本发明涉及cry1a类毒素广谱检测用单链抗体及其基因序列与应用，具体涉及一种来源于抗cry1a类毒素单克隆细胞5b5基因的单链抗体scfv-5b5及其基因序列和应用，以及在scfv-5b5基础上突变改造后的单链抗体scfv-2g12及其基因序列和应用，属于基因工程抗体和免疫学检测技术领域。
背景技术：
btcry毒素是由苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis,简称bt)在其孢子形成阶段产生的，它是一种杀虫蛋白，对鳞翅目和鞘翅目昆虫幼虫有效。当它被敏感昆虫幼虫摄取后，在碱性环境及中肠蛋白酶的作用下裂解为65kda大小的活性蛋白，并与存在于肠道细胞中的特定受体结合，导致孔隙的形成和中肠上皮细胞的裂解，最终导致幼虫死亡。另一方面，因为哺乳动物体内缺乏btcry毒素蛋白的受体，所以btcry毒素被认为对人类和家畜是安全的。目前，btcry1a类毒素基因被广泛引入转基因作物中,一些包含btcry1a类毒素基因的转基因作物，如水稻、棉花、大豆和玉米等的种植面积在全球范围内逐年增加。转btcry1a类毒素基因抗虫作物的不断出现并得到大面积的推广种植在产生经济和社会效益的同时，其对生态安全的风险以及对人类和其它哺乳类动物的安全隐患也逐渐受到关注。目前，被应用的btcry1a类毒素基因种类愈来愈多，带来的政府安全监管和食品加工企业原料管控的技术制约愈来愈明显，尤其是当针对一些转基因食物中基因检测不能取得满意效果的时候，对毒素表达产物安全筛查检测就显的尤为迫切。
针对转基因产品中毒素蛋白的检测方法，目前主要采用针对单一毒素的抗体检测技术，由于针对不同毒素需要制备相对应的抗体，且抗体制备过程冗长、成本高，不能满足广谱筛查检测的要求。因此开发btcry1a类毒素广谱筛查免疫检测技术是一项很有应用价值的工作。
目前针对转基因产品中毒素蛋白的检测方法主要是集中在核酸和蛋白质分析。基于dna-pcr的方法已被广泛应用于bt基因的检测，它具有高度的敏感性。然而，pcr方法需要由经验丰富的人员操作特定的仪器，不仅耗时且不适用于现场快速检测。另一方面，基于蛋白质的检测方法，酶联免疫吸附测定试验(elisa)克服了前者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、适用于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。在elisa过程中，抗体的特异性、灵敏度等将直接影响检测结果，所以要建立针对btcry1a类毒素的免疫学检测技术，必须先制备出高质量的抗btcry1a类毒素蛋白的广谱型抗体。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供cry1a类毒素广谱检测用单链抗体及其基因序列与应用。
本发明提供了cry1a类毒素广谱检测用单链抗体，该检测用单链抗体为scfv-5b5或其突变体scfv-2g12，所述单链抗体scfv-5b5的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述单链抗体scfv-2g12的氨基酸序列如seqidno.4所示。
本发明还提供了单链抗体scfv-5b5或scfv-2g12的基因序列。
编码所述单链抗体scfv-5b5的基因序列如seqidno.1所示；编码所述单链抗体scfv-2g12的基因序列如seqid.3所示。
单链抗体是由重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过一段柔性的连接肽(linker，15-25个氨基酸残基)串联构成，它保留了与抗原的特异性结合活性，另外还可以通过基因工程手段后期对其进行修饰和改造，以提高生物活性。与单克隆抗体相比，单链抗体可以不经过免疫手段大量表达制备，相对来说更简单方便，也容易长期保存。因此，本发明以抗cry1a类毒素单克隆细胞5b5为基因来源，通过通用引物扩增了抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，并由linker(gly4ser)3串联为单链抗体scfv-5b5，随后对scfv-5b5进行突变改造，构建了饱和突变库，并从中筛选获得了活性提高的单链抗体scfv-2g12。两种单链抗体均能同时识别cry1aa，cry1ab，cry1ac三种毒素。随后，在两种单链抗体的基础上，建立了能够同时检测cry1aa，cry1ab，cry1ac三种毒素的das-elisa检测方法。
所述单链抗体scfv-5b5或scfv-2g12在cry1a类毒素检测中的应用，所述cry1a类毒素为cry1aa、cry1ab和cry1ac。
如单链抗体scfv-5b5或scfv-2g12在cry1a类毒素检测中的应用，其具体检测方法如下：
步骤1、包被捕获抗体—将cry1a类毒素单链抗体scfv-5b5或scfv-2g12采用pbs缓冲液稀释到3.5μg/ml后，加入到96孔酶标板中，100μl/孔，于4℃条件下包被过夜；
