本发明是关于免疫细胞领域，特别是关于一种靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用。
背景技术：
自然杀伤细胞(naturalkiller,nk细胞)是淋巴细胞的一个亚群。其在人体的免疫反应，无论是固有免疫还是特异性免疫中都发挥重要的作用。nk细胞可以在不经过初次免疫刺激和基因编辑的情况下，非mhc依赖性的发挥其免疫杀伤作用。nk细胞杀伤细胞的方式包括三种：①nk细胞释放的杀伤介质穿孔素和颗粒酶b使靶细胞凋亡，该过程需要nk细胞识别受体和靶细胞的直接接触方可实现；②nk细胞可以通过膜tnf家族分子(fasl、trial、mtnf等)与靶细胞膜配体结合诱导靶细胞凋亡，该过程不需要nk细胞受体与靶细胞的直接接触；③nk细胞还可以通过抗肿瘤抗体igg1和igg3作为桥梁，其fab段特异性识别肿瘤，fc段与nk细胞fcrγⅲa结合，产生依赖抗体的细胞介导的细胞毒作用(adcc)，该功能主要由cd16+nk细胞完成。
肿瘤微环境是由肿瘤细胞、多种基质细胞以及一系列的细胞因子和趋化因子组成。其中基质细胞包括成纤维细胞、肿瘤浸润的免疫细胞、内皮细胞、骨髓来源未成熟细胞等；细胞因子如tnf、vegf、il-1等；趋化因子如cxcl12、ccl27、ccl21等。细胞因子和趋化因子可以由肿瘤细胞分泌，亦可由基质细胞和上述浸润的免疫细胞产生。这些细胞和活性介质一同形成稳定的肿瘤免疫微环境，保护肿瘤组织逃脱机体的免疫监视并促进肿瘤进展。肿瘤细胞具有很强的异质性和增殖能力，而其在生长过程中的高突变率使我们在肿瘤治疗过程中，很难能够找到在多种肿瘤上或者在同一种肿瘤类型的不同病人之间稳定表达的特异性肿瘤抗原。
肿瘤微环境中具有低氧和酸化的特质，低氧和酸化是从良性肿瘤发展为转移生长的恶性肿瘤的重要原因。其中酸化对肿瘤的发展有三方面的影响：即增加对化疗的耐受性、增加突变率、增强浸润性。
骨髓(造血)微环境是指可以调控造血细胞增殖、分化和功能的网络系统，包括细胞成分和细胞产物。细胞成分有基质细胞和附属细胞，基质细胞有成纤维细胞、成骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞等；附属细胞主要为单核细胞和淋巴细胞、骨髓基质细胞可以产生和沉淀复杂的细胞外基质。
低ph值插入肽(phlowinsertionpeptide，phlip)可以在肿瘤微环境的酸性环境下可以发生从无规则卷曲到α螺旋的构象转化，而这种构象转化可以使其将自己插入到肿瘤的细胞膜上，c端在细胞内，n端在细胞外。这种在低ph值下的自组装已经被证明可以在多种实体瘤上有效的发生。
对于肿瘤和癌症治疗，早期会选择利用手术清除加以放疗或者化疗(紫杉醇等)的方式进行治疗；后来开始针对肿瘤特异性靶点完成靶向治疗，比如2004年美国fda批准的第一个抗肿瘤血管生成药物—安维汀以及2015年第三代肺癌药奥希替尼上市；近期人们开始了对调节人体免疫对肿瘤的治疗过程，在2018年诺贝尔医学奖颁给了美国的詹姆斯.艾利森和日本的本庶佑，以表彰他们在癌症免疫疗法(ctla-4、pd-1的发现)上做出的开创性工作。以及car-t技术应用到血液瘤的治疗中，但是均因各种原因最后的成效并没有那么令人满意，所以我们选择了对于肿瘤细胞杀伤更加具有潜力的nk细胞。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用，该靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段利用肿瘤微环境ph<7微酸环境的特点，给微环境中的肿瘤细胞以及其他基质细胞插入特异性的标记，可以吸引并结合到nk细胞的cd16分子上，由该标记特异性招募激活nk细胞的adcc功能，达到对肿瘤细胞的杀伤功能。
为实现上述目的，本发明提供了一种靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段，包括顺序串联的低ph纳米插入肽(phlip)、偶联剂、以及fc片段；其中，所述低ph纳米插入肽包括序列为seqidno.1的氨基酸序列或其变体，该低ph纳米插入肽可在微酸环境下，通过自卷曲插入到肿瘤细胞细胞膜上，起到靶向作用。
在本发明的一实施方式中，所述fc片段选自鼠源igg2a或igg2b的氨基酸片段，其中igg2a选自第93-330位氨基酸序列，如seqidno.2所示，igg2b选自第97-335位氨基酸序列，如seqidno.3所示。
在本发明的一实施方式中，所述偶联剂选为磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-smcc)，以连接低ph纳米插入肽和adcc诱导性fc片段。
