一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法与流程

本发明属于水产养殖技术领域，尤其是一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法。

背景技术：

罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，是一种大型淡水虾，原产于东南亚。它生长快、食性广、肉质营养成份好，并且养殖周期短。自本世纪60年代开始人工养殖罗氏沼虾以来，发展迅速，现东南亚国家和其他一些地区养殖此虾比较普遍。

随着生活质量的提高，消费者对蛋白质的需求量也越来越高。水产品因其高蛋白低脂肪，逐渐成为人们的首选。市面上优良水产品的价格高，供应能力有限，故而水产品的数量和质量都需要一定程度的提升。提升品质的重要手段就是分子育种，动物的分子育种基本上都要进行胚胎操作，并且基于基因编辑技术的定向育种需要大量的离体胚胎进行实验操作，现在有关于罗氏沼虾的离体培养技术较少。

现有的一些离体养殖技术不够成熟，离体胚胎孵化率低，离体操作后胚胎发育率几乎为零。

通过检索，发现如下与本发明专利申请相关的期刊与专利公开文献：

1、罗氏沼虾胚胎发育的研究:ⅰ.胚胎外部结构形态发生(分类号：q954.4)，包括：罗氏沼虾的胚胎发育过程可准确地分为卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、前溞状幼体期和溞状幼体期七个时期。在28℃水温条件下,胚胎发育的全过程约需480小时。

2、一种澳洲淡水龙虾离体孵化方法(cn105557590b)，包括：(1)在取得受精卵后，先将受精卵清洗，后放入离体孵化盘中进行人工孵化。(2)离体孵化盘配备和水体相配的前置过滤桶、臭氧消毒机、发热管及增氧机及隔离网，受精卵放在隔离网上，离体孵化盘底部设气泡石制造水流，令受精卵保持微微活动，臭氧机用时间制控制定期消毒，受精卵经过约40-50天孵化便可孵出仔虾。采用本发明所述的离体孵化方法，受精卵的感染率可降至10％以下，孵化的成活率可达90％以上，大大提高了受精卵孵化的成活率，可以有效提高虾苗产量，具有显著的经济效益。

通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，该方法将罗氏沼虾的受精胚胎进行离体孵化，使之前由母虾直接抱卵孵化的带来的缺点减低，增加了罗氏沼虾离体培养的孵化率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，步骤如下：

⑴成虾养殖水的制备：由于罗氏沼虾为淡水虾，所以普通的罗氏沼成虾只需将用消过毒的水曝气三天以上即可放入成虾饲养；

⑵亲虾饲料的配制：其组成成分及重量份数如下：

海藻粉10-15份，小球藻10-15份，虾粉10-15份，鱼粉10-15份，益生菌5-10份，甲壳素1-2份，复合矿物质1-2份，复合维生素1-2份，小麦粉10-15份，菠菜10-15份，发酵玉米蛋白10-20份，将各原料混匀即得；

⑶罗氏沼虾亲虾的养殖：将成虾按每m³/10尾的数量放置在养殖缸中，用步骤⑴配制的养殖水养殖，用步骤⑵配制的亲虾饲料喂养成虾，待母虾抱卵；

⑷洗卵液的制备：在无菌环境下，将中性蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶以质量比1：1.5：1.2比例混合，然后加水配成质量浓度为1％的水溶液，即得洗卵液，洗卵液在4℃冰箱下保存；

⑸胚胎的离体方法：用洗卵液润湿干净的脱脂棉，将润湿的脱脂棉放在抱卵不超过10小时的现有亲虾需要脱卵的部位，停留1分钟，用孵化水将亲虾身上的卵冲下，低浓度高锰酸钾溶液消毒10秒，4℃环境下保存备用，整个过程中使用到的器材均消毒灭菌；

⑹孵化的方式：将保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞正处于的时期，拍照记录；将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10～15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的容器中，倒入配制好的孵化水，孵化水的添加量按5-10ml/卵的数量缓缓加入，在室温25±1℃下孵化24h后重新消毒换水并定时剔除坏卵即可。