步骤2、封闭—包被过夜之后，将孔内液体甩出，采用pbst溶液洗涤，随后向孔中加入质量浓度为3％的mpbs溶液作为封闭液，250μl/孔，然后将酶标板置于37℃培养箱中孵育2h；
步骤3、加样品—将酶标板采用pbst溶液洗涤之后，将预先溶解在pbs缓冲液中的cry1a类毒素样品加入到孔内，100μl/孔，然后将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤4、加检测抗体—将酶标板采用pbst溶液洗涤之后，向孔内加入浓度为0.2μg/ml的抗cry1类毒素多克隆抗体，100μl/孔，随后将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤5、加酶标抗体—将酶标板采用pbst溶液洗涤之后，向孔内加入hrp标记的羊抗兔抗体，100μl/孔，将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤6、显色—将酶标板采用pbst溶液洗涤之后，将tmb显色液体系加入到酶标板微孔内，100μl/孔，并将酶标板置于37℃培养箱中避光孵育15min；
步骤7、检测—将终止液加入到酶标板的微孔内，50μl/孔，在酶标仪上于450nm条件下测吸光度值。
步骤3中，所述cry1a毒素样品为cry1aa、cry1ab、cry1ac中的至少一种。
上述的终止液采用浓度为2m的h2so4。
本发明提供的两种单链抗体与3种cry1a类毒素(cry1aa，cry1ab和cry1ac)均具有较好的结合活性，同时与cry1b、cry1c和cry1f类毒素无交叉反应，可用于cry1a类毒素的广谱检测，操作简便，宜于推广应用。
附图说明
图1为scfv-5b5基因扩增、鉴定及其氨基酸序列的示意图。
图2为scfv-5b5与cry1ab分子对接分析结果的示意图。
图3为scfv-2g12与cry1ab分子对接分析结果的示意图。
图4为scfv-2g12氨基酸序列及其与scfv-5b5的表达鉴定结果示意图。
图5为scfv-5b5和scfv-2g12针对三种cry1a类毒素建立的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
实施例中所涉及的试剂和培养基配方如下：
(1)pbs缓冲液：称取8.0gnacl，0.2gkcl，2.9gna2hpo4·12h2o和0.2gkh2po4溶于双蒸水并定容至1l，调节ph到7.4。
(2)pbst溶液：在pbs缓冲液中加入体积比为0.05％的tween-20。
(3)3％mpbs溶液：称取3g脱脂奶粉，溶于100ml双蒸水中。
(4)cpbs溶液：称取21g柠檬酸(c6h7o8)和71.6gna2hpo4·12h2o溶于双蒸水并定容至1l，调节ph到5.5。
(5)tmb母液：称取10mgtmb溶于1ml二甲基亚砜中，于4℃下短期保存。
(6)显色液：取浓度为10mg/ml的tmb母液100μl和质量浓度为0.65％的h2o225μl，溶于9.875mlcpbs溶液中，现配现用。
(7)浓度为2m的h2so4：量取11.8ml浓硫酸(98％)缓缓加入到80ml蒸馏水中，加的过程中不断搅拌，冷却后定容到100ml。
(8)2×ty培养基：称取胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，nacl5g，采用双蒸水溶解并定容至1l，分装后于121℃条件下高压灭菌。
(9)2×ty-ag培养基：在2×ty培养基中加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和质量比为1％的葡萄糖。
(10)tye培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl8g，琼脂粉15g，采用双蒸水溶解并定容至1l，于121℃条件下高压灭菌备用。
(11)tye-ag培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl8g，琼脂粉15g，采用双蒸水溶解并定容至1l，高压灭菌后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和质量比为1％的葡萄糖。
(12)peg/nacl溶液：称取20gpeg8000和14.61gnacl，先用少量去离子水溶解，再定容至100ml，121℃条件下高压灭菌后，于4℃保存备用。
(13)浓度为1m的iptg溶液：称取2.38giptg溶于10ml无菌水中，采用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃保存。
实施例中所涉及材料的来源：
