一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用。更具体地，本发明的肿瘤特异性靶向多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明的多肽与聚酰胺-胺型树枝状高分子纳米材料连接后在体外可以很好的与多种肿瘤细胞结合，作为靶向剂将在肿瘤的诊断显像和靶向治疗方面有广阔的应用。
【专利说明】一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用
[0001]本申请是申请号为201310258476.0，申请日为2013年6月26日，发明名称为“一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用”的中国专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于蛋白质多肽【技术领域】，涉及噬菌体展示的多肽及其应用。更具体的说是一种可与肿瘤细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003]肿瘤在世界上是最常发生的疾病之一，有许多先进国家，其中肺癌的死亡率居所有癌病死亡率的第一位。目前肺癌的治疗主要有手术、放疗和化疗等手段。手术和放射性治疗都是局部治疗方式，无法控制晚期的转移，而且许多病人由于体质较弱，无法接受此类治疗；而化疗虽然有一些疗效不错的化疗药物，但由于都缺乏肿瘤细胞特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤大量的骨髓及其它增值旺盛的细胞，都具有较强的副作用，并且多次化疗之后往往会产生耐药性，大大降低药物疗效。所以目前对于肿瘤的靶向治疗是肿瘤治疗的热点。
[0004]卩遼菌体展不技术(ScottJK, Smith GP Searching for peptide ligands withan epitope library.Science.1990 ；249 (4967):386-90)是一项研究生物活性妝、妝类药物筛选和抗体制备等非常有用的手段。近年发展起来的噬菌体随机肽库体内筛选方法(Pasqualini R, Ruoslahti E.0rgan targeting in vivo using phage display peptidelibraries.Nature.1996 ；380(6572):364-6)，是寻找与组织，器官特异性结合多肽的有效手段。此方法可在受体分子 尚不清楚的情况下，以受体天然存在的环境组织器官为配基，利用噬菌体短肽的抗原特异性，寻找未知的靶分子，确定其结构域。具有特异结合活体组织、器官并在体内具有稳定性好、特异性高等优点。这一方法可以在靶点分子机理未知的情况下直接筛选特异结合的配体，缩短了研究周期。而且筛选与治疗在相同条件下进行，避免了体外筛选得到的配体体内实验无效或活性低的缺点，最大程度保证了筛选到的短肽的靶向特异性。目前国际上已经通过噬菌体体内筛选技术成功得到了几组特异与小鼠脑、肾部位血管和肿瘤血管结合的小肽，而且将此小肽与阿霉素和肿瘤坏死因子TNF-α偶联后，在小鼠肿瘤模型中起到了良好的抗肿瘤作用，详见Scott JK, Smith GP Searching for peptideligands with an epitope library.Science.1990 ；249 (4967):386-90 ；PasqualiniR, Ruoslahti E.0rgan targeting in vivo using phage display peptide libraries.Nature.1996 ；380 (6572):364-6 ；Zhang, L.；Hoffman, J.A.；Ruoslahti, E.，Molec μ Iarprofiling of heart endothelial cells.Circulation2005,112, (11), 1601-11。
[0005]中国专利申请号01126429.2公开了一种抗小细胞肺癌多肽混合物一共有三种形式:SPDD多肽混合物，SPDD结构趋同化组合的多肽文库的多肽混合物，前两者混合的多肽混合物。作为拮抗剂，用于制备抗小细胞肺癌的多肽药物。
[0006]中国专利申请号03158296.6公开了一种具有抗肿瘤作用的多肽，由I个Ala、l个6111、1个617、1个1^11、2个？1'0、1个1111'、1个了71'组成的八肽，分子量为846.9，可应用NDlOO来治疗肿瘤。
[0007]中国专利申请号200710066323.0公开了一种具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法。它的氨基酸序列结构为:CASPSGALRSC ；或CFPVPGHDLVC ；或CFSVPGHDIVC ；或CTPMSLSLSEC ;或CYTYPLGffHIC人工合成具有肿瘤靶向性的多肽。
