甘薯β-淀粉酶基因IbBAM1a、其编码的蛋白及应用的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a、其编码的蛋白及应用。

背景技术：

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料及新型生物能源作物，具有广阔的发展前景。β-淀粉酶作为甘薯块根中的重要蛋白质，参与淀粉的降解，影响甘薯的生长发育，在植株抵御逆境胁迫中也起着重要作用。

植物在逆境胁迫下会导致渗透压的改变，这与低温的严重程度和受胁迫的持续时间有关。渗透压的改变破坏了细胞膜的完整性，使细胞代谢功能出现障碍甚至死亡。为了适应寒冷环境或在低温胁迫下生存，植物会产生各种响应机制，其中之一就是渗透调节。β-淀粉酶通过参与淀粉的水解，将淀粉转化为麦芽糖，麦芽糖在其它糖苷酶的作用下又能转化为葡萄糖等可溶性糖。可溶性糖是一种有效的渗透调节剂，它们可以在干旱或高盐等非生物胁迫下平衡或降低渗透势，能够保护生物大分子的稳定性，从而稳定细胞内生化反应，防止细胞膜的破坏。β-淀粉酶的产物—可溶性糖除了作为渗透调节物质起作用外，还可以作为抗氧化剂发挥功能。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a、其编码的蛋白以及在提高植物麦芽糖含量、抗旱性和耐盐性中的应用，本发明通过将甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a转入拟南芥中，可以显著提高拟南芥的麦芽糖含量、抗旱性和耐盐性。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a，其序列如seqidno:1所示。

克隆上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a的引物对，所述引物对的序列如下：

p1：5′-ggataatatggcaatgagtttaccg-3′；

p2：5′-tgatcatcgtggagctcttctt-3′。

所述p1和p2分别与ibbam1a基因第1-25碱基、第1731-1752碱基对应。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a序列的载体。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a序列的表达盒。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a序列的重组菌。

上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a表达的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a在提高植物麦芽糖含量中的应用。

上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a在提高植物抗旱性和/或耐盐性中的应用。

一种提高植物麦芽糖含量的方法，将上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a序列构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导转化植物细胞，使其在植物细胞中表达，获得高麦芽糖含量的植株。

一种提高植物抗旱性和/或耐盐性的方法，将上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a序列构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导转化植物细胞，使其在植物细胞中表达，获得抗旱性和/或耐盐性的植株。

本发明技术方案的优点

1、本发明从甘薯中克隆获得β-淀粉酶基因ibbam1a。

2、将甘薯β-淀粉酶基因ibbam1a构建到植物表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥，在拟南芥中异源表达，胁迫处理后转基因拟南芥的麦芽糖含量比未转基因对照提高50％以上；转基因拟南芥幼苗可耐300mm甘露醇或125mmnacl。

附图说明

图1是过表达株系和野生型植株分别在ms培养基(a)以及含有300mmmannitol(b)或125mmnacl(c)的ms培养基上培养2w后的生长状况；

图2是过表达株系与野生型植株的抗旱耐盐盆栽鉴定；

图3是盐或干旱胁迫下转基因拟南芥和野生型植株的sod活性测定，其中wt：野生型拟南芥，oe-1和oe-2为2个过表达ibbam1a的转基因拟南芥株系；

图4是盐或干旱胁迫下转基因拟南芥和野生型植株的mda含量测定；其中wt：野生型拟南芥，oe-1和oe-2为2个过表达ibbam1a的转基因拟南芥株系；

图5盐或干旱胁迫下转基因拟南芥和野生型植株β-淀粉酶活性测定，其中wt：野生型拟南芥，oe-1和oe-2为2个过表达ibbam1a的转基因拟南芥株系；

图6盐或干旱胁迫下转基因拟南芥和野生型植株麦芽糖含量测定，其中wt：野生型拟南芥，oe-1和oe-2为2个过表达ibbam1a的转基因拟南芥株系；

图7盐或干旱胁迫下转基因拟南芥和野生型植株总淀粉含量测定，其中wt：野生型拟南芥，oe-1和oe-2为2个过表达ibbam1a的转基因拟南芥株系。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1、甘薯ibbam1a基因植物表达载体的构建