在本发明的一实施方式中，所述靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段于ph值<7的环境中发挥作用。
本发明还提供了一种肿瘤标记系统，所述肿瘤标记系统包括上述靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段。
本发明还提供了一种靶向肿瘤治疗系统，所述靶向肿瘤治疗系统包括上述肿瘤标记系统。
本发明还提供了上述靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段在制备上述肿瘤标记系统中的应用。
本发明还提供了上述靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段或上述肿瘤标记系统在制备上述靶向肿瘤治疗系统中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用的靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段主要有三部分组成：、低ph纳米插入肽phlip、偶联剂sulfo-smcc和fc片段，该组合既能分别发挥功能，又能相互协调，提供有效的和安全的微环境插入分子；
(2)本发明采用了前沿的纳米肽段技术，并且合理利用了原本影响肿瘤的发展和治疗效果的肿瘤低氧和酸化特征，令其成为治疗的靶向条件，能够将目标分子特异性的插入到白血病骨髓肿瘤微环境的细胞中，给肿瘤带有特异性的标志，为靶向杀伤和治疗提供靶点，从而吸引免疫细胞(nk细胞)靶向攻击和杀伤；
(3)本发明所涉及的靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段通过调动自身免疫系统，对肿瘤进行杀伤和治疗，和已有的肿瘤靶向杀伤不同，该方法可以适用于所有肿瘤，包括实体瘤的治疗。
附图说明
图1a是根据本发明一实施方式的低ph纳米插入肽通过偶联剂与抗体连接的示意图；
图1b是根据本发明一实施方式的低ph纳米插入肽在低ph值下发生自卷曲从而插入到膜表面的示意图；
图2是根据本发明一实施方式的nk细胞发挥adcc作用的效果示意图；
图3是根据本发明一实施方式的肿瘤杀伤示意图；
图4是根据本发明一实施方式的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图；
图5a是根据本发明一实施方式的在微酸性环境中phlip-fc介导nk细胞对黑色素瘤细胞(b16)进行杀伤的检测图；
图5b是根据本发明一实施方式的在微酸性环境中phlip-fc介导nk细胞对小鼠乳腺癌细胞(4t1)进行杀伤的检测图；
图5c是根据本发明一实施方式的在微酸性环境中phlip-fc介导nk细胞对人源三阴性乳腺癌进行杀伤的检测图；
图6a是根据本发明一实施方式的phlip-fc分子对黑素瘤的抑制图；
图6b是根据本发明一实施方式的phlip-fc分子对乳腺癌的抑制图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。低ph纳米插入肽phlip是由上海淘普生物科技有限公司合成，鼠源的igg2a/b的fc段购买于北京义翘神州科技有限公司，序列如下：
低ph纳米插入肽phlip序列为在n端乙酰化的seqidno.1；
来自鼠源的igg2a的fc片段序列，序列从n-端到c-端如seqidno.2所示；
来自鼠源的igg2b的fc片段序列，序列从n-端到c-端如seqidno.3所示；
人源的cd16蛋白序列如seqidno.4所示；人源的rit(抗cd20)蛋白序列如seqidno.5所示。
下面通过优选实施例的方式对本发明所要求保护的靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段从结构重组、细胞膜插入能力、与人源cd16蛋白结合能力、体外nk细胞杀伤实验检测效果、以及动物实验方面进行详细论述。
实施例1
phlip-fc，phlip-rit构建以及用cy5.5或fitc标记cd16
1.1将phlip与偶联剂sulfo-smcc连接
分别配制4800nmolsulfo-smcc溶解到300μlpbs中，以及10nmol的fc片段溶解到200μlpbs中，将两溶液混匀到1.5mleppendorf离心管中室温轻柔摇晃2小时，在整个过程中控制ph＝7.4。然后将连接产物用pbs缓冲液预平衡的nap-5(gehealthcare,uk)的柱子纯化，得fc连接溶液。
1.2将连接好的fc片段与phlip连接
将溶解在pbs缓冲液中的总量为4800nmol的phlip，加入到上一步所得到的fc连接溶液中，室温下轻柔摇晃5小时诱导连接反应。最终得到的phlip-fc产物用pbs缓冲液预平衡过的nap-10(gehealthcare,uk)的柱子纯化过滤。同样的方法应用到igg3和rit的连接应用上。