km13辅助噬菌体，pit2噬菌粒载体，e.colitg1和e.colihb2151均购于mrc(cambridge,england)；抗-m13-hrp抗体，抗-his-hrp抗体和his-traphp亲和柱均购于gehealthcare(america)；cry1aa，cry1ab，cry1ac，cry1b，cry1c，cry1f均购于上海佑隆生物科技有限公司。测序中所涉及的所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，例如rv-m、m13-47。
本实施例所涉及的其余试剂及材料均为市购，此处不在一一列举。
实施例中所涉及的核苷酸及氨基酸序列：
seqidno.1：
gaggtgaagttggtggagtcaggacccagcctagtgcagccctcacagagcctgtccacaacttgcacagtctctggtttctcatcaactaactttggtgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggagaggtggaaacacagactacaatgcagctttcatgtccagactgagcatcaccagggacaactccaagagacaaattttctttaaaatggacagtctgcaagctgatgacactgccatatactactgtgccaaaccccttatctactatggtaactacggttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcagtggcggatcggatattcagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagaaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttgaactcctgatctactacacatcaaggttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacacattattctctcgccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacctttgccaacagggtcatgcgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccaseqidno.2：
evklvesgpslvqpsqslsttctvsgfsstnfgvhwvrqspgkglewlgviwrggntdynaafmsrlsitrdnskrqiffkmdslqaddtaiyycakpliyygnygyfdvwgagttvtvssggggsggggsggggsdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdirnylnwyqqkpdgtvelliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgthyslaisnleqediatylcqqghalpytfgggtklelkrtvaapseqidno.3：
gaggtgaagttggtggagtcaggacccagcctagtgcagccctcacagagcctgtccacaacttgcacagtctctggtttctcatcaactaactacggtgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggagaggtggaaacacagactacaatgcagctttcatgtccagactgagcatcaccagggacaactccaagagacaaattttctttaaaatggacagtctgcaagctgatgacactgccatatactactgtgccaaaccccttatctactatggtaactacggttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcagtggcggatcggatattcagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagaaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttgaactcctgatctactacacatcaaggttacactacggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacacattattctctcgccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacctttgccaacagggtcatgcgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccaseqidno.4：