(1)扩增甘薯ibbam1a基因

克隆所述甘薯ibbam1a基因的引物名称与序列如下：

p1：5′-ggataatatggcaatgagtttaccg-3′(seqidno:3)；

p2：5′-tgatcatcgtggagctcttctt-3′(seqidno:4)，

所述p1和p2分别与ibbam1a基因第1-25碱基、第1731-1752碱基对应。

提取甘薯块根rna，以反转录的cdna为模板，用上述ibbam1b基因特异性引物进行rt-pcr扩增，获得甘薯ibbam1a基因序列表如seqidno:1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqidno:2所示。采用的甘薯样品来源于品“烟薯25”由青岛农业大学甘薯中心保存，由烟台农科院甘薯所选育。

seqidno:1

seqidno:2

mamslphqltaisgtpiaveagtvsgegpakasvvtsafwknpagnlrvsvqksgaevdrvspspplspvrgglrpdltaacqalmeaptvereykvgdlghekgkgvpvfvmmpldsvkmdhtvnrrkamnaslqalksagvegvmmdvwwglvekdspgeynwggyaellemakkhglkvqavmsfhqcggnvgdsctiplprwvveemekdpdlaytdqwgrrnyeyvslgcdtlpvlkgrtpvqcysdfmrgfrdrfehllgdtiveiqvgmgpagelrypsypeqngtwkfpgigafqcfdkymisslrataesigkpewghsgptdaghynnwpedtnffrkeggwttpygefflswysqmlldhgerilqsanaifdntgvkisvkiagihwhygtrshapeltagyyntrfrdgylpiaqmlarhgaifnftciemrdheqpqdaqcapeklvrqvalatqeaqvplagenalpryddyaheqilrasalsvdeksgdremcaftylrmnpnlfqadnwrrfvafvkkmkegkdahkcweemereaehfvhitqplvheaaaalmh*

在上述引物序列的5′分别添加hindiii和xbai的酶切位点，用于构建植物表达载体的特异性引物对，添加酶切位点的引物对序列如下：

p3：5′-aagcttggataatatggcaatgagtttaccg-3′(hindiii)(seqidno:5)；

p4：5′-tctagatgatcatcgtggagctcttctt-3′(xbai)(seqidno:6)；

(2)ibbam1a基因与克隆载体pmd18-t及植物表达载体pcambia1301的连接

用含有酶切位点的ibbam1a基因特异性引物进行rt-pcr扩增，回收pcr产物，并在t4dna连接酶作用下与克隆载体pmd18-t(购买于takara)进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用hindiii和xbai进行双酶切，回收含ibbam1a基因的酶切片段，并连接到植物表达载体pcambia1301的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pcambia1301-ibbam1a。

2、将表达载体转化拟南芥，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pcambia1301-ibbam1a重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株gv3101感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到yeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)液体培养基中，28℃、180rpm培养至od600＝0.5～0.8时，取2ml菌液转移到50mlyeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)培养基中，培养到od600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体msb5悬浮备用。

b、农杆菌介导的遗传转化：将正在抽苔开花的拟南芥提前一天浇足水，小盆倒置，将所有花序置于农杆菌悬浮液中侵染30s-60s，7d后按上述方法重复转化一次，共侵染3次，收获成熟种子。

