平≤3.0
×
uln，且丙氨酸转氨酶(alt)水平≤3.0
×
uln。对于肝脏受累于肿瘤的患者，ast≤5.0
×
uln且alt≤5.0
×
uln是可接受的。
[0370]
‑
具有足够的肾功能，其定义为根据cockcroft
‑
gault公式或通过测量24小时尿液收集的肌酐清除率估计的肌酐清除率>50ml/分钟
[0371]
οccr(ml/分钟)＝(140
‑
年龄)x体重(kg)/(72x血清cr
jaffe
)
[0372]
ο如果是女性，x 0.85
[0373]
‑
如果用酶法测定cr，则加0.2，以cr
jaffe
＝0.2+cr
enzume
使用；白蛋白≥3.3g/dl
[0374]
对于抗pd
‑
l1/tgfβ阱与全身化疗联合应用的2期和3期研究，采用建模方法选择每三周一次的抗pd
‑
l1/tgfβ阱剂量。由于大多数化疗每三周给药一次，为了方便和依从性，抗pd
‑
l1/tgfβ阱可以采用相同的给药间隔。对于每三周一次剂量的选择，可获得与每两周一次1200mg剂量相当的疗效曲线。在稳定状态下，给药间隔内的c
谷,ss
和平均浓度与每两周给药一次1200mg的情况相似或更高，大多数患者的c
谷,ss
可高于50μg/ml的目标浓度。根据剂量递增给药过程中的药代动力学
‑
药效学(pk
‑
pd)特征和基于群体pk的模拟，预计每三周给予一次2400mg可达到与每两周给予一次1200mg相似的中位c
谷,ss
。如果抗pd
‑
l1/tgfβ阱的消除半衰期约为7天，则大约翻倍的剂量将保持与每三周给药一次以及与每两周给药一次相同的c
谷
。
[0375]
图8和表2显示了该实施例中描述的治疗方案。
[0376]
表2：研究中给予的研究介入的细节。表中所用的缩写：q3w＝每3周一次；w＝周；d＝天。
[0377][0378]
在示范性实施方式中，每三周给予一次2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱或每两周给予一次1200mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱以治疗具有局部晚期或转移性btc的未经治疗的癌症患者达到类似疗效。在示例性实施方式中，对于治疗患有局部晚期或转移性btc的未经治疗的癌症患者，通过每三周给予一次2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱获得的观察到的平均稳态谷浓度(c
谷,ss
)与通过每两周给予一次1200mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱获得的观察到的平均稳态谷浓度(c
谷,ss
)相似。每三周给予一次2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱的安全性得到了0.3
‑
30mg/kg剂量递增组和暴露安全模型研究第1阶段安全性和暴露的初步评估的支持。在联合研究中，对化疗(如吉西他滨和顺铂)的药代动力学相互作用和重叠毒性进行评估以支持每三周给予一次2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱。
[0379]
在整个治疗过程中，通过记录、报告和分析医学基线状况、不良事件、体检发现(包括生命体征、ecog表现状态和实验室检查)持续评估安全性。剂量限制毒性(dlt)在第二次给药前21天进行评估。在示例性实施方式中，在2个独立的群组(例如，亚洲站点的群组和非亚洲站点的群组)中评估安全性。
[0380]
在至少一个研究中，选择的患者没有在接受免疫刺激剂时可能会恶化的自身免疫性疾病或活动性结核病。在至少一个研究中，选择的患者没有间质性肺病或其病史、肝硬化、已知的人类免疫缺陷病毒(hiv)检测阳性史或已知的获得性免疫缺陷综合征、未控制的胆道感染、需要全身治疗的活动性细菌或真菌感染，具有临床意义的心脑血管/脑血管疾病。在至少一个研究中，选择的患者没有中枢神经系统(cns)转移(有cns转移治疗史(通过手术或放射治疗)的患者不合格，除非他们已经治疗而完全康复，至少3个月没有进展，并且不需要继续类固醇治疗)。
[0381]
在至少一个研究中，选择的患者不是任何器官移植的接受者，包括异基因干细胞移植，但不需要免疫抑制的移植除外(如角膜移植、毛发移植)。在一个研究中，选择的患者之前没有接受任何抗体/药物靶向t细胞共调节蛋白(免疫检查点)的治疗，如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1、抗ctla
‑
4抗体或抗
‑4‑
1bb抗体，包括这些药的局部给药是不允许的。在至少一个研究中，选择的患者先前没有接受任何靶向tgfβ/tgfβ受体的抗体/药物的治疗。
[0382]
在至少一个研究中，选择的患者在28天内没有接受过除局部姑息性骨定向放射治
疗以外的放射治疗。选择的患者在试验治疗开始前7天内未接受免疫抑制剂全身治疗；或在试验治疗开始前28天内未使用任何试验药物。
[0383]
在一个示例性实施方式中，选择的患者具有>5年内无复发的治愈性治疗的癌症或以治愈性目的治疗的早期癌症，包括宫颈原位癌、浅表性、非侵袭性膀胱癌、基底细胞癌或鳞状细胞原位癌。允许内镜下切除1年以上无复发的早期胃肠道(gi)癌(食管癌、胃癌和结直肠癌)。排除有其他先前癌症的患者。