而且，所述步骤⑸中孵化水的制备步骤如下：

准确量取盐度为10‰的过滤海水，灭菌，取出，冷却至室温；分别准确称取edta、pbs缓冲液、dmem，倒入灭菌后海水中，每1l灭菌后海水中加入5gedta、3mlpbs缓冲液、2gdmem，0.22μm滤膜过滤灭菌，即得孵化水；密封保存，并放置室温下备用。

而且，所述灭菌为放入高温高压灭菌锅内灭菌2h。

而且，每1lpbs缓冲液的制备如下：

称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml过滤海水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加过滤海水定容至1l。

而且，步骤⑸中配置好的孵化水使用期限不超过一个月。

而且，所述低浓度高锰酸钾溶液的配制步骤如下：

称取高锰酸钾试剂，然后加入蒸馏水，每1l蒸馏水中加入0.1mg高锰酸钾试剂，混匀，密封保存，即为配置好的低浓度高锰酸钾溶液。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法将罗氏沼虾的受精胚胎进行离体孵化，使之前由母虾直接抱卵孵化带来的缺点减低，增加了罗氏沼虾离体培养的孵化率，提高了罗氏沼虾破膜幼体的成活率，为产业上提供了良好的应用技术。

2、近代生物技术中，杂交育种已经十分成熟，想要更好地提高动物、植物的产量与品质，分子育种已经成为必要的技术。水生动物中能够开展离体胚胎培养的品种，可以成为甲壳类分子育种的备选品种。

3、本发明方法为罗氏沼虾离体受精以及胚胎操作提供了技术平台，为经济类甲壳动物的基因编辑提供必要的辅助技术。

4、本发明方法能为甲壳动物不同时期的胚胎干细胞获得提供前期必要技术。

5、本发明方法能为甲壳动物发育研究中的单细胞转录组测序蛋白组测序、代谢组测序等一些组学技术提供前期的必要技术。

6、本发明方法所使用的亲虾饲料在一定程度上可以使母虾抱卵的数量增加、质量提高，并使亲虾体质有了一定程度的提高。

7、本发明方法所使用的复合配方洗卵液可使亲虾的受精卵在一颗颗被剥离的同时，免受人工外力的影响。

8、本发明方法所使用的孵化水可使受精卵在孵化的同时免受水生微生物的干扰，从而提高了罗氏沼虾的离体孵化率

9、本发明方法操作简单易上手，没有太多的条件限制。

附图说明

图1为本发明中罗氏沼虾离体培养时连续记录的图片；其中，1.囊胚期:；2-3.原肠期；4.前无节幼体期；5-6.后无节幼体期；7-8.前状溞幼体期；9-11.膜内溞状幼体期；12.破膜幼体。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，步骤如下：

⑴成虾养殖水的制备：由于罗氏沼虾为淡水虾，所以普通的罗氏沼成虾只需将用消过毒的水曝气三天以上即可放入成虾饲养；

⑵亲虾饲料的配制：其组成成分及重量份数如下：

海藻粉10-15份，小球藻10-15份，虾粉10-15份，鱼粉10-15份，益生菌5-10份，甲壳素1-2份，复合矿物质1-2份，复合维生素1-2份，小麦粉10-15份，菠菜10-15份，发酵玉米蛋白10-20份，将各原料混匀即得；

⑶罗氏沼虾亲虾的养殖：将成虾按每m³/10尾的数量放置在养殖缸中，用步骤⑴配制的养殖水养殖，用步骤⑵配制的亲虾饲料喂养成虾，待母虾抱卵；

⑷洗卵液的制备：在无菌环境下，将中性蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶以质量比1：1.5：1.2比例混合，然后加水配成质量浓度为1％的水溶液，即得洗卵液，洗卵液在4℃冰箱下保存；