[0008]中国专利申请号02149419.3公开了一种癌胚抗原特异性结合肽及其与TNF-α的融合蛋白主要是通过噬菌体随机展示肽库筛选出与癌胚抗原特异性结合的结合肽，这些结合肽可以用作癌胚抗原阳性肿瘤导向治疗药物的载体。
【发明内容】
[0009]本发明通过噬菌体随机多肽文库体内筛选与肺癌组织特异结合的多肽，制备肽类肺癌早期诊断和治疗试剂。该多肽与生物高分子材料聚乳酸包合的抗肿瘤药物多西紫杉醇链接后，制备的新型靶向抗肿瘤药物。本发明的多肽可以很好地靶向肿瘤细胞，而且将其作为靶向剂可以对肿瘤显像和治疗起到积极。
[0010]本发明的多肽与现有技术相比所具有的有益效果在于:本发明筛选得到的多肽不但具有传统抗体分子优点，而且分子量小、穿透力强、容易到达肿瘤组织、具有良好的肿瘤靶向作用、诊断肿瘤更加灵敏，可用于制备诊断肿瘤的试剂盒，以及治疗肿瘤的药物和携带肿瘤药物的靶向剂方面的应用。 [0011]本发明提供了一种肿瘤特异性靶向多肽，所述多肽选自如氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽。
[0012]优选地，所述肿瘤选自子宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞或人神经胶质瘤细胞。
[0013]另一方面，本发明提供了编码本发明所述的肿瘤特异性靶向多肽的核苷酸序列，所示核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列，或与其互补的序列。
[0014]进一步地，本发明提供了根据本发明的肿瘤特异性靶向多肽在制备肿瘤早期诊断和治疗试剂中的用途。
[0015]进一步地，本发明提供了根据本发明的肿瘤特异性靶向多肽在制备作为肿瘤靶向剂药物方面的用途。
[0016]另一方面，本发明提供了根据本发明所述的肿瘤特异性靶向多肽，与生物高分子材料聚乳酸连接，在制备肿瘤早期诊断和治疗试剂中的用途。优选地，所述的生物高分子材料为纳米材料。更优选地，所述的生物高分子材料聚乳酸包合抗肿瘤药物。更优选地，所述抗肿瘤药物是多西紫杉醇。
[0017]另一方面，本发明提供了一种新型靶向抗肿瘤药物，其包括如根据本发明所述的肿瘤特异性靶向多肽、生物高分子材料、以及抗肿瘤药物。
[0018]本发明的上述目的是通过如下的方法予以实现:
[0019]方法:结果通过三轮筛选获得了七肽噬菌体多肽，该多肽与生物高分子材料聚乳酸包合的抗肿瘤药物多西紫杉醇链接后，制备的新型靶向抗肿瘤药物。结论:该多肽可以很好的靶向与肿瘤细胞，将其作为靶向剂可以对肿瘤显像和治疗起到积极的作用。特别是对子宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞和人神经胶质瘤细胞将其作为靶向剂可以对肿瘤的诊断显像和靶向治疗将会有广阔的应用。[0020]本发明公开的肿瘤特异性靶向多肽，其氨基酸序列为LPLTPLP和CVKTPAQSC。
[0021]编码的核苷酸序列分别为CTGCCGTTGACTCCGCTTCCG和TGTGTGAAGACGCCGGCTCAGTCGTGC。
[0022]本发明进一步公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肽类肿瘤早期诊断和治疗试剂方面的应用。特别是作为肿瘤靶向剂药物方面的应用。
[0023]本发明所述的肿瘤特异性靶向多肽的应用方法是:将该多肽与生物高分子材料聚乳酸包合的抗肿瘤药物多西紫杉醇链接后，制备的新型靶向抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1表示各治疗组动物体重变化。CON为对照组，DTX为常规药物组，NDTX为纳米制剂组，TNDTX为靶向肽纳米制剂高剂量组，TNDTX-L为靶向肽纳米制剂低剂量组。
[0025]图2表示各治疗组瘤体解剖。
[0026]图3A表示各治疗组相对肿瘤体积变化；*p〈0.05，与模型组比较；#p〈0.05，与常规药物组比较。
[0027]图3B表示28天瘤体重量。CON为对照组，DTX为常规药物组，NDTX为纳米制剂组，TNDTX为靶向肽纳米制剂高剂量组，TNDTX-L为靶向肽纳米制剂低剂量组。ap〈0.05，与对照组比较；bp〈0.05 ;与常规药物组比较；ep〈0.05，与纳米药物组比较。
[0028]图4表示对照组(CON)与常规药物多西紫杉醇组(DTX)肝脏HE染色。上图示正常裸鼠肝脏，中图为CON组，下图为DTX组，右图为左图红框指示放大区域。左图标尺表示500 μ m,右图标尺表示200 μ m。