[0384]
实施例3：用抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱治疗局部晚期或转移性胆道癌(btc)患者
[0385]
目的：该研究的目的是评估任选地与吉西他滨和顺铂联用的抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱作为治疗局部晚期或转移性btc患者的一线疗法(1l)，是否促进无进展生存期(pfs)时间延长和/或最佳总体缓解(bor)。在此btc患者组中使用抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱的基本原理为，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱靶向肿瘤微环境中免疫抑制的两个最主要机制：pd
‑
l1和tgfβ。临床前数据表明，与单独使用抗pd
‑
l1抗体阿维鲁单抗或单独使用tgfβ阱相比，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱强有力地提高了抗肿瘤活性，延长了小鼠肿瘤模型的生存期。因此，pd
‑
l1和tgf
‑
β(一种已知可抑制肿瘤免疫激活的分子)的同时中和(任选与针对btc的化疗联合施用)可能改善患者的临床缓解。
[0386]
研究设计：本研究评估了安全性和耐受性、疾病缓解和生存率主要终点以评估抗pd
‑
l1/tgfβ阱(任选联用吉西他滨和顺铂)作为晚期或转移性btc患者的一线治疗的临床益处。在此研究中招募了约150名未接受过晚期或转移性btc先前治疗的患者(患者为未经治疗的)。本研究中的患者符合实施例2中所述患者的入选标准。根据ecog ps和癌症分期(局部晚期与转移性)对患者进行分层。
[0387]
为了评估抗pd
‑
l1/tgfβ阱与吉西他滨和顺铂合用的安全性，一个由大约6名患者组成的亚组每两周静脉注射一次1200mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，每三周注射一次1800mg或2400mg吉西他滨(剂量为1000mg/m2)，和在第1天注射顺铂(剂量为25mg/m2)；在每3周在第8天注射吉西他滨(剂量为1000mg/m2)，顺铂(剂量为25mg/m2)，直到24周(例如，见图8和表2)。剂量限制毒性(dlt)在前21天进行评估。从第25周到随后的周(例如，大约2年)，每三周一次给予2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱继续治疗，其中不共同给予吉西他滨或顺铂。
[0388]
为了评估临床疗效(bor，pfs)，患者接受抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱静脉内给药，剂量为每两周一次1200mg或者每三周一次1800mg或2400mg。一些患者每3周在第1天静脉注射共同给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨1000mg/m2，顺铂25mg/m2，第8天静脉注射给予吉西他滨1000mg/m2，顺铂25mg/m2，至第24周。从第25周到随后的周(例如，大约2年)，每三周一次给予2400mg抗pd
‑
l1/tgfβ阱继续治疗，其中不共同给予吉西他滨或顺铂。
[0389]
治疗持续至治疗失败，如根据《实体瘤疗效评估标准1.1版》(recist 1.1)确认的进展性疾病(pd)，出现不可接受的毒性，或长达24个月。在pd的情况下，如果患者的东部合作肿瘤协作组表现状态(ecog ps)保持稳定，如果治疗没有产生不可接受的毒性，并且患者将从继续治疗中获益，则经历pd的患者可以继续治疗。出现病情稳定(sd)、部分缓解(pr)或完全缓解(cr)的患者持续治疗，直至24个月的终点，尽管可能有其他治疗。
[0390]
在整个治疗过程中，通过记录、报告和分析医学基线状况、不良事件、体检发现(包括生命体征、ecog表现状态和实验室检查)持续评估安全性。
[0391]
安全性和疗效评估：安全终点包括不良事件、临床实验室评估、生命体征、体检、心
电图参数和ecog ps，并根据患者接受的实际治疗对患者进行评估。首次给药后每6周至12个月进行一次肿瘤测量以确定疗效，此后每12周进行一次，并根据实体瘤版本1.1(recist 1.1)中的疗效评估标准评估对治疗的疗效。通过ct扫描或mri评估抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱(有或没有吉西他滨和顺铂)的肿瘤疗效。在随后的访视中重复进行基线扫描。通常，在随后的肿瘤评估访视时使用相同的成像方法并且优选相同的成像设备跟踪在基线处检测到的病灶。根据recist 1.1，根据靶区、非靶区和新病灶的疗效评估来分配对治疗的肿瘤缓解。
[0392]
结果：客观肿瘤疗效通过总缓解率(orr)来评估，定义为达到完全缓解(cr)或部分缓解(pr)的总体最佳疗效(bor)的参试者数除以在此分析群中的参试者数。无进展生存期定义为从随机分组到根据recist 1.1评估的客观疾病进展(pd)的首次记录日或到任何原因所致死亡的时间，取二者中先发生的那个。据推测，抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗可产生未经治疗的晚期或转移性btc患者的初步临床活性，既可作为单一疗法，也可与吉西他滨和顺铂联合治疗。接受治疗的患者表现出疾病缓解(如部分缓解、完全缓解、病情稳定)和/或生存期(如无进展生存期和/或总生存期)改善。