evklvesgpslvqpsqslsttctvsgfsstnygvhwvrqspgkglewlgviwrggntdynaafmsrlsitrdnskrqiffkmdslqaddtaiyycakpliyygnygyfdvwgagttvtvssggggsggggsggggsdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdirnylnwyqqkpdgtvelliyytsrlhygvpsrfsgsgsgthyslaisnleqediatylcqqghalpytfgggtklelkrtvaap
seqidno.5：
rv-m：5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’
seqidno.6：
m13-47：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’
seqidno.7：
lmb3：5’-caggaaacagctatgac-3’
seqidno.8：
phenseq：5’-ctatgcggccccattca-3’
实施例1scfv-5b5基因的扩增和鉴定。
(1)抗体vh和vl基因的扩增。
采用trizol总rna提取试剂盒(购自invitrogen)从杂交瘤细胞5b5(杂交瘤细胞5b5为申请人实验室自制，其制备方法参见文献：dongs,zhangc,zhangx,liuy,zhongj,xiey,xuc,dingy,zhangl,liux(2016)productionandcharacterizationofmonoclonalantibodybroadlyrecognizingcry1toxinsusingdesignedpolypeptideashapten.analchem88:7023-7032.)中提取总rna，并采用superscripttmiii试剂盒(购自invitrogen)将其反转录为cdna。以得到的cdna为模板，将相应的上、下游简并引物(见表1)分别等量混合，进行pcr反应，以扩增vh和vl基因。
pcr反应体系(20μl)：2×pfumastermix(购自北京全式金公司)，10μl；10μm的vh/vl混合上游引物，1μl；10μm的vh/vl混合下游引物，1μl；cdna模板，1μl；ddh2o(双蒸水)补足20μl；pcr反应条件：94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃60s)×30个循环，72℃10min。
取全量pcr扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，采用体积比为5％goldview染色，于凝胶成像系统下观察图像，切取目的大小的片段，按照axygen的胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，得到vh纯化产物和vl纯化产物，直接用于后续实验或-20℃保存备用。
(2)抗体vh和vl基因的克隆与鉴定。
将纯化后的vh和vl基因分别连接到pmd19-t载体(购自takara)。酶连体系为：1μlvector，5μlbuffer和4μlvh或vl纯化产物，加入到pcr管中，小心混匀，16℃连接过夜。然后将酶连体系转化到trans1-t1感受态细胞(购自北京全式金公司)，其具体转化步骤参照王耘博士毕业论文“两种bt毒素单链抗体制备与抗体检测技术研究”第2章1.4.3节操作。取适量复苏的菌液涂布于tye-ag平板上，培养过夜后用无菌枪头挑取平板上的单菌落进行pcr反应和测序鉴定。
pcr反应体系(10μl)：2×taqmastermix(购自北京全式金公司)，5μl；10μm的上游引物rv-m(如seqidno.5所示)，0.5μl；10μm的下游引物m13-47(如seqidno.6所示)，0.5μl；菌液模板，1μl；ddh2o补足10μl；反应条件：94℃5min，(94℃1min，55℃45s，72℃60s)×30个循环，72℃10min。
取5μlpcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，在目的基因片段大小处有明显条带的克隆即为阳性克隆。将阳性克隆菌液送去上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序鉴定，将测序结果正确的菌株扩大培养之后，一部分加入体积比为15％的甘油(即甘油的加入量为总体积的15％)于-80℃保存，另一部分用于提取质粒(步骤参照axygen质粒提取试剂盒说明书)，即可得到vh重组质粒和vl重组质粒，直接用于后续试验或-20℃保存备用。
(3)scfv-5b5基因的构建。
单链抗体全长基因的扩增采用重叠延伸pcr，根据vh和vl基因的测序结果，设计特异性引物(见表2)，通过中间柔性连接肽(linker)将vh和vl连接，构建vh-linker-vl形式的scfv-5b5基因序列。
首先以上述步骤(2)获得的含有vh和vl的质粒作为模板，分别以vh-ncoi-f、vh-linker-r和vl-linker-f、vl-noti-r作为扩增vh和vl连接肽基因的引物，进行pcr扩增。
