一种特异性识别并结合Aβ42寡聚体的单链抗体及单链抗体基因的制作方法
【专利摘要】一种特异性识别并结合Aβ42寡聚体的单链抗体及单链抗体基因，属于基因工程抗体【技术领域】。具体是提供了一种包括重链可变区、轻链可变区的人源性抗Aβ42寡聚体的单链抗体AS，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。同时提供了一种核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的编码单链抗体AS的基因，以及该基因与pET-28a、pET-41b、pMA5、pPZW103等载体构建的基因工程表达载体。该单链抗体能特异性识别并结合Aβ42寡聚体，降低Aβ42寡聚体的水平，有效抑制Aβ42寡聚体的细胞毒性，可在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。
【专利说明】一种特异性识别并结合A β 42寡聚体的单链抗体及单链抗体基因
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程抗体【技术领域】，具体涉及一种特异性识别并结合β -淀粉样蛋白(Αβ 42)寡聚体的单链抗体及编码这种单链抗体的基因。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病,其病理特征是渐进性的Aβ 42的聚集与沉积、神经突触丢失和神经纤维缠结，临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。对于AD的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是A β 42毒性学说。
[0003]现已证明，由Αβ 42单体聚集形成的Αβ 42寡聚体是引起AD的主要致病因子。然而，目前国际上试验的诊断或治疗AD用抗体，大多是针对Αβ 42—级序列的，这些抗体与A β 42单体、寡聚体或纤维均能结合，而非特异地识别并结合A β 42寡聚体，在病理检测及临床诊断中无法特异地检测出Αβ 42聚集体的水平，同时，这类抗体在对AD的治疗中也易引起副作用。
[0004]有关AD的被动免疫治疗报道中，多数采用的是人源化的多克隆抗体或单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子人源性抗体或抗体片段出发，筛选特异性识别和结合A β 42寡聚体的单链抗体成为目前诊断或治疗AD的热点。
[0005]单链抗体(single chain Fv, scFv)是一种小分子的基因工程抗体,它是在DNA水平上利用基因工程方法将天然抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段人工合成的链接肽(Linker)连接而成的小分子重组抗体。与完整抗体分子相比，它具有以下特点:含有完整的抗体可变区，具有较完整的抗原结合位点；不含有抗体分子的Fe段，因而免疫原性弱，用于人体不易产生免疫反应；分子量小，穿透力强，易穿过血脑屏障，适用于AD的诊断或治疗；体内循环半衰期短，易从血循环中排除；不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，所以利于进行基因工程操作和可以利于原核表达系统大量生产。因此，单链抗体是目前报道最多、也最有发展前景的抗AD的基因工程抗体。
[0006]虽然目前国际上已有抗Αβ42寡聚体的单链抗体的报道(Fukuchi K, 2006,Biochem Bioph Res Co, 344，79-86 ;Yoshihara T 等，2008，J Biochem, 143，475-486 ;Zameer A 等，J Mol Biol,384,917-928 ;Robert R 等，2009，Protein Eng Des Sel.22，199-208)，但这些单链抗体对A β 42寡聚体的特异性不高，亲和性也有限，而且未显示出明显的可诱导A β 42寡聚体解聚的功效。迄今为止，国内尚未见有特异性结合A β 42寡聚体、并可有效诱导其解聚的单链抗体的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种特 异性识别并结合Αβ 42寡聚体的单链抗体以及编码这种单链抗体的基因。
[0008]本发明解决了现有抗体无特异性地与包括Αβ 42单体在内的所有Αβ 42形式均可结合的技术问题，利用基因工程抗体技术成功筛选出特异性与Αβ 42寡聚体结合，而不与Αβ 42单体及纤维结合的单链抗体。本发明所述的单链抗体与A β 42寡聚体特异性结合的特性与A β 42的一级结构无关，而是基于A β 42寡聚体所特有的空间立体构象，是构象依赖型的单链抗体。
[0009]本发明所述的A β 42寡聚体是由2个到几十个不等的A β 42单体聚集形成的聚集体，分子间主要以氢键和疏水键相结合，分子量从9kDa至IOOkDa不等。
[0010]本发明提供了一种包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的人源性抗A β 42寡聚体的单链抗体AS，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中VH具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，AS的分子量约为31kDa。
[0011]本发明还提供了一种编码前面所述的人源性抗Αβ 42寡聚体的单链抗体AS的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]进一步,本发明所述的单链抗体AS能够有效抑制Αβ 42单体的聚集,还能够使Αβ 42寡聚体解聚，并能明显降低A β 42寡聚体对神经细胞的毒性，在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。
[0013]再进一步，本发明所述的编码一种人源性抗Αβ 42寡聚体的单链抗体AS的基因可与pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103构建基因工程表达载体，该基因及该基因工程表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。