[0393]
总之，抗pd
‑
l1/tgfβ阱被发现是一种创新的一流双功能融合蛋白，旨在同时靶向2种免疫抑制途径：pd
‑
l1和tgf
‑
β。因此，抗pd
‑
l1/tgfβ阱为未经治疗的晚期或转移性btc患者提供了一种新的治疗选择。
[0394]
实施例4：抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱在不耐受全身化疗或全身化疗失败的局部晚期或转移性btc患者中的初步剂量疗效方案
[0395]
在基于铂的一线(“1l”)治疗后进展的转移性或局部晚期btc患者每两周给予一次1200mg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，直到确认进展性疾病、不可接受的毒性或停药。主要目标是评估安全性和耐受性，而次要目标包括根据《实体瘤疗效评估标准1.1版》(recist v1.1)中的效果评估标准来评估总体最佳疗效(bor)。评估肿瘤细胞pd
‑
l1表达(抗体克隆73
‑
10；大科(dako))。
[0396]
30例经预先治疗的btc患者接受抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗，中值持续时间为8.9周(范围2
‑
57.6周)。5名患者仍在接受治疗。最常见的治疗相关不良事件(trae)是发热，斑丘疹(都是13.3％)，皮疹和脂肪酶增加(都是10％)。10名患者(33.3％)经历了≧3级trae。报告3例因不良事件的死亡；1例因14次给药后感染性休克(菌血症可能因皮肤感染)的死亡，2例因间质性肺病的死亡，1例因3次给药后治疗的死亡，另1例在最后一次给药后6个月死亡。6名患者有明确的客观缓解(orr，20％)，其中5名患者有部分缓解(pr)，4名患者在3.9+、4.2+、5.5+和6.9+个月时仍在接受治疗，1名患者在5.5+个月时完全缓解(cr)。另外两名患者有持续的临床获益：一名患者在治疗1年后出现部分缓解(“pr”)，一名患者在首次假性进展后7.6+个月时出现持续的pr。pd
‑
l1阳性(≥1％)和pd
‑
l1阴性肿瘤患者pd
‑
l1表达证实的orr分别为25％和15.4％。
[0397]
这些结果表明，抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法在具有预治疗的btc的患者中具有可管理的安全性和有希望的疗效，包括30例患者中的8例(27％)中的长期缓解。
[0398]
实施例5：抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱在不耐受全身化疗或全身化疗失败的局部晚期或转移性btc患者中的给药方案
[0399]
用抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗对一线全身化疗失败或不耐受的局部晚期或转移性btc患者，直到确诊为进展性疾病(pd)、不可接受的毒性或退出研究。排除壶腹癌。
[0400]
在一个示例性实施方式中，每两周一次向参与者给予1200mgbw非依赖性剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每3周一次向参与者给予1800mgbw非依赖性剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每3周一次向参与者给予2100mgbw非依赖性剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每3周一次向参与者给予2400mgbw非依赖性剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。静脉内给药持续约1小时(
‑
10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱分子用药前约30至60分钟强制给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25
‑
50mg苯海拉明和500
‑
650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。第二次输注后，任选或由研究者自行决定是否进行预先用药。如果在前两次输注期间看到2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。
[0401]
在一个示例性实施方式中，参与者失败或不能耐受的全身化疗是基于铂的化疗。
[0402]
下面是该实施例中患者的纳入标准。患者：
[0403]
‑
年龄≥18岁
[0404]
‑
经组织学或细胞学检查证实为局部晚期或转移性btc；根据recist1.1，必须至少有1个一维可测量病灶可测量疾病，并经独立影像学检查证实
[0405]
‑
必须一线全身化疗失败或对一线全身化疗不耐受，或在辅助治疗完成后6个月内有疾病复发的证据