1.3利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)检测fc/a，phlip-fc/a，fc/b，phlip-fc/b的分子质量(图4)。通过图4可知，fc/a片段的m/z为56780.7，连接了phlip后m/z值右偏，代表实现了phlip与fc/a片段的成功偶连；fc/b片段呈现类似的趋势。
1.4为了将fitc或者cy5.5标记到cd16分子上，将100nmolfitc(范博生物化学有限公司，中国)加入到人源充足的cd16(sinobiologicalinc.,china)溶液中，该cd16溶液是通过将10nmolcd16分子溶解到300μlpbs缓冲液中。该混合物在eppendorf离心管中以室温温和摇晃3小时诱导反应。最终得到的产物经过用pbs缓冲液预平衡的nap-5柱子纯化。
1.5通过串联质谱(ms/ms)检测sulfo-smcc对fc分子的修饰。为了追踪sulfo-smcc修饰的结合位点，利用胰蛋白酶(promage，usa)消化smcc-fc/a和smcc-fc/b。通过nano-lc-ltq-orbitrapxlms/ms系统分析消化的肽。通过proteomediscoverer软件(版本1.4.0.288，thermofischerscientific)分析ms数据。使用sequest搜索引擎在mus数据库中搜索第二个ms谱。将赖氨酸的磺基-smcc修饰，半胱氨酸的谷胱甘肽化或氧化以及甲硫氨酸的氧化设定为可变修饰。1.6通过表面等离子体共振成像(spri)检测应用检测和计算phlip-fc/a和phlip-fc/b。使用biacore8kspr生物传感器(gehealthcare)测量fc或phlip-fc分子与人源重组cd16(sinobiologicalinc，中国)的结合亲和力，以及rit或phlip-rit与人源重组cd16a(sinobiologicalinc，中国)的结合亲和力。以上所有人源cd16和人cd16a都按照使用手册说明与cm5传感器芯片表面连接。所有配体蛋白质在pbst缓冲液(ph6.8)中以连续2倍稀释，1000nm至31.25nm的范围点样。流速为30μl/min，缓冲液为pbst(0.01mmpbs加0.05％的tween20)。接触和解离时间分别为60秒和120秒。在每个样品用5mmnaoh之后进行蛋白质芯片的再生。对于fc，phlip-fc，rit和phlip-rit的每个浓度重复上述循环。结合反应连续记录为共振单位(ru)，自动减去背景结合。使用biacore8k评估软件(gehealthcare)使用1：1langmuir结合模型计算亲和常数(kd)。
实施例2
细胞转化以及转化条件检测
2.1将重组phlip-fc/a和phlip-fc/b转化到细胞表面。
2.1.1b16/f10为小鼠黑色素瘤细胞系，购于国家科学技术细胞实验平台(中国)。培养于rpmi-1640细胞培养基中，加入10％fbs(wisent,canada)，培养于37℃，5％co2细胞培养箱中。
2.1.2细胞培养在35mm的硼硅酸盐室的盖玻片(nunc,usa)上，然后将phlip-fc/a与phlip-fc/b和b16/f10细胞分别在ph＝6.8和7.4的环境下共培养诱导4个小时，然后将cy5.5标记的人源重组cd16分子加入进去，并共培养诱导1小时。在此过程中溶液的ph值一直分别保存。
2.1.3对盖玻片上的细胞用hoechst33342(invitrogen,usa)进行核染色，利用蔡司lsm710共聚焦显微镜(carlzeiss,germany)对细胞进行观察。
2.1.4k562为人慢性髓系白血病细胞，购于国家科学技术细胞实验平台(中国)。培养于rpmi-1640细胞培养基中，加入10％fbs(wisent,canada)，培养于37℃，5％co2细胞培养箱中。
2.1.5mda-mb-231为人乳腺癌细胞系，购于国家科学技术细胞实验平台(中国)。培养于dmem细胞培养基中，加入10％fbs(wisent,canada)，培养于37℃，5％co2细胞培养箱中。
在ph＝6.8的细胞培养环境下，将rit和phlip-rit分别加入到mda-mb-231细胞培养体系中4小时，然后将cy5.5标记的人源重组的cd16分子加入培养体系中培养1个小时。
之后按照同样的步骤用hoechst33342染色，并用共聚焦显微镜进行观察，并在此过程中保持ph＝6.8。
2.2流式细胞术进行浓度依赖型动力学研究
2.2.1将不同浓度(0，0.1，0.5，1，2.5，5，10μg/ml)的phlip-fc/a或phlip-fc/b加入到24孔板中，每孔铺1×105个b16/f10细胞，培养在400μl的ph＝6.8的培养基中5小时。