[0029]图5表示纳米药物组与靶向纳米药物组组肝脏HE染色。上图为纳米药物组(NDTX)，中图为靶向纳米药物低剂量组(TNDTX-L)，下图为靶向纳米药物高剂量组(TNDTX-H),右图为左图红框指示放大区域。左图标尺表示500 μ m,右图标尺表示200 μ m。
[0030]图6表示给药后各组裸鼠血浆AFP含量。*P〈0.05与CON组相比；#P〈0.05与DTX组相比，$Ρ〈0.05与NDTX相比。
[0031]图7表示给药后各组裸鼠血浆GPT含量。*Ρ〈0.05与CON组相比；#Ρ〈0.05与DTX组相比，$Ρ〈0.05与NDTX相比。
[0032]图8表示给药后各组裸鼠血浆GOT含量。*Ρ〈0.05与CON组相比；#Ρ〈0.05与DTX组相比，$Ρ〈0.05与NDTX相比。
【具体实施方式】
[0033]为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的环状肽和线性七肽的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
[0034]噬菌体展示体内筛选多肽
[0035]一、人Α549非小细胞肺癌裸鼠模型的建立
[0036](I)取四周龄Balb/C雌性裸鼠(购于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心)，放入SPF级动物房饲养。
[0037] (2)培养人非小细胞肺癌NCI A549，取对数生长期肺癌细胞株，胰酶常规消化，调整细胞浓度为IxlO7个/ml，取200 μ I即2χ106个细胞接种于每只裸鼠的前肢腋下皮下，观察细胞接种后的生长状况，大约5-6天后可见瘤块，待两周时肿瘤直径大小约为0.3~0.5cm，可做体内噬菌体筛选实验。
[0038]二、噬菌体展示多肽文库小鼠体内的筛选
[0039](I)E.coli ER2738 的培养
[0040]以无菌操作技术从ER2738大肠杆菌(New England Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库试剂盒自带)的甘油冻存物中挑取一接种环，划线法接种于四环素抗性的LB平板上，37°C培养24h，待平板上可见白色透亮的菌斑形成后，将基本培养平板至于4°C保存。
[0041]平板上挑取E.coli ER2738单菌落接种于5mlLB培养液中，37°C 225转振荡培养至对数生长中期(0D_约为0.5)。(做动物实验前一天晚上接种)。
[0042](2)靶向噬菌体的筛选
[0043]I)准备100 μ g/ml的革巴分子溶液(溶于0.1M pH8.6的NaHCO3)。
[0044]2)每板加入1.5ml上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润(小心不要使溶液溅出)。 [0045]3)在增湿容器中4°C轻微震荡，孵育过夜。
[0046]4)第二天，挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于IOml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20ml LB液体培养基，37°C剧烈震
荡培养。
[0047]5)倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板加满封阻液，4°C作用至少lhr。
[0048]6)按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1% [v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液。
[0049]7)用Iml的TBST缓冲液稀释2 X IO11的噬菌体(即10 μ I的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10_60min。
[0050]8)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。
[0051]9)按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。
[0052]10)根据所研究的分子间相互作用，用Iml适当的洗脱缓冲液0.2M甘氨酸-HCl (pH2.2)、lmg/ml BSA来分离已结合的分子:温和摇动>10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μ IlM Tris-HCl (pH9.1)中和上述洗脱液。
[0053]11)按上述常规M13方法中的程序测定少量(I μ I)洗脱物的滴度。噬菌体滴度测定方法:
[0054]①接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD6c?~0.5)。