[0406]
‑
在首次给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱前28天内有可获得的肿瘤材料(原发性或转移性)可用于生物标志物评估
[0407]
‑
在研究开始和抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗的第1天，东部合作肿瘤协作组的表现状态(ecog
‑
ps)为0
‑1[0408]
‑
研究者判断预期寿命≥12周。
[0409]
‑
足够的血液功能，其定义为白细胞(wbc)计数≥3
×
109/l，中性粒细胞绝对计数(anc)≥1.5
×
109/l，淋巴细胞计数≥0.5
×
109/l，血小板计数≥75
×
109/l，且血红蛋白(hgb)≥9g/dl(无输血时)。
[0410]
‑
具有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5
×
正常上限(uln)，天冬氨酸转氨酶(ast)水平≤2.5
×
uln，且丙氨酸转氨酶(alt)水平≤2.5
×
uln。对于肝脏受累于肿瘤的参与者，ast≤5.0
×
uln且alt≤5.0
×
uln是可接受的。
[0411]
‑
具有足够的凝血功能，如凝血酶原时间(pt)或国际标准化比值(inr)≤1.5x uln，除非参与者正在接受抗凝治疗。
[0412]
‑
白蛋白≥3.3g/dl
[0413]
‑
具有足够的肾功能，其定义为根据cockcroft
‑
gault公式或通过测量24小时尿液收集的肌酐清除率估计的肌酐≤1.5x uln或肌酐清除率>40ml/分钟。
[0414]
οccr(ml/分钟)＝(140
‑
年龄)x体重(kg)/(72x血清cr jaffe
)
[0415]
ο如果是女性，x 0.85
[0416]
ο如果用酶法测定cr，则加0.2，以cr
jaffe
＝0.2+cr
enzume
使用；
[0417]
‑
并且白蛋白≥3.3g/dl
[0418]
在至少一个研究中，选择的患者没有在接受免疫刺激剂时可能会恶化的自身免疫性疾病或活动性结核病。在至少一个研究中，选择的患者没有间质性肺病或其病史、肝硬化、已知的人类免疫缺陷病毒(hiv)检测阳性史或已知的获得性免疫缺陷综合征、未控制的胆道感染、需要全身治疗的活动性细菌或真菌感染，具有临床意义的心脑血管/脑血管疾病。在至少一个研究中，选择的患者没有中枢神经系统(cns)转移(有cns转移治疗史(通过手术或放射治疗)的患者不合格，除非他们已经治疗完全康复，至少3个月没有进展，并且不需要继续类固醇治疗)。
[0419]
在至少一个研究中，选择的患者不是任何器官移植的接受者，包括异基因干细胞移植，但不需要免疫抑制的移植除外(如角膜移植、毛发移植)。在一个研究中，选择的患者没有已知的抗pd
‑
l1/tgfβ阱或其产品过敏反应史，或已知的单克隆抗体严重过敏反应史，任何过敏史，或最近(5个月内)未控制的哮喘史。
[0420]
在一个示例性实施方式中，选择的患者在研究治疗开始前21天内未接受抗癌治疗，例如细胞还原治疗、涉及>30％骨髓的放射治疗(姑息性骨定向放射治疗除外)、免疫治疗或细胞因子治疗。选择的患者在试验治疗开始前7天内未接受免疫抑制剂全身治疗；或在试验治疗开始前28天内未使用任何试验药物。
[0421]
在一个示例性实施方式中，选择的患者具有>3年内无复发的治愈性治疗癌症或以治愈性目的治疗的早期癌症，包括宫颈原位癌、浅表性、非侵袭性膀胱癌、基底细胞癌或鳞状细胞原位癌。允许内镜下切除1年以上无复发的限于黏膜层的早期胃肠道(gi)癌(食管癌、胃癌和结直肠癌)。排除有其他先前癌症的患者。
[0422]
实施例6：在不耐受全身化疗或全身化疗失败的局部晚期或转移性btc患者中的抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱治疗
[0423]
目的：根据nccn和esmo指南，目前尚无针对btc的已建立的二线治疗作为标准护理。本研究的目的是评估抗pd
‑
l1/tgfβ阱作为二线治疗用于局部晚期或转移性btc一线全身化疗失败或对一线全身化疗不耐受的患者是否能提高总体疗效。在此患者组中使用抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱的基本原理为，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱靶向肿瘤微环境中两个主要免疫抑制机制：pd
‑
l1和tgfβ，并且可能克服检查点抑制剂单一疗法的耐药性。如上文实施例4所述，早期临床数据证明抗pd
‑
l1/tgfβ阱具有治疗效果，作为btc的二线治疗，总缓解率为20％(30名患者中有6名患者)。因此，目前的研究得到了来自小样本的有希望的早期临床疗效数据的支持。
[0424]
研究设计：本研究评估了安全性和耐受性、疾病缓解和生存率主要终点以评估抗pd
‑
l1/tgfβ阱作为晚期或转移性btc的二线治疗的临床益处。该研究中招募了约140名患者。以实体瘤1.1版(recist 1.1)疗效评价标准确定的最佳总缓解率(bor)作为主要终点，用于确定总缓解率。治疗效果也可以通过持久缓解率(完全缓解或部分缓解持续至少6个月的参与者百分比)、缓解持续时间、无进展生存期和总生存期来衡量。本研究中的患者符合实施例5中所述的入选标准。