[0014]本发明所述的单链抗体AS能够特异性识别并结合A β 42寡聚体，作为检测A β 42寡聚体的临床诊断制剂和AD治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:pET41b_AS重组表达载体的测序谱图；
[0016]图2:纯化的单链抗体AS的SDS-PAGE谱图，其中M:蛋白质Marker ；A:阴性对照；B:表达的AS ；C:纯化的AS ；
[0017]图3:单链抗体AS与不同形态A β 42识别的Dot-Blot分析谱图；
[0018]图4 =ELISA法测定AS与Αβ 42寡聚体亲和性的曲线图；
[0019]图5:单链抗体AS与不同分子量Αβ 42识别的Western blot分析谱图；
[0020]图6 =ThT-F法分析单链抗体AS抑制A β 42聚集的谱图，其中A图为A β 42单体分析谱图，B图为A β 42寡聚体分析谱图；
[0021]图7 =MTT法测定单链抗体AS抑制A β 42细胞毒性的柱形图。
【具体实施方式】
[0022]实施例1A β 42寡 聚体和A β 42纤维的制备
[0023]Αβ 42单体(购自美国Sigma公司)用冰预冷的六氟异丙醇(HFIP)溶解至浓度为lmg/mL,冰水浴超声lOmin，真空干燥，_20°C冻存。使用时，先将A β 42用二甲基亚砜(DMSO)溶解至浓度为lmg/mL，再将Αβ42稀释到浓度为10 μ M的磷酸盐缓冲液(ρΗ7.4，50mM)中，终浓度为10 μ Μ，在37°C分别孵育12h形成A β 42寡聚体的聚集状态以及孵育3d形成成熟纤维的聚集状态。所有Αβ42聚集状态均通过电镜确认。由于A β 42形成聚集体的不可逆性，Aβ 42的寡聚体及纤维的使用均为现用现制备，若短期使用则于_80°C储存。
[0024]实施例2阳性克隆的筛选
[0025](I)外周血淋巴细胞RNA提取及反转录合成cDNA
[0026]外周血淋巴细胞分离提取:用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)抗凝管采集阿尔茨海默病人外周血血样10mL，用无钙、镁离子的平衡盐缓冲液(D’ Hanks)(购自碧云天生物技术研究所)以1:1体积稀释，以稀释血样与淋巴细胞分离液=2:1 (体积比)的比例加入聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(购自美国sigma公司)。室温下，以2000rpm/min离心20min。离心后，吸取单个核细胞层。用D’Hanks洗漆细胞，1000rpm/min离心IOmin,获得外周血淋巴细胞。
[0027]外周血淋巴细胞RNA提取:在IX IO7个外周血淋巴细胞中加入ImL苯酚-异硫氰酸胍总RNA抽提试剂(TriZoIl1-Reagent)(购自Invitrogen公司),4°C静置5min。加入200 μ I氯仿,上下颠倒至溶液出现衆白色。置于冰上5min。在4°C条件下，12000rpm/min离心15min。将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育lOmin。以4°C条件下，12000rpm/min,离心lOmin。弃上清,在沉淀(含RNA)中加lmL75% (体积分数)乙醇洗漆。在4°C条件下，12000rpm/min离心5min,得到RNA沉淀。空气干燥后,用适量三轻甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE)或无RNA酶的去离子水溶解备用。
[0028]反转录合成cDNA:在反转录酶的作用下用上述提取的RNA合成cDNA的方法如下，取4μ1 RNA加入到0.1mL离心管中，加入寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸引物(Oligo dTPrimer) I μ I和脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP) I μ I,最后以无RNA酶去离子水补充至10μ 1，65°C保温5min后，于冰浴中迅速冷却。在上述离心管中加入反转录缓冲液(PrimerScript II Buffer) 4 μ 1、RNA 酶抑制剂(RNase Inhibitor) 0.5 μ 1、反转录酶(PrimerScript II RTase) I μ I,最后以无RNA酶的去离子水补充到20 μ I,缓慢混匀。以420C 30-60min,95°C 5min的条件进行反转录反应后，冰上冷却。
[0029](2 )编码VH与VL的DNA片段扩增
[0030]依据VH和VL的保守序列，设计并合成了扩增编码VH和VL的DNA片段的引物，其
序列如下:
[0031]
【权利要求】
1.一种单链抗体AS，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.权利要求1所述的单链抗体AS在抑制Aβ 42单体聚集方面的应用。
3.权利要求1所述的单链抗体AS在使Aβ 42寡聚体解聚方面的应用。
4.权利要求1所述的单链抗体AS在降低Aβ 42寡聚体对神经细胞毒性方面的应用。
5.权利要求1所述的单链抗体AS在制备抗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
6.一种编码权利要求1所述单链抗体AS的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示。
7.一种基因工程表达载体，其特征在于:是由权利要求6所述的编码单链抗体AS的基因与pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103载体构建的重组表达载体。
8.权利要求6所述的编码单链抗体AS的基因在制备抗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
9.权利要求6所述的基因工程表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103804496SQ201410064049
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月22日 优先权日:2014年2月22日
【发明者】张应玖, 张媛, 怀阳阳 申请人:吉林大学