2.2.2细胞用ph＝6.8的pbs清洗3次。
2.2.3更换为20μg/ml的fitc标记的人源重组cd16(400μl)诱导1个小时。
2.2.4细胞用ph＝6.8的pbs清洗3次。
2.2.5用ph＝6.8的pbs重悬用于流式细胞检测，每个样品检测3次。
2.3流式细胞术进行时间依赖型动力学研究
2.3.1将同一浓度(2.5μg/ml)的phlip-fc/a或phlip-fc/b加入到ph＝6.8的24孔细胞培养皿中，每孔铺1×105个b16/f10细胞，400μl培养体系，分别作用不同的时间(5，10，30，60，120，240和480分钟)。
2.3.2细胞用ph＝6.8的pbs清洗3次。
2.3.3更换为20μg/ml的fitc标记的人源重组cd16(400μl)诱导1个小时。
2.3.4细胞用ph＝6.8的pbs清洗3次。
2.3.5用ph＝6.8的pbs重悬用于流式细胞检测，每个样品检测3次。
实施例3
体外细胞毒性检测
3.1根据cytotox-glotm细胞毒性测定试剂盒(promega，madison,wi,美国)的使用说明书检测adcc功能。
3.2用外周血分离试剂盒(miltenyi，auburn，加拿大)分离小鼠脾脏的nk细胞，且分离纯度达到90％以上。这些nk细胞可以作为效应细胞，b16/f10肿瘤细胞为靶细胞。
3.3将2×104个b16/f10肿瘤细胞培养在96孔板中，并用100μlphlip-fc(2.5μg/ml)(ph＝6.8或7.4)培养2-4小时
3.4按照效应细胞：靶细胞＝1：1的比例，将2×104个nk细胞加入到培养体系中诱导培养4个小时。
3.5用多模板读卡器(perkinelmer，美国)检测荧光值。测定乳酸脱氢酶(ldh)释放，并在根据下式校正背景吸光度值后计算细胞毒性百分比：
3.6以mda-mb-231为靶细胞，nk细胞作为效应细胞。nk细胞从人外周血(pbmc)利用淋巴细胞分离培养基(corning，美国)按照说明书分离出来，之后用macsnk细胞分离试剂盒纯化分离出来的nk细胞至纯度大于90％。
3.7将2×104mda-mb-231细胞铺在96孔板中，并用100μlphlip-rit(2.5μg/ml)(ph6.8或7.4)培养2-4小时。
3.8按照效应细胞：靶细胞＝1：1的比例，将2×104个nk细胞加入到培养体系中诱导培养4小时。
将此phlip-fc分子分别在微酸性和中性条件下与肿瘤细胞孵育，随后加入nk细胞。在微酸性环境中，phlip-fc可以有效介导nk细胞对黑色素瘤细胞(b16)进行杀伤(图5a)。在微酸性环境中，phlip-fc可以有效介导nk细胞对小鼠乳腺癌细胞(4t1)进行杀伤(图5b)。此外，研究团队证明phlip-rit可以介导人源nk细胞对人源三阴性乳腺癌进行杀伤(图5c)，说明phlip修饰的fc或抗体具有较好的临床应用前景。
实施例4.动物体内实验及检测
4.1动物实验研究以及免疫组化
4.1.1对于b16/f10黑素瘤的原位小鼠模型，在接种4天后开始治疗，此时肿瘤体积达到约50mm3。给予第一次治疗的那天定义为第0天。用pbs，fc/a+phlip，phlip-fc/a，phlip-fc/b或phlip-igg3(n＝6)给予(i.v.)小鼠。phlip-fc的治疗剂量(相似摩尔剂量)是指小鼠模型中使用的利妥昔单抗(rit)的剂量(500μg/kg)。计算方式如下：
rit的分子量(mw)：～150kda；phlip-fc的mw:～60kda；
rit的摩尔剂量＝(rit的剂量)/(rit的mw)＝500μg/kg/150kda＝3.33nmol/kg
4.1.2选择～2.5nmol/kg摩尔剂量(等于150μg/kg)的phlip-fc。每2天给予phlip-fc，总共进行4次注射。
通过数字卡尺测量肿瘤大小，并且通过公式(l×w2)/2计算肿瘤体积，其中l是最长的，w是肿瘤直径中最短的(mm)。相对肿瘤体积(rtv)等于给定时间点的肿瘤体积除以治疗开始前的肿瘤体积。出于伦理原因，当植入的肿瘤体积达到1000mm3时，将动物处死。
对于4t1乳腺癌模型和k562白血病模型，在植入5天后开始治疗，此时肿瘤体积达到约50mm3。给予第一次治疗的那天定义为第0天。其他条件与b16/f10模型相同，但给予7次注射。对于转移肿瘤模型，在肿瘤细胞注射4天后开始治疗(n＝6)。两周后(每2天给予150μg/kg剂量，总共7次注射)治疗，通过腹膜内注射给予荧光素酶进行体内成像(每组n＝3)；解剖荷瘤动物的肺用于组织切片(每组n＝3)。
4.1.3在剂量依赖性治疗效果评估中，在k562骨髓肿瘤模型(n＝6)中测试50μg/kg，150μg/kg和450μg/kg的phlip-fc/a，并且其他步骤与上述相同。