pcr反应体系(20μl)：2×pfumastermix，10μl；10μm的vh-ncoi-f/vl-linker-f，1μl；10μm的vh-linker-r/vl-noti-r，1μl；vh/vl重组质粒，1μl；ddh2o补足20μl；反应条件：94℃5min，(95℃45s，55℃45s，72℃60s)×30个循环，72℃10min。
取全量pcr扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，验证vh和vl连接肽基因是否扩增成功，在扩增成功的vh和vl连接肽基因上切取目的大小的片段，按胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，得到ncoi-vh-linker和linker-vl-noti纯化产物。
将纯化得到的ncoi-vh-linker和linker-vl-noti基因等量加入到pcr反应体系中，按如下两步进行全长scfv-5b5基因序列的扩增。
第一步：pcr反应体系(25μl)：2×pfumastermix，12.5μl；ncoi-vh-linker，50ng；linker-vl-noti，50ng；ddh2o补足25μl；反应条件：(94℃1min，50℃1min，72℃1min)×10个循环。
第二步：pcr反应体系(25μl)：2×pfumastermix，12.5μl；10μm的vh-ncoi-f，0.5μl；10μm的vl-noti-r，0.5μl；第一步的拼接产物，2μl，ddh2o补足25μl；反应条件：94℃1min，(94℃1min，60℃1min，72℃1min)×30个循环，72℃10min。
取全量pcr扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，验证scfv-5b5基因是否扩增成功，在扩增成功的scfv-5b5基因上切取目的大小的片段，按照胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，得到scfv-5b5纯化产物，直接用于后续实验或-20℃保存备用。
(4)scfv-5b5基因的克隆与鉴定。
将纯化后的scfv-5b5基因连接到pmd19-t载体。酶连体系为：1μlvector，5μlbuffer和4μl的scfv-5b5纯化产物，加入pcr管，小心混匀，16℃连接过夜。然后将酶连体系转化到trans1-t1感受态细胞，其具体转化步骤参照王耘博士毕业论文“两种bt毒素单链抗体制备与抗体检测技术研究”第2章1.4.3节操作。取适量复苏的菌液涂布于tye-ag平板上，培养过夜后用无菌枪头挑取平板上的单菌落进行pcr和测序鉴定。
pcr反应体系(10μl)：2×taqmastermix，5μl；10μm的rv-m，0.5μl；10μm的m13-47，0.5μl；菌液模板，1μl；ddh2o补足10μl；反应条件：94℃5min，(94℃1min，55℃45s，72℃60s)×30个循环，72℃10min。
取5μlpcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，在目的基因片段大小处有明显条带的克隆即为阳性克隆。将阳性克隆菌液送去上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序鉴定，测序结果正确的菌株，扩大培养之后，一部分加入15％的甘油-80℃保存，另一部分用于提取质粒(步骤参照axygen质粒提取试剂盒说明书)，得到含scfv-5b5全长基因序列的质粒，直接用于后续试验或-20℃保存备用。
(5)scfv-5b5原核表达载体的构建和鉴定
分别取等量的含scfv-5b5全长基因序列的质粒和表达载体pit2质粒进行ncoi和noti双酶切。酶切体系：ncoi(购自neb)，1μl；noti(产自neb)，1μl；10×nebcutsmartbuffer，5μl；pit2质粒/scfv-5b5质粒，1μg；ddh2o补足50μl；将以上体系混匀后，37℃酶切过夜，80℃失活20min。次日，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，分别切胶回收酶切下来的scfv-5b5片段和酶切开的线性pit2表达载体。
随后进行酶连，酶连体系为：1μlt4dnaligase(购自neb)，2μl10×buffer，10μlscfv-5b5纯化产物(上一步切胶回收)，3μlpit2线性载体(上一步切胶回收)，4μlddh2o，加入pcr管，小心混匀，16℃连接过夜，得到连接产物pit2-scfv-5b5。
将连接产物转化至宿主菌e.colihb2151感受态细胞中，复苏菌液涂于tye-ag平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12-16h。培养结束后，从平板上挑取单菌落，加入到2ml2×ty-ag液体培养基中，置于37℃，250rpm条件下，培养16h左右，对菌液进行pcr验证。
