一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用的制作方法

本发明涉及一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因optdc2的克隆表达及应用，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质，属于生物工程
技术领域：
。
背景技术：
：色氨酸脱羧酶(tryptophandecarboxylase，ec4.1.1.28,tdc)可以催化色氨酸脱羧形成色胺，是喜树碱合成过程中连接初生代谢和次生代谢的关键酶。色氨酸脱羧酶最早是见于药用植物长春花中进行报道，并且在多种植物中均有发现。色氨酸脱羧酶属于裂解酶类，具有较高的底物特异性，对类似的芳香族氨基酸如酪氨酸，苯丙氨酸等没有脱羧作用。先前的研究表明，色氨酸脱羧酶基因在陆生植物中往往以多基因家族形式存在。例如，melina等人于1997年在喜树中分离和鉴定了两条色氨酸脱羧酶基因；pang等人对西红柿中全部5条色氨酸脱羧酶基因进行了功能解析；kang等人通过生物信息的手段证明水稻中含有七条色氨酸脱羧酶基因及其类似物。然而截止目前为止，短小蛇根草中的色氨酸脱羧酶见于报道的只有一条。这一现象与其多基因家族存在这一事实不符。因此，本发明利用本实验室短小蛇根草的转录组数据，从实验室温室培养的短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定出一条新的色氨酸脱羧酶基因，并将其命名为optdc2。利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白optdc2以验证其活性，并对其进行ni-柱亲和纯化以及酶学性质研究。技术实现要素：本发明目的在于从药用植物短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定了一条新的色氨酸脱羧酶基因optdc2，利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白optdc2，并公开了其酶学性质及其应用。本发明采用的技术方案是：一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因optdc2，所述色氨酸脱羧酶基因optdc2的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。一种上述的色氨酸脱羧酶基因optdc2的克隆表达方法，通过将色氨酸脱羧酶基因optdc2构建至原核表达载体pcoldtf中得到重组质粒pcoldtf-optdc2，并将阳性重组质粒pcoldtf-optdc2转入bl21(de3)感受态细胞中组成重组菌株。重组菌株在诱导剂iptg的诱导下表达出可溶性蛋白optdc2。所述重组质粒pcoldtf-optdc2的序列如seqidno.4所示，其中原核表达载体pcoldtf的序列如seqidno.3所示。其中，构建重组质粒pcoldtf-optdc2时，先提取短小蛇根草无菌苗全基因组rna，并将其反转录获得全基因组cdna。设计色氨酸脱羧酶基因optdc2的特异性引物，扩增得到色氨酸脱羧酶基因optdc2全长编码框序列，将扩增得到的色氨酸脱羧酶基因optdc2全长编码框序列与双酶切后的pcoldtf质粒片段进行同源重组连接从而构建得到重组表达质粒pcoldtf-optdc2。一种上述可溶性蛋白optdc2在色氨酸催化反应中的应用。进一步地，所述的色氨酸催化反应的温度为15～70℃,ph为5.5～11.0,辅因子浓度为0.1～3.0mmol·l-1。进一步地，所述的色氨酸催化反应的最适温度为45℃，最适ph为8.0，最适辅因子浓度为0.1mmol·l-1。进一步地，所述的色氨酸催化反应中还包括金属离子mn2+，mn2+的终浓度为10mmol·l-1。进一步地，所述辅因子为磷酸吡哆醛。本发明的有益效果：从药用植物短小蛇根草中鉴定出一条新的色氨酸脱羧酶optdc2，为进一步解析该药用植物中关键酶基因参与调控抗癌药物喜树碱的合成奠定了一定的研究基础。同时，通过研究发现其同样可以催化色氨酸脱羧形成色胺，其米氏常数km值为1.02mm。相比于其他来源植物的色氨酸脱羧酶，比如长春花(catharanthusroseus)km为1.31mm，萝芙木(rauvolfiaverticillate)km为2.89mm，印度人参(withaniasomnifera)km为1.49mm，我们的色氨酸脱羧酶optdc2具有更低的米氏常数，即对底物的亲和力更强，催化效率更高，可以为合成生物学研究提供多样性的底物来源，因此具有一定的应用价值。附图说明图1：pcoldtf-optdc2的重组载体谱；图2：sds-page分析重组工程菌e.coilbl21iptg诱导表达情况：m:marker；1:含pcoldtf的菌株胞内可溶表达；2：含pcoldtf-optdc2菌株胞内可溶表达；图3：sds-page分析重组工程菌e.coilbl21胞内可溶蛋白的纯化情况：m:marker；1:胞内可溶蛋白；2：0mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；3：40mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；4：300mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；5：500mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；图4：a:色胺标准品的hplc分析图；b:纯化后的pcoldtf-optdc2蛋白(灭活)催化反应产物的hplc分析图；c：纯化后pcoldtf-optdc2蛋白(未灭活)催化反应产物的hplc分析图；图5：不同温度对色氨酸脱羧酶活性的影响；图6：不同ph对色氨酸脱羧酶活性的影响，图中，空心圆对应ph5.5-7.5,实心圆对应ph7.5-9,空心菱形对应ph9-11；图7：不同辅因子浓度对色氨酸脱羧酶活性的影响；图8：不同金属离子对色氨酸脱羧酶活性的影响；图9：以l-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的催化动力学参数；图10：以l-色氨酸和d-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的底物特异性。