4.1.4为了评估肿瘤中的细胞凋亡，通过末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记试剂盒(tunel，keygenbiotech，南京，中国)，按照说明书的方式对肿瘤组织切片进行染色。检查两个单独载玻片上的总共100个细胞核以获得定量结果。
4.1.5对于免疫组织化学染色，将肿瘤切片(6μm)脱石蜡，再水化，并与0.3％h2o2的甲醇溶液一起温育。在10mmol/l柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中于95℃抗原修复15分钟后，用5％山羊血清/pbs封闭切片1小时，并与一抗孵育(小鼠单克隆抗体与增殖细胞核抗原(pcna))抗体(1：10,000，abcam，uk)或兔多克隆抗crtam抗体(1：300，abcam，uk)在4℃过夜，然后在室温下生物素化二抗1小时，辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白在37℃30分钟。dab(r&dsystem，usa)用于显色，切片用苏木精复染。数据由imagej分析。
通过图6a以及图6b可以发现，在体内实验中，phlip-fc分子实现了对多种肿瘤(皮下黑色素瘤、原位乳腺癌)的抑制。
4.2血液检测，体内成像以及生物分布检测
4.2.1对于cy7标记的fc/a和phlip-fc/a偶联，遵循我们先前的工作程序。将cy7mononhs(fanbobiochemicals，beijing，china)0.1mg加入到fc/a或phlip-fc/pbs溶液(100μl，0.5mg/ml，ph7.4)中。将混合物在1.0mleppendorf管中在室温下温育3小时，同时轻轻摇动。缀合的fc/a和phlip-fc/a通过用pbs缓冲液预平衡的nap-5柱(gehealthcare，uk)纯化。
4.2.2为了评价体内血液清除率，将fc-cy7和phlip-fc/a-cy7静脉注射到携带4t1肿瘤的balb/c小鼠中。在不同的时间点，通过体内成像系统(ivis)(perkinelmerinc.，usa)收集血液并检测荧光信号。激发光的波长为740-760nm，发射波长为780nm。
4.2.3为了检测每种制剂的体内成像和生物分布，分别向携带皮下4t1肿瘤的裸鼠静脉内注射fc-cy7和phlip-f/a-cy7.用ivis扫描小鼠。在12小时，切除器官和肿瘤用于离体成像。
4.3免疫反应研究
4.3.1用phlip(20μg/kg)免疫健康balb/c鼠(雌性，n＝6)4周(每周一次)。在第5周，通过眶后静脉穿刺从这些小鼠收集全血，并在离心后收集血清。根据先前的研究，使用间接elisa测定法测量抗phlipigg滴度。在酶标仪上在od450下测量吸光度。
4.3.2为了评估phlip-fc的免疫应答，用phlip-fc/a预处理两组健康balb/c小鼠(雌性，每组n＝6)4周(150μg/kg，每周一次注射))在肿瘤植入前，然后在4t1乳腺肿瘤模型中以相同方式进行治疗程序(一组用pbs处理，另一组用phlip-fc/a处理)。在前4周，对照组(未预处理组)用pbs给药。
4.4生物安全性检测
4.4.1用pbs，fc/a+phlip，phlip-fc/a，phlip-fc/b或phlip-igg3(n)给予健康的balb/c小鼠(雌性，6周龄，15-17g体重)(iv)8只每组)。每两天50μg/kg的剂量，总共7次注射。收集血清用于生化测试(n＝4)并固定器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)，切片并进行h&e染色以研究器官形态的潜在变化(n＝4)切片来自不同组别的同一器官。
4.4.2为了分析每次制剂注射后的急性免疫反应，用pbs，fc/a+phlip，phlip-fc/a健康的balb/c小鼠(雌性，6周龄，15-17g体重)(iv)，phlip-fc/b或phlip-igg3(n＝4)(剂量：150μg/kg)。6小时和24小时后，白细胞介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-β水平升高。用elisa试剂盒(em1350和em0350，solarbio，中国)测定血清中的(tnf-α)。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110>北京双赢科创生物科技有限公司
中国科学院生物物理研究所
<120>靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用
<130>p191135dd1f
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