⑸胚胎的离体方法：用洗卵液润湿干净的脱脂棉，将润湿的脱脂棉放在刚刚抱卵(抱卵不超过10小时)的现有亲虾需要脱卵的部位，停留1分钟，用孵化水将亲虾身上的卵冲下，低浓度高锰酸钾溶液消毒10秒，4℃环境下保存备用，整个过程中使用到的器材均消毒灭菌；配制的洗卵液可以最大程度减少对亲虾以及所需受精卵的伤害，并且在不伤害亲虾的状态下使受精卵分离彻底。可以降低并防止水生生物和微生物的感染。

⑹孵化的方式：将保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞正处于的时期，拍照记录；将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10～15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的容器中，倒入配制好的孵化水，孵化水的添加量按5-10ml/卵的数量缓缓加入，在室温25±1℃下孵化24h后重新消毒换水并定时剔除坏卵即可。

较优地，所述步骤⑸中孵化水的制备步骤如下：

准确量取盐度为10‰的过滤海水，灭菌，取出，冷却至室温；分别准确称取edta、pbs缓冲液、dmem，倒入灭菌后海水中，每1l灭菌后海水中加入5gedta、3mlpbs缓冲液、2gdmem，0.22μm滤膜过滤灭菌，即得孵化水；密封保存，并放置室温下备用。

较优地，所述灭菌为放入高温高压灭菌锅内灭菌2h。

较优地，每1lpbs缓冲液的制备如下：

称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml过滤海水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加过滤海水定容至1l。

较优地，步骤⑸中配置好的孵化水使用期限不超过一个月。

较优地，所述低浓度高锰酸钾溶液的配制步骤如下：

称取高锰酸钾试剂，然后加入蒸馏水，每1l蒸馏水中加入0.1mg高锰酸钾试剂，混匀，密封保存，即为配置好的低浓度高锰酸钾溶液。

更具体地，相关制备及检测如下：

一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，步骤如下：

a.胚胎的离体方法：用洗卵液润湿干净的脱脂棉，将润湿的脱脂棉放在亲虾需要脱卵的部位，停留1分钟，用孵化水将亲虾身上的卵冲下，低浓度高锰酸钾消毒10秒，4℃环境下保存备用。

b.孵化的方式：将保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞所处于的时期，拍照记录。将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10-15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的100ml烧杯中，倒入配制好的孵化水。孵化水的量按10ml/(每颗卵)的数量缓缓加入。24小时之后，将受精卵用塑料吸管吸出，放入已经装有一定量的低浓度高锰酸钾溶液，静置10-15秒后，吸出。将烧杯用低浓度高锰酸钾溶液润洗，将吸出的已消过毒的受精卵放入润洗过的烧杯中。再按比例倒入孵化水，继续培养。每天观察一次，并在体视显微镜下照片记录，结果如图1所示。

记录结果:

a.囊胚期：第1-2天。

b.原肠期：第3-4天。

c.前无节幼体期：第5-8天。

d.后无节幼体期：第9-10天。

e.前溞状幼体期：第11-13天。

f.膜内溞状幼体期：第14-19天。

g.破膜幼体：第20天。

1、本发明离体操作的罗氏沼虾受精卵孵化率约为75％左右，比普通的罗氏沼虾受精卵的孵化率高约8％左右。本发明离体培养技术可在部分养殖环境下孵化率高达100％，且并无产生离体培养的一些不良状态。

2、在本发明专利的离体操作培养后的罗氏沼虾受精卵破膜天数和一般繁殖情况下的罗氏沼虾受精卵破膜天数相似，目前还未有其他有关罗氏沼虾受精卵离体培养的方法。

3、本发明离体操作前分离卵所使用的洗卵液可以最大程度保证受精卵分离完全且受精卵并未受洗卵液中化学成分的影响而影响发育。

4、运用本发明操作的罗氏沼虾亲虾喂养饲料配方可使罗氏沼虾亲虾的抱卵数目在一定程度上增加，且使罗氏沼虾亲虾的体质增强。

5、使用本发明的罗氏沼虾离体培养技术可以防止罗氏沼虾受精卵在孵化的过程中被水生微生物感染，从而避免受精卵变成坏卵。

6、本发明的离体培养技术操作简单，且对周围环境的条件没有太高要求。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。