[0055]②细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45°C备用。
[0056]③37°C预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
[0057]④在LB中准备20倍系列稀释的噬菌体。
[0058]建议稀释范围:扩增的噬菌体培养物上清=IO8-1O11 ;未扩增的淘选洗脱物:IO1-1O'
[0059]⑤当菌体培养物达对数中期，分成200μ I等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
[0060]⑥每管加入10 μ I不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育l_5min。
[0061]⑦将感染细胞加入45°C预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
[0062]⑧待平板冷却5min后，倒置于37°C培养过夜。
[0063]⑨检查平板，计数有大约IO2个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μ I噬菌体的空斑形成单位(Pfu)滴度。
[0064]12)剩余洗脱物应当被扩增:将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37°C剧烈摇动培养4.5hr。
[0065]13)将培养物转入一离心管中，然后，4°C 10，OOOrpm离心10min。上清液转入另一
离心管中，再离心。
[0066]14)将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4°C沉淀过夜。
[0067]15) 40C 10，OOOrpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清 液。
[0068]16)沉淀物重悬于Iml TBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀。
[0069]17)上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15_60mino
[0070]4°C离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。
[0071]18)沉淀物重悬于200 μ I TBS, 0.02% NaN3中。离心lmin，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
[0072]19)分别稀释IO6-1Oiq测定噬菌体滴度。取10npfu作为第二次筛选的噬菌体。
[0073]重复以上操作,进行三轮筛选。
[0074](3)噬菌体DNA的提取纯化及其序列测定
[0075]I)按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 μ I含噬菌体上清转入一
新鲜离心管。
[0076]2)加 200 μ I PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置 IOmin。
[0077]3)离心10min,弃上清液。
[0078]4)短暂离心，小心吸去残余上清。
[0079]5)沉淀物彻底重悬于100 μ I碘化物缓冲液中，加入250 μ I乙醇。室温温育IOmin0短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
[0080]6)离心10min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
[0081]7)沉淀重悬于 30 μ I TE [IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)，ImM EDTA]中。
[0082]8)取5μ I的上述模板溶液，用试剂盒自带的-96引物进行测序。
[0083]样品送上海生工进行测序。
[0084]三、环肽序列的建立
[0085]根据上述测序结果，确定环肽噬菌体序列为:TGTGTGAAGACGCCGGCTCAGTCGTGC。根据DNA序列可以推导出外源插入的环肽蛋白序列为:CVKTPAQSC，通过两个半胱氨酸的二硫键交联成环形七肽，环状多肽的结合主要是靠环形内的多肽与蛋白结合的，为了后续实验方便进行同位素标记，在环形多肽的末端加了一个酪氨酸，为了能够更好的与载体连接，将左侧末端的丙氨酸换成了精氨酸。多肽序列委托北京中科亚光生物科技有限公司进行合成，对产品进行HPLC纯化和质谱鉴定，纯度98%以上，分子量与理论值相符。