pcr反应体系(10μl)：2×taqmastermix，5μl；10μm的lmb3(如seqidno.7所示)，0.5μl；10μm的phenseq(如seqidno.8所示)，0.5μl；菌液模板，1μl；ddh2o补足10μl；反应条件：94℃5min，(94℃1min，55℃1min，72℃1min)×30个循环，72℃10min。
取5μlpcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，在目的基因片段大小处有明显条带的克隆即为阳性克隆。将阳性克隆菌液送去上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序鉴定，测序结果正确的pit2-scfv-5b5菌株，扩大培养之后，一部分加入15％的甘油-80℃保存，另一部分于4℃保存备用。以上scfv-5b5基因扩增、鉴定及其氨基酸序列如图1所示。
实施例2scfv-5b5基因的同源建模及与cry1a毒素分子对接
将测序获得的scfv-5b5基因序列翻译为氨基酸序列，并利用现有的swiss-model网站(网址为http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模。随后将scfv-5b5的三维结构模型与三种cry1a毒素的三维结构模型采用现有的zdock网站(网址为http://zdock.umassmed.edu/)进行分子对接，以获得复合物的结构模型。随后，采用四种现有的热点预测网站(网址分别为https://mitchell-lab.biochem.wisc.edu/kfc_server/index.php；http://prism.ccbb.ku.edu.tr/hotpoint/；http://structure.pitt.edu/anchor/；http://robetta.bakerlab.org/alascansubmit.jsp)预测scfv-5b5与三种cry1a毒素的关键结合位点(结果见表3)，三维结构模型采用现有的swiss-pdbviewer软件进行分析，scfv-5b5与cry1ab分子对接分析结果见图2。
随后根据scfv-5b5的基因序列设计特异性引物(见表4)，对关键氨基酸位点进行饱和突变。扩增步骤如表5所示。
pcr反应体系(50μl)：2×pfumastermix，25μl；10μm的上游引物，1μl；10μm的下游引物，1μl；scfv-5b5模板(其中第5步反应的模板为前4步纯化产物的混合物)，2μl；ddh2o补足50μl；反应条件：94℃5min，(94℃30s，65℃30s，72℃30s)×30个循环，72℃10min。
取全量pcr扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，5％goldview染色，凝胶成像系统下观察图像，切取目的大小的片段，按照胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，得到纯化后的scfv突变片段。
实施例3scfv-5b5饱和突变库的构建及筛选
将纯化后的scfv突变片段和表达载体pit2质粒进行ncoi和noti双酶切。
酶切体系：10×nebcutsmartbuffer，5μl；ncoi，1μl；noti，1μl；pit2质粒/scfv突变片段，1μg；ddh2o补足50μl；将以上体系混匀后，37℃酶切过夜，80℃失活20min。次日，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，分别切胶回收酶切后的scfv突变片段和酶切开的线性pit2表达载体。
随后进行酶连，体系为：1μlt4dnaligase，2μl10×buffer，10μlscfv突变片段酶切产物(上一步胶切回收)，3μlpit2线性载体(上一步胶切回收)，4μlddh2o，加入pcr管，小心混匀，16℃连接过夜，得到连接产物pit2-scfv-2g12。将连接产物电转入e.colitg1感受态细胞，获得突变库。具体转化步骤参照王耘博士毕业论文“两种bt毒素单链抗体制备与抗体检测技术研究”第2章1.4.3节操作。随后进行抗体库鉴定、培养与筛选。筛选共进行四轮，包被原为三种cry1a类毒素的混合物，从1轮到4轮的包被浓度分别为100，75，50，25μg/ml。抗体库鉴定、培养与筛选具体步骤参照王耘博士毕业论文“两种bt毒素单链抗体制备与抗体检测技术研究”第2章1.4.4节,1.4.5节和1.4.6节操作。
取第四轮筛选后的菌液，部分菌液用2×ty培养基做梯度倍比稀释，取稀释液50μl涂布tye-ag平板，37℃倒置培养过夜。剩余菌液保存在含15％甘油的2×ty培养基中，-80℃保存，标记为四级抗体库。随后随机挑取过夜平板上的单菌落进行elisa鉴定，最终获得活性较scfv-5b5提高的突变体scfv-2g12。具体elisa步骤参照王耘博士毕业论文“两种bt毒素单链抗体制备与抗体检测技术研究”第3章1.2.3.2节操作。