具体实施方式下述实施例中，采用的pcoldtf载体购自于北京华越洋生物有限公司，但不限于此。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。一般性说明：实施例所涉及的rna提取试剂盒和反转录试剂盒购自北京天根生化有限公司，快切酶购自takara公司，无缝连接酶购自南京诺唯赞公司，质粒试剂盒购自上海生物工程有限公司，胶回收试剂盒购自thermofisherscientific公司，但不限于此。操作完全按照相应说明书进行。引物合成与质粒测序由浙江尚亚生物技术有限公司完成。optdc2基因的获得我们使用o.pumilatdc(bac41515.1)作为在短小蛇根草转录组数据库中进行局部blast搜索的探针来识别假定的o.pumilatdcs。蛋白质序列(genebankmn864864)与先前报道的optdc具有高度同源性，命名为optdc2，optdc2的基因序列如seqidno.1所示,氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例1本实施例为本发明所述的色氨酸脱羧酶基因的克隆及大肠杆菌工程菌的构建短小蛇根草rna提取及反转录1将短小蛇根草无菌苗洗净放入液氮速冻，使用已经处理过的研钵对其进行充分研磨，取50-100mg粉末进行rna提取。利用rna提取试剂盒和反转录试剂盒得到全植株cdna备用。2大肠杆菌感受态的制备从lb平板上分别挑取jm109和bl21(de3)单菌落，接种于2mllb培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。然后将菌液按照1:50(v/v)的比例接种于50mllb培养基中，37℃震荡培养3h左右至od600＝0.4-0.6得到培养菌液。分别取1ml上述培养菌液于1.5ml离心管中，冰浴5min，4℃5000r/min离心5min，弃上清(注意尽量弃除上清)。在每个离心管中加入100ul冰上预冷的solutiona，轻轻晃动离心管使菌体充分悬浮，禁止剧烈振荡。4℃5000r/min离心5min，弃上清(注意尽量弃除上清)。在每个离心管中加入100ul冰上预冷的solutionb，轻轻晃动离心管使菌体充分悬浮，禁止剧烈振荡。制作完成得到jm109和bl21感受态细胞。本感受态细胞可以直接用于dna的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时,可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后,不能再进行-80℃保存。3pcr扩增色氨酸脱羧酶基因1)引物的设计根据本实验室短小蛇根草转录组数据库中色氨酸脱羧酶基因optdc2的序列设计引物，引物直接带有同源臂和酶切位点(下划线标示)，具体引物设计为：f：ggtatcgaaggtaggcatatgatgggcagcattgatgcaa(seqidno.5)r：ctatctagactgcaggtcgacttaaatatcaatgcactgatgattttcc(seqidno.6)2)pcr扩增扩增反应体系为：pcr反应组成液(50ul)pcr反应的条件：98℃30s，58℃30s，72℃1.5min，35个循环，得到pcr产物最后保存于4℃中。pcr产物经过胶回收试剂盒回收后送浙江尚亚生物有限公司测序，测序所得到色氨酸脱羧酶基因optdc2基因序列如seqidno.1所示。3)双酶切和连接将pcoldtf质粒(序列如seqidno.3所示)进行双酶切，酶切体系为10×q.cutbuffer5ulpcoldtf质粒30ul限制性内切酶ndeⅰ2.5ul限制性内切酶salⅰ2.5ul灭菌蒸馏水10ul上述反应在37℃反应3h后进行核酸胶回收，然后与pcr回收产物进行连接。连接体系为：上述反应在37℃反应30min，然后冰浴5min，准备转化。4)转化1.取1管上述制得的jm109感受态置于冰上融化。2.将连接反应液全部转入jm109感受态中，并吹打均匀。3.冰浴30min。4.在42℃水浴中热激90s，然后冰浴2min。5.加入1mllb培养基，在37℃条件下培养1h复壁。6.5000r/min离心5min，弃900ul上清，剩余菌体和培养液吹打均匀，涂布含有amp抗性的平板。7.37℃过夜倒置培养。8.挑选6个单克隆重组质粒进行菌落pcr阳性鉴定，并将阳性克隆送浙江尚亚生物进行测序。测序引物为pcoldtf通用引物pcoldf1primer和pcoldr1primer。9.比对测序结果，得到阳性重组质粒pcoldtf-optdc2(如seqidno.4所示)，其图谱如图1所示。10.将阳性重组质粒转入bl21(de3)感受态得到重组菌株备用。实施例2本实施例为本发明所述的重组菌株的诱导表达1.取10ul实施例1制得的重组菌株加入2mllb培养基，加入2ul氨苄溶液(终浓度为100ug/ml)，以空载菌株(pcoldtf质粒转入bl21(de3))作为对照，37℃，220rpm，过夜培养得到种子菌液。2.