[0425]
覆盖从胸腔入口上方到耻骨联合的区域的胸部/腹部和骨盆对比增强ct是首选成像方式。如果参与者不应接受碘化造影剂或由于辐射防护原因，应进行同一区域的磁共振成像(mri)，根据批准的当地协议使用钆增强，并结合胸部从胸腔入口到肋膈下隐窝的非增强ct。在研究中每个参与者应该使用相同的方法。
[0426]
在治疗前28天内进行基线扫描。疾病必须可通过recist 1.1至少1个一维可测量病变进行测量，并通过独立影像学检查进行确认。所有在基线检查时进行的扫描都需要在随后的肿瘤评估随访中重复进行。通常，在随后的肿瘤评估访视时需要使用相同的成像方法并且优选相同的成像设备跟踪在基线处检测到的病灶。
[0427]
参与者每隔6周进行x射线成像评估，以评估参与者首次给予抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱的1年内对治疗的疗效，然后每12周进行一次。抗pd
‑
l1/tgfβ阱的安全性将通过记录、报告和分析基线医疗状况、ae、体检结果(包括生命体征、实验室检查、ecog
‑
ps和12导联心电图(ecg)记录)进行评估。该研究在最后一名参与者接受最后一剂抗pd
‑
l1/tgfβ阱后1年结束。
[0428]
本发明设想抗pd
‑
l1/tgfβ阱可提高对一线全身化疗失败或不耐受的btc患者的生存率。
[0429]
实施例7：抗pd
‑
l1/tgfβ阱联合顺铂或吉西他滨增强抗肿瘤疗效的研究
[0430]
在该实例中，描述了评价抗pd
‑
l1/tgfβ阱与顺铂或吉西他滨共同给药的抗肿瘤功效的实验。
[0431]
细胞系：4t1鼠乳腺癌细胞和mb49膀胱癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。4t1细胞在添加10％热灭活胎牛血清(fbs)(生命技术公司(life technologies))的rpmi1640培养基中培养。mb49细胞在含有10％fbs的达氏改良伊氏培养基(dmem)中培养。所有细胞在无菌条件下培养，并于37℃和5％co2下孵育。细胞传代后进行体内植入，用tryple express(布可公司(gibco))或0.25％胰蛋白酶收获贴壁细胞。
[0432]
小鼠：balb/c小鼠获自查尔斯河实验室(charles river laboratories)。所有实验用小鼠均为6至12周龄的雌鼠。小鼠笼养于无病原体的设施中，自由进食和饮水。
[0433]
治疗：对于所有研究，在治疗开始当天(第0天)将小鼠随机分成各治疗组。
[0434]
评估：每周用数字卡尺测量两次肿瘤大小，并用winwedge软件自动记录。用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长度
×
宽度
×
高度
×
0.5236。每周测量两次体重，当小鼠的肿瘤体积超过其体重的12.5％(约2500mm3)后处死。
[0435]
统计学分析：用graphpad prism软件7.0版进行统计分析。肿瘤体积数据以图形方式表示，以多种符合表示均值
±
sem，以多种线形表示各个小鼠。为了评估治疗组之间肿瘤体积的差异，进行双向方差分析(anova)，然后进行tukey多重比较检验。
[0436]
相对于同种型对照，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱联合顺铂/吉西他滨，而非单独抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱改善抗肿瘤功效
[0437]
抗pd
‑
l1/tgfβ阱联合顺铂治疗4t1鼠肿瘤模型：治疗前7天将0.5
×
105个4t1细胞原位接种于balb/c小鼠乳腺脂肪垫。在第0天(即接种后7天)，用同型对照(同型对照是完全缺乏pd
‑
l1结合的抗pd
‑
l1突变版本)(静脉注射给予400μg；第2、5、8天))+pbs对照(腹腔注射0.2ml；第0天)，抗pd
‑
l1/tgfβ阱(492μg，静脉注射；第2、5、8天)、顺铂(5mg/kg，静脉注射；第0天)或抗pd
‑
l1/tgfβ阱+顺铂处理小鼠(n＝10只小鼠/组)。
[0438]
每周测量肿瘤体积两次。图10a描绘了每个治疗组的平均肿瘤体积(平均
±
sem)，如图所示。图10b
‑
10e是描绘各治疗组中单个小鼠的肿瘤体积的线图：图10b中的每条线表示用同型对照和pbs对照(标记为“同种型对照”)治疗的小鼠的肿瘤体积；图10c中的每条线表示用顺铂单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图10d中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图10e中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱和顺铂组合治疗
的小鼠的肿瘤体积。
[0439]
通过双向rm方差分析和tukey事后检验来计算p值。尽管在该模型中，抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法相对于同型对照组对抗肿瘤活性没有影响，但与抗pd
‑
l1/tgfβ阱和顺铂单一疗法相比，抗pd
‑