实施例4scfv-5b5及scfv-2g12的表达及纯化鉴定
取保存于4℃的测序正确的pit2-scfv-5b5和pit2-scfv-2g12重组菌和空载菌液，按1％比例转接于2×ty-ag液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜。取过夜菌液按1％比例转接于100ml2×ty-ag(含有0.1％的葡萄糖)液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养至od600约为0.6-0.8，约3h。加入1mmiptg溶液，30℃诱导表达10h，并以空载菌株作为对照。诱导结束后，4℃10000g离心20min，弃上清，取100mlpbs重悬菌体。于冰浴中超声破碎菌体40min，功率为35％，工作3s，停4s。16000g离心30min，收集上清液，即为可溶性蛋白。随后过his-traphp亲和柱纯化并收集蛋白(具体纯化方法参照论文“人源化抗cry1b毒蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定”徐重新等，南京农业大学学报，2013年3期)。最后sds-page和wb分析目的蛋白的表达情况(约27kda)。scfv-2g12与cry1ab分子对接分析结果见图3。scfv-2g12氨基酸序列及其与scfv-5b5的表达鉴定结果见图4。
实施例5das-elisa检测方法的建立
步骤1、包被捕获抗体—将cry1a类毒素单链抗体scfv-5b5或scfv-2g12采用pbs缓冲液稀释到3.5μg/ml后，加入到96孔酶标板中，100μl/孔，于4℃条件下包被过夜；
步骤2、封闭—包被过夜之后，将孔内液体甩出，使用洗板机采用pbst溶液洗涤3次，随后向孔中加入质量浓度为3％的mpbs溶液作为封闭液，250μl/孔，然后将酶标板置于37℃培养箱中孵育2h；
步骤3、加样品—将酶标板使用洗板机采用pbst溶液洗涤3次之后，将预先溶解在pbs缓冲液中的cry1a类毒素样品(cry1a类毒素样品为cry1aa、cry1ab、cry1ac中的一种，并采用cry1a毒素标准品，其溶度为0.015,0.03,0.06,0.12,0.25,0.5,1,2,4,8,16,and32μg/ml)加入到孔内，100μl/孔，同时用pbs缓冲液作为空白对照，然后将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤4、加检测抗体—将酶标板使用洗板机采用pbst溶液洗涤3次之后，向孔内加入浓度为0.2μg/ml的抗cry1类毒素多克隆抗体，100μl/孔，随后将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤5、加酶标抗体—将酶标板使用洗板机采用pbst溶液洗涤3次之后，向孔内加入hrp标记的sigma羊抗兔抗体(体积比为1:5000，3％mpbs作为溶剂使用)，100μl/孔，将酶标板置于37℃培养箱中孵育1h；
步骤6、显色—将酶标板使用洗板机采用pbst溶液洗涤4次之后，将tmb显色液体系加入到酶标板微孔内，100μl/孔，并立即将酶标板置于37℃培养箱中避光孵育15min；
步骤7、读数—将终止液(浓度为2m的h2so4)加入到酶标板的微孔内，50μl/孔，立即在酶标仪上于450nm条件下读取吸光度值，根据检测结果建立scfv-5b5和scfv-2g12针对三种cry1a类毒素的标准曲线，见图5。
以上建立的das-elisa检测方法对三种cry1a类毒素的最低检测限，最低定量限和定量范围结果如表6所示。由表可以看出，基于单链抗体scfv-5b5和单链抗体scfv-2g12建立的检测方法均对三种cry1a类毒素具有很好的检测效果，而抗体scfv-2g12活性更好。
表1抗体可变区vh和vl基因序列扩增通用引物
note注：y＝c/t；b＝c/g；w＝a/t；s＝g/c；m＝a/c；r＝a/g；k＝g/t；d＝a/g/t；v＝a/c/g
表2soe-pcr扩增scfv-5b5全长序列所用引物
表3scfv-5b5与cry1a毒素结合热点预测结果
a被相应的热点预测网站预测为热点氨基酸.
表4用于scfv-5b5上35th,36th,104th,105th和196th氨基酸定点饱和突变的特异性引物
表5scfv-5b5突变体扩增步骤
表6scfv-5b5和scfv-2g12对三种cry1a毒素的lod、loq和定量范围结果
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110>扬州大学
<120>cry1a类毒素广谱检测用单链抗体及基因序列与应用
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