取上一步骤种子菌液400ul转接加入含20mllb培养基的三角瓶，加入20ul氨苄溶液(终浓度为100ug/ml)，培养3h左右至od600＝0.4-0.6,冰浴15min。3.每个三角瓶中加入50ul的iptg溶液(终浓度为0.1mmol·l-1)，16℃，220rpm，过夜诱导培养。4.分别取步骤3中诱导的空质粒菌液和带目的基因的重组质粒菌液1ml，8000rpm离心5min，弃上清，再分别加入1ml磷酸缓冲液(ph＝8.0)重悬菌体，超声破碎，破2s停4s，35％功率，持续5min。5.4℃下，8000rpm离心5min，取上清跑蛋白胶验证，如图2所示，重组蛋白可溶性表达。6.蛋白纯化及酶活性鉴定。通过上述方法，将剩余的pcoldtf-optdc2发酵液进行菌体富集破碎得到粗酶液。通过aktapure蛋白纯化系统进行ni-柱纯化，洗脱方法为将a1、a2、b1、b2、四根管路都放到水里，设置systemflow20ml/min进行排气。然后设置systemflow1ml/min、flowpath(columnposition3)、deltapressure0.5、gradient0、inseta1,待水滴均匀流出后装ni-柱，平衡10min后将a1放入结合液中，b1放入洗脱液中，再排气一次，平衡15min，然后上样粗酶液，用300mm的高浓度咪唑缓冲液b1梯度洗脱目的蛋白，如图3所示，将吸附在柱子上的蛋白洗脱下来得到色氨酸脱羧酶备用。实施例3取20mmol·l-1磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液0.25ml(ph＝8.0)补足蒸馏水至0.8ml，加入0.03ml纯酶，45℃预热5min,加入0.2mll-色氨酸反应30min,加入1.0ml甲醇终止反应,通过hplc检测在波长为280nm处的特征峰。hplc结果如图4所示，本研究所得到的纯酶optdc2可以催化色氨酸进行脱羧反应，当optdc2酶高温失活后则无法进行脱羧反应。实施例4-9是对纯化得到的蛋白进行酶学性质研究。其反应体系为100ul反应体系，其中底物母液浓度是50mol·l-1，辅因子为磷酸吡哆醛，色氨酸脱羧酶浓度0.25mg·ml-1，反应30min后加入100ul甲醇终止反应,并进行hplc定量。实施例4本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适温度值。以l-色氨酸为底物，在ph＝8.0、辅因子浓度为0.1mmol·l-1的条件下，分别测定不同的温度值(15,20,25,30,35,40,45,50,55，60,65,70℃)条件下的色胺的产量。如图5所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适温度值为45℃。实施例5本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适ph值。以l-色氨酸为底物，在45℃、辅因子浓度为0.1mmol·l-1的条件下，分别测定不同的ph(50mmol·l-1nah2po4-na2hpo4,ph5.5-7.5；50mmol·l-1tris-hcl,ph7.5-9.0；50mmol·l-1glycine-naoh,ph9.0-11.0)条件下的色胺的产量。如图6所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适ph值为8.0。实施例6本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适辅因子浓度值。以l-色氨为底物，在ph＝8.0和反应温度为45℃的条件下，分别测定不同的辅因子浓度(0.1,0.5,1.0,1.5,2.0，2.5，3.0mmol·l-1)条件下的色胺的产量。如图7所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适辅因子浓度为0.1mmol·l-1。实施例7本实施例为本发明所述的不同的金属离子(氯化钠-na+，氯化钾-k+，氯化亚铁-fe2+,氯化铁-fe3+，硫酸锰-mn2+，硫酸铜-cu2+，氯化镁-mg2+，氯化钙-ca2+，硫酸锌-zn2+,终浓度为10mmol/l)对色氨酸脱羧酶酶促反应的影响。以l-色氨酸为底物，在ph＝8.0，反应温度为45℃的条件，辅因子浓度为0.1mmol·l-1下，分别测定不同的金属离子存在情况下的色胺的产量。如图8所示可知，mn2+对该酶促反应有明显的促进作用，cu2+，zn2+，fe3+对该酶促反应有明显的抑制作用。实施例8本实施例为本发明所述的以l-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的催化动力学参数。在最适反应ph和反应温度下测定该色氨酸脱羧酶催化不同浓度的l-色氨酸时的反应速率,反应体系中含0.1mmol·l-1辅因子磷酸吡哆醛,参照linewear-burk双倒数作图法,计算vmax和km值，进而算出kcat/km值，如图9所示，km＝1.02mmol·l-1，vmax＝0.20umol·min-1，kcat＝0.79s-1，kcat/km＝774.5s-1·mol-1。实施例9本实施例为本发明所述的以l-色氨酸和d-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的底物特异性。如图10所示，结果表明该色氨酸脱羧酶对l型色氨酸的亲和力要强于d型色氨酸。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干优化改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。