l1/tgfβ阱联合顺铂显著增强抗肿瘤活性(第19天分别为p<0.0001和p<0.0001)。
[0440]
在mb49鼠肿瘤模型中抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱联合吉西他滨：在本实验中，balb/c小鼠在治疗前7天肋部皮下接种1
×
106个mb49细胞。在第0天(即接种后7天)，用同型对照(400μg，静脉注射；第2、5、8天)+pbs对照(0.2ml，静脉注射；第0天)、抗pd
‑
l1/tgfβ阱(492μg，静脉注射；第2、5、8天)、吉西他滨(120mg/kg，静脉注射；第0天)或抗pd
‑
l1/tgfβ阱+吉西他滨处理小鼠(n＝10只小鼠/组)。
[0441]
每周测量肿瘤体积两次并且表示为平均
±
sem(图11a)或单独的肿瘤体积(图11b
‑
11e)。图11b
‑
11e是描绘各治疗组中单个小鼠的肿瘤体积的线图：图11b中的每条线表示用同型对照和pbs对照(标记为“同种型对照”)治疗的小鼠的肿瘤体积；图11c中的每条线表示用吉西他滨单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图11d中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱单一疗法治疗的小鼠的肿瘤体积；图11e中的每条线表示用抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨组合治疗的小鼠的肿瘤体积。
[0442]
通过双向rm方差分析和tukey事后检验来计算p值。尽管在该模型中，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨单一疗法相对于同型对照组对抗肿瘤活性没有影响，但与抗pd
‑
l1/tgfβ阱和吉西他滨单一疗法相比，抗pd
‑
l1/tgfβ阱联合吉西他滨显著增强抗肿瘤活性(第15天分别为p<0.0001和p<0.0001)。
[0443]
序列
[0444]
seq id no：1
[0445]
分泌的抗pd
‑
l1λ轻链的肽序列
[0446]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0447]
seq id no:2
[0448]
分泌的抗pdl1的h链的肽序列
[0449]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0450]
seq id no:3
[0451]
分泌的抗pdl1/tgfβ阱h链的肽序列
[0452]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepksc
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgaggggsggggsggggsggggsgipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0453]
seq id no:4
[0454]
抗pd
‑
l1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的dna序列(vl之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)
[0455]
atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggccagtccgccctgacccagcctgcctccgtgtctggctcccctggccagtccatcaccatcagctgcaccggcacctccagcgacgtgggcggctacaactacgtgtcctggtatcagcagcaccccggcaaggcccccaagctgatgatctacgacgtgtccaaccggccctccggcgtgtccaacagattctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggcagaggacgaggccgactactactgctcctcctacacctcctccagcaccagagtgttcggcaccggcacaaaagtgaccgtgctgggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcccccaccgagtgctcatga
[0456]
seq id no:5
[0457]
从翻译起始密码子至翻译终止密码子的dna序列(mvk sp前导序列：小写下划线；vh：大写字母；含k至a突变的igg1m3：小写字母；(g4s)x4
‑
g(seq id no：11)接头：粗体大写字母；tgfβrii：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)
[0458][0459][0460]
seq id no:6
[0461]
分泌的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱λ轻链的多肽序列，具有突变a31g，d52e，r99y
[0462]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiyevsnrpsgvsnrfsgsks
gntasltisglqaedeadyycssytssstyvfgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0463]
seq id no:7
[0464]
分泌的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱重链的多肽序列
[0465]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsmymmmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtaiyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgaggggsggggsggggsggggsgipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0466]
seq id no:8
[0467]
人tgfβrii同种型a前体多肽(ncbi refseq登录号：np_001020018)
[0468]
mgrgllrglwplhivlwtriastipphvqksdvemeaqkdeiicpscnrtahplrhinndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrqqklsstwetgktrklmefsehcaiileddrsdisstcanninhntellpieldtlvgkgrfaevykaklkqntseqfetvavkifpyeeyaswktekdifsdinlkhenilqfltaeerktelgkqywlitafhakgnlqeyltrhviswedlrklgsslargiahlhsdhtpcgrpkmpivhrdlkssnilvkndltcclcdfglslrldptlsvddlansgqvgtarymapevlesrmnlenvesfkqtdvysmalvlwemtsrcnavgevkdyeppfgskvrehpcvesmkdnvlrdrgrpeipsfwlnhqgiqmvcetltecwdhdpearltaqcvaerfselehldrlsgrscseekipedgslnttk
[0469]
seq id no:9
[0470]
人tgfβrii同种型b前体多肽(ncbi refseq登录号：np_003233)
[0471]
mgrgllrglwplhivlwtriastipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrqqklsstwetgktrklmefsehcaiileddrsdisstcanninhntellpieldtlvgkgrfaevykaklkqntseqfetvavkifpyeeyaswktekdifsdinlkhenilqfltaeerktelgkqywlitafhakgnlqeyltrhviswedlrklgsslargiahlhsdhtpcgrpkmpivhrdlkssnilvkndltcclcdfglslrldptlsvddlansgqvgtarymapevlesrmnlenvesfkqtdvysmalvlwemtsrcnavgevkdyeppfgskvrehpcvesmkdnvlrdrgrpeipsfwlnhqgiqmvcetltecwdhdpearltaqcvaerfselehldrlsgrscseekipedgslnttk
[0472]
seq id no:10
[0473]
人tgfβrii同种型b胞外域多肽
[0474]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0475]
seq id no:11
[0476]
(gly4ser)4gly接头
[0477]
ggggsggggsggggsggggsg
[0478]
seq id no:12
[0479]
分泌的抗pd
‑
l1抗体mpdl3289a重链可变区的多肽序列
[0480]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss
[0481]
seq id no:13
[0482]
分泌的抗pd
‑
l1抗体mpdl3289a轻链可变区的多肽序列
[0483]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr
[0484]
seq id no:14
[0485]
分泌的抗pd
‑
l1抗体yw243.55s70重链可变区的多肽序列
[0486]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvsa
[0487]
seq id no:50
[0488]
截短的人tgfβrii同种型b细胞外结构域多肽
[0489]
gavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0490]
seq id no:51
[0491]
截短的人tgfβrii同种型b细胞外结构域多肽
[0492]
vkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0493]