3、转基因拟南芥的筛选

a、将消毒后的转基因拟南芥成熟种子在4℃冰箱内春化3d，然后点播在ms培养基平板上(含50mg/l潮霉素)，平板密封后置于22℃的恒温培养箱中，8-15d后观察出苗情况。

b、将长势健壮的阳性苗移栽到基质土中，覆盖保鲜膜以保证其生长前期所需的湿度，到苗正常生长后揭去，最终获得t2代转基因种子。

4、转基因植株的分子鉴定

以转基因拟南芥的dna为模板，用潮霉素序列的引物进行pcr扩增，所用引物序列为：

hgy-f:5′-gtgctttcagcttcgatg-3′(seqidno:7)；

hgy-r:5′-aaccaagctctgatagag-3′(seqidno:8)；

pcr扩增程序如下：95℃5min；95℃50s，53℃50s，72℃40s，30个循环；72℃10min。预期产物片段大小约为750bp。

实施例2

1、转基因植株的耐盐和耐旱性分析

将野生型和实施例1步骤4筛选出的过表达ibbam1a的转基因拟南芥种子种在培养基上，待拟南芥子叶完全展开后，选择长势良好且一致的野生型植株和转基因植株，小心地转移到含有125mmnacl或300mm甘露醇的ms培养基上，直立培养2w后观察叶片的生长状态和根的发育情况。由图1可知：在正常ms培养基上，野生型拟南芥与转基因植株均长势良好，并无明显差别；在含有300mm甘露醇的ms培养基上，模拟干旱胁迫，从图1中可观察到野生型地上部有的已干枯发黄，而转基因株系叶片仍然生长良好，野生型的茎长和根系长度也明显小于转基因株系；在含有125mmnacl的ms培养基上，野生型受高盐胁迫地上部有轻微的花青素积累，根系也明显短小，转基因株系的叶片虽然也有变黄的迹象，但相对于野生型来说受盐胁迫影响较小，并且根系也长于野生型，转基因株系整体生长状况优于野生型(图1)。

将子叶完全展开，长势良好且一致的拟南芥野生型和过表达ibbam1a的转基因株系转移到基质土中，一次浇足水，正常生长10d后开始进行自然干旱和300mmnacl溶液胁迫处理，胁迫处理2w后观察植株的生长状态。由图2可知，正常情况下，拟南芥野生型植株和转基因株系均能正常生长，且生长状态并无明显差异；在自然干旱2w后，野生型植株叶片干枯变黄，而转基因株系叶片虽有轻微发黄，但长势仍比野生型健壮；用300mmnacl溶液灌溉拟南芥野生型和转基因株系，发现野生型植株叶片全部变为紫色，甚至枯萎死亡，转基因植株叶片虽有轻微发黄、变紫，但长势总体优于野生型(图2)。

2、转基因植株在盐和干旱胁迫后生理生化指标和品质性状的测定

将实施例1步骤4鉴定出的过表达ibbam1a(oe-1和oe-2)和野生型(wt)拟南芥苗栽种到基质土中，种植2w后用300mmnacl溶液处理幼苗，待幼苗出现明显表型变化后(约2-3w)取叶片测定其sod、β-淀粉酶活性和mda、麦芽糖含量。将鉴定出的转基因苗和野生型拟南芥苗栽种到基质土中，一次浇足水，待基质土变干幼苗开始缺水时计时，待幼苗出现明显表型变化后(约2-3w)取叶片测定其sod、β-淀粉酶活性和mda、麦芽糖含量。之后再对干旱胁迫处理后的幼苗覆水2-3次，观察植株的表型变化。

由图3和图4可知：对正常生长和干旱、盐胁迫2w的拟南芥野生型植株(wt)和转基因株系(oe-1和oe-2)进行sod活性与mda含量测定，结果显示，在正常情况下野生型拟南芥和转基因株系的sod活性与mda含量均没有显著性差异；盐胁迫处理后，转基因株系的sod活性显著高于野生型，mda含量显著低于野生型。

对盐和干旱胁迫下的野生型拟南芥(wt)和转基因株系(oe-1和oe-2)进行β-淀粉酶活性、麦芽糖含量和总淀粉含量检测，由图5～7可知，在正常情况下，野生型拟南芥和转基因株系的β-淀粉酶活性和麦芽糖含量均较低，总淀粉含量较高，且无显著性差异。当受到盐和干旱胁迫后，转基因株系的β-淀粉酶活性显著增加，总淀粉含量下降，相应的麦芽糖含量显著升高。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。