alacysgluglnasnproiletyrtrpalaargtyralaasptrpleu
151015
phethrthrproleuleuleuleuaspleualaleuleuvalaspala
202530
aspgluglythr
35
<210>2
<211>233
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gluproargglyprothrilelysprocysproprocyslyscyspro
151015
alaproasnleuleuglyglyproservalpheilepheproprolys
202530
ilelysaspvalleumetileserleuserproilevalthrcysval
354045
valvalaspvalsergluaspaspproaspvalglnilesertrpphe
505560
valasnasnvalgluvalhisthralaglnthrglnthrhisargglu
65707580
asptyrasnserthrleuargvalvalseralaleuproileglnhis
859095
glnasptrpmetserglylysgluphelyscyslysvalasnasnlys
100105110
aspleuproalaproilegluargthrileserlysprolysglyser
115120125
valargalaproglnvaltyrvalleuproproproglugluglumet
130135140
thrlyslysglnvalthrleuthrcysmetvalthraspphemetpro
145150155160
gluaspiletyrvalglutrpthrasnasnglylysthrgluleuasn
165170175
tyrlysasnthrgluprovalleuaspseraspglysertyrphemet
180185190
tyrserlysleuargvalglulyslysasntrpvalgluargasnser
195200205
tyrsercysservalvalhisgluglyleuhisasnhishisthrthr
210215220
lysserpheserargthrproglylys
225230
<210>3
<211>239
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gluproserglyproileserthrileasnprocysproprocyslys
151015
glucyshislyscysproalaproasnleugluglyglyproserval
202530
pheilepheproproasnilelysaspvalleumetileserleuthr
354045
prolysvalthrcysvalvalvalaspvalsergluaspaspproasp
505560
valglnilesertrpphevalasnasnvalgluvalhisthralagln
65707580
thrglnthrhisarggluasptyrasnserthrileargvalvalser
859095
thrleuproileglnhisglnasptrpmetserglylysgluphelys
100105110
cyslysvalasnasnlysaspleuproserproilegluargthrile
115120125
serlysilelysglyleuvalargalaproglnvaltyrileleupro
130135140
proproalagluglnleuserarglysaspvalserleuthrcysleu
145150155160
valvalglypheasnproglyaspileservalglutrpthrserasn
165170175
glyhisthrglugluasntyrlysaspthralaprovalleuaspser
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aspglysertyrpheiletyrserlysleuasnmetlysthrserlys
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trpglulysthraspserphesercysasnvalarghisgluglyleu
210215220
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