seq id no:52
[0494]
截短的人tgfβrii同种型b胞外域多肽
[0495]
vtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0496]
seq id no:53
[0497]
截短的人tgfβrii同种型b胞外域多肽
[0498]
lckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0499]
seq id no:54
[0500]
突变的人tgfβrii同种型b胞外域多肽
[0501]
vtdnagavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0502]
seq id no:55
[0503]
抗pd
‑
l1抗体重链可变区的多肽序列
[0504]
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsisndywtwirqhpgkgleyigyisytgstyynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycarsggwlapfdywgrgtlvtvss
[0505]
seq id no:56
[0506]
抗pd
‑
l1抗体轻链可变区的多肽序列
[0507]
divmtqspdslavslgeratinckssqslfyhsnqkhslawyqqkpgqppklliygastresgvpdrfs
gsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyygypytfgggtkveik
[0508]
seq id no:57
[0509]
抗pd
‑
l1抗体重链可变区的多肽序列
[0510]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgrigpnsgftsynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarggssydyfdywgqgttvtvss
[0511]
seq id no:58
[0512]
抗pd
‑
l1抗体轻链可变区的多肽序列
[0513]
divltqspaslavspgqratitcrasesvsihgthlmhwyqqkpgqppklliyaasnlesgvparfsgsgsgtdftltinpveaedtanyycqqsfedpltfgqgtkleik
[0514]
seq id no:59
[0515]
抗pd
‑
l1抗体重链的多肽序列
[0516]
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsisndywtwirqhpgkgleyigyisytgstyynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycarsggwlapfdywgrgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0517]
seq id no:60
[0518]
抗pd
‑
l1抗体轻链的多肽序列
[0519]
divmtqspdslavslgeratinckssqslfyhsnqkhslawyqqkpgqppklliygastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyygypytfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0520]
seq id no:61
[0521]
抗pd
‑
l1抗体重链的多肽序列
[0522]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgrigpnsgftsynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarggssydyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslga
[0523]
seq id no:62
[0524]
抗pd
‑
l1抗体轻链的多肽序列
[0525]
divltqspaslavspgqratitcrasesvsihgthlmhwyqqkpgqppklliyaasnlesgvparfsgsgsgtdftltinpveaedtanyycqqsfedpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0526]
通过引用纳入
[0527]
本文提及的每篇专利文献和科学论文的全部公开内容通过援引纳入本文用于所有目的。
[0528]
等同形式
[0529]
在不脱离本公开的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文所述的公开内容。不同实施例中的各种结构元件和所述各种方法步骤可以任意组合排列而所有这些变型都应视为本公开的方式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。