[0086]四、线性七肽序列的建立
[0087]同样地， 申请人:根据上述相同的方法，确立了另一种出外源插入的蛋白序列为:线性七肽的氨基酸序列为LPLTPLP(SEQ ID NO:1)。
[0088]实施例1、获得的序列为LPLTPLP的线性七肽与抗肿瘤药物联合的体内抗肿瘤效果
[0089]本实例将该祀向肽与载药纳米制剂相连接构建祀向纳米制剂。
[0090]靶向纳米制剂的制备
[0091]将包合多西紫杉醇的载药纳米粒子重悬于MES缓冲溶液中，加入偶联缩合剂，室温孵育15min后,加入0.lmg/ml的祀向肽,所述祀向肽的序列为LPLTPLP,旋转搅拌反应2小时，15000rpm离心10min收集粒子，重悬洗涤三次后冷冻干燥即得靶向纳米制剂。
[0092]体内抗肿瘤治疗 实验研究
[0093]Balb/c裸鼠50只，适应环境后，于右侧腋窝处皮下注射A549细胞106个/只，2周后肿瘤开始形成，每3天测量瘤块的长径及短径并计算瘤体积(瘤体积=0.5x长径X短径2)，当瘤体积达到150mm3后，分别给予常规多西紫杉醇10mg/kg (常规药物组)、多西紫杉醇纳米制剂10mg/kg (纳米制剂组)、多西紫杉醇祀向肽纳米制剂10mg/kg (祀向肽纳米制剂高剂量组)、多西紫杉醇靶向肽纳米制剂5mg/kg(靶向纳肽米制剂低剂量组)及生理盐水(模型组)。以第一次给药时的瘤体积记作Vtl,每周给药一次，每周记录两次动物的体重及瘤体积情况，记瘤体积为Vt，计算相对肿瘤体积(VtZiVtl)表示药物对肿瘤生长的影响状况。
[0094]动物体重监测曲线显示，降低使用剂量后，动物的耐受能力更好，体重与之前相比有一定的上升(图1)。给药第20天起，与对照组相比较，靶向肽纳米制剂组的相对肿瘤体积有了明显的减小(p〈0.05)。而常规药物和非靶向肽纳米制剂在第24天时才显示出一定的抗肿瘤作用。第28天时，与对照组相比，各给药组的相对肿瘤体积均有了明显的减小，与常规的多西紫杉醇组相比，靶向纳米制剂的抗肿瘤效果进一步提高(P〈0.05)(图2，图3A和3B)。在体结果显示，长期低剂量的治疗方案得到了与前期高剂量治疗方案类似的结果，靶向纳米制剂低剂量组，虽然其给药量只有常规药物组的一半，但仍显示与高剂量药物相当的抗肿瘤能力，表明纳米靶向制剂具有明显的治疗优势。
[0095]为了进一步验证纳米制剂的靶向性，我们开展了药物体内分布观察。结果显示，多西紫杉醇给药后迅速分布于体内各组织，在肝、脾、肺、肾组织中，靶向制剂组在各个时间点的药物浓度均低于常规制剂组，而在肿瘤组织和心脏中，靶向制剂组的药物浓度高于常规制剂组(表1)。药物在肿瘤内的闻度富集，显不纳米制剂具有良好的祀向性，提闻了药物对肿瘤组织的选择性。而在心脏中，由于心脏是富含血管的器官，在心脏组织的富集也侧面反映出了靶向制剂的血药浓度得到了一定的提高，而且半衰期更长。
[0096]表1多西紫杉醇常规制剂及靶向纳米制剂在荷瘤动物的体内分布
【权利要求】
1.一种肿瘤特异性靶向多肽，所述多肽如氨基酸序列SEQ ID NO:2所示；优选所述肿瘤特异性靶向多肽为环肽。
2.一种编码如权利要求1所述的肿瘤特异性靶向多肽的核苷酸序列，所示核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、或其互补序列。
3.权利要求1所述的肿瘤特异性靶向多肽在制备肿瘤早期诊断和治疗试剂中的用途。
4.权利要求1所述的肿瘤特异性靶向多肽在制备肿瘤靶向剂药物方面的用途。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其中所述肿瘤选自子宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞或人神经胶质瘤细胞。
6.根据权利要求3或4所述的用途，其中所述的肿瘤特异性靶向多肽与生物高分子材料连接。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的生物高分子材料为聚乳酸；优选生物高分子材料为纳米材料。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述的生物高分子材料包合抗肿瘤药物。
9.根据权 利要求8所述的用途，其中所述抗肿瘤药物是多西紫杉醇。
10.一种新型靶向抗肿瘤药物，其包括如SEQ ID NO:2所示的肿瘤特异性靶向多肽、生物高分子材料以及抗肿瘤药物。
【文档编号】A61K31/337GK104017049SQ201410246052
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】左萍萍, 刘雁勇, 杨楠, 姜尧, 张慧丰 申请人:中国医学科学院基础医学研究所