序列表<110>浙江中医药大学<120>一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因optdc2的克隆表达及应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1536<212>dna<213>短小蛇根草(ophiorrhizapumila)<400>1atgggcagcattgatgcaaataatatcaatggtgcttatccttcatccccagttgcccca60ttcaaaccacttgatcccgaagagttcaggaaacaagcccatgttatggttgatttcata120gctgattattacaaaaatattgaaaaatatccagttctcagccaagttgagcctggttat180cttcgaacccgcctccctgaaacggccccttatttacctgaaccctttgagaacattctt240caagatatacaaaaagatattatccctggaatgactaactggctaagccccaactttttt300gcatattttccagccactgttagctctgctgcttttcttggagaaatgttatgcactggt360ttcaactctgtggggtttaactggctcgcttcccctgctgccaccgaactagagatggtg420gttatagattggctggctaacatgcttaagctcccaaattctttcatgttttcaggcact480ggtggcggtgttcttcaaggaacaaccagtgaggctattctttgtacccttatcgcctcc540cgcgaccgtgcattcgagaaaattggagttgaaaacattggtaagcttgtggtttatgca600tctgatcaaacacactcttttttccacaagacttgcaaattagctgggatttttccatgc660aatataaaaataattcctacaacctcggaagccaacttttccatgtcccctcatgctctg720cgtaaacaaatcgaatctgacgttgcgggcggattggtcccaattttcctatgtgcaaca780atagggaccacttcgaccactgccattgacccagtgagtggtcttgccaaagtggcaaat840gatttcagtgtgtggattcacgttgatgctgcctatgcaggaagtgcatgcatatgccct900gaatttaggaagtatttggatggagttgagctagttgattcacttagtttgagccctcat960aaatggttactttgttatttggattgctgttgcttgtgggtaaagaaaccggcattgatg1020gtgaaggcgttgagcactaaccctgagtacttgagaaacaaaagaagtgaatttgattca1080gttgtggattttaaagattggcaaataggtaccggccggcgatttcgagcactccgatta1140tggcttattatgcgtagttacggcgttgcaaacctccaacgacacattcgatcggacgtt1200gaaatggctaaaatgttcgaaggattcgtgaagtctgatccgaggtttgaagttgttgtg1260ccgcgaacattttcacttgtatgttttaggctcaatccatttggacgttccaataatgca1320acctacgtagaactcttgaacgagaagctgctggatttggttaattcaactggcagagct1380tacatgactcacacaaaggttggtggagtatacatgttgagatttgcagttggagcgaca1440ttgacagaggaacgccatgtgaatgcagcttgggaattaataaaagaatgcactgctgct1500ttactcaaggaaaatcatcagtgcattgatatttaa1536<210>2<211>511<212>prt<213>短小蛇根草(ophiorrhizapumila)<400>2metglyserileaspalaasnasnileasnglyalatyrproserser151015provalalaprophelysproleuaspproglugluphearglysgln202530alahisvalmetvalasppheilealaasptyrtyrlysasnileglu354045lystyrprovalleuserglnvalgluproglytyrleuargthrarg505560leuprogluthralaprotyrleuprogluprophegluasnileleu65707580glnaspileglnlysaspileileproglymetthrasntrpleuser859095proasnphephealatyrpheproalathrvalserseralaalaphe100105110leuglyglumetleucysthrglypheasnservalglypheasntrp115120125leualaserproalaalathrgluleuglumetvalvalileasptrp130135140leualaasnmetleulysleuproasnserphemetpheserglythr145150155160glyglyglyvalleuglnglythrthrserglualaileleucysthr165170175leuilealaserargaspargalapheglulysileglyvalgluasn180185190ileglylysleuvalvaltyralaseraspglnthrhisserphephe195200205hislysthrcyslysleualaglyilepheprocysasnilelysile210215220ileprothrthrserglualaasnphesermetserprohisalaleu225230235240arglysglnilegluseraspvalalaglyglyleuvalproilephe245250255leucysalathrileglythrthrserthrthralaileaspproval260265270serglyleualalysvalalaasnasppheservaltrpilehisval275280285aspalaalatyralaglyseralacysilecysprogluphearglys290295300tyrleuaspglyvalgluleuvalaspserleuserleuserprohis305310315320lystrpleuleucystyrleuaspcyscyscysleutrpvallyslys325330335proalaleumetvallysalaleuserthrasnproglutyrleuarg340345350asnlysargserglupheaspservalvalaspphelysasptrpgln355360365ileglythrglyargargpheargalaleuargleutrpleuilemet370375380argsertyrglyvalalaasnleuglnarghisileargseraspval385390395400glumetalalysmetphegluglyphevallysseraspproargphe405410415gluvalvalvalproargthrpheserleuvalcyspheargleuasn420425430propheglyargserasnasnalathrtyrvalgluleuleuasnglu435440445lysleuleuaspleuvalasnserthrglyargalatyrmetthrhis450455460thrlysvalglyglyvaltyrmetleuargphealavalglyalathr465470475480leuthrglugluarghisvalasnalaalatrpgluleuilelysglu485490495cysthralaalaleuleulysgluasnhisglncysileaspile500505510<210>3<211>5769<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaggaatggtgtggccgattaatcataaatatgaaaaataattgttgcatcacccgccaa60tgcgtggcttaatgcacatcaaattgtgagcggataacaatttgatgtgctagcgcatat120ccagtgtagtaaggcaagtcccttcaagagttatcgttgatacccctcgtagtgcacatt180cctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacacttaattatt240aagaggtaatacaccatgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcacatgcaagtttca300gttgaaaccactcaaggccttggccgccgtgtaacgattactatcgctgctgacagcatc360gagaccgctgttaaaagcgagctggtcaacgttgcgaaaaaagtacgtattgacggcttc420cgcaagggcaaagtgccaatgaatatcgttgctcagcgttatggcgcgtctgtacgccag480gacgttctgggtgacctgatgagccgtaacttcattgacgccatcattaaagaaaaaatc540aatccggctggcgcaccgacttatgttccgggcgaatacaagctgggtgaagacttcact600tactctgtagagtttgaagtttatccggaagttgaactgcaaggtctggaagcgatcgaa660gttgaaaaaccgatcgttgaagtgaccgacgctgacgttgacggcatgctggatactctg720cgtaaacagcaggcgacctggaaagaaaaagacggcgctgttgaagcagaagaccgcgtg780accatcgacttcaccggttctgtagacggcgaagagttcgaaggcggtaaagcgtctgat840ttcgtactggcgatgggccagggtcgtatgatcccgggctttgaagacggtatcaaaggc900cacaaagctggcgaagagttcaccatcgacgtgaccttcccggaagaataccacgcagaa960aacctgaaaggtaaagcagcgaaattcgctatcaacctgaagaaagttgaagagcgtgaa1020ctgccggaactgaccgcagagttcatcaaacgtttcggcgttgaagatggttccgtagaa1080ggtctgcgcgctgaagtgcgtaaaaacatggagcgcgagctgaagagcgccatccgtaac1140cgcgttaagtctcaggcgatcgaaggtctggtaaaagctaacgaca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