在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法。

背景技术：

马铃薯y病毒(potatovirusy,pvy)是危害最为严重的植物病毒之一，其广泛的分布在世界各地的马铃薯和烟草种植区。pvy侵染马铃薯和烟草后，会引起叶脉坏死、叶面黄化褪绿、块茎环斑坏死等症状，导致马铃薯和烟草种质退化，产量降低，给马铃薯和烟草的生产造成严重损失。

pvy是马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)代表成员，病毒粒体呈弯曲线状，其基因组由正义单链rna构成，长约9.7kb，包含一个大的开放阅读框(openreadingframe,orf)，两端含有非编码区(untranslatedregions，utrs)。在进行翻译时，开放阅读框先编码一个多聚蛋白(polyprotein)，之后再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白切割加工为p1、hc-pro、p3等10个成熟蛋白。此外，pvy基因组内还有一个通过+2相位移码翻译产生的蛋白-pipo，该蛋白与p3蛋白的n’端以p3n-pipo融合形式存在。最终，pvy基因组通过这两种方式生成11个成熟的多功能蛋白。

pvy分离物具有显著的株系多样性，其株系类型包括非重组株系，如pvyⁿ、pvy^o、pvy^c、pvy^e等和重组株系，如pvy^n:o、pvy^nw、pvy^n-wi、pvy^ntn-nw等。其中pvy^ntn-nw株系会造成马铃薯块茎环斑坏死症状和烟草叶片皱缩坏死症状，严重影响马铃薯和烟草的产量与品质。

植物病毒侵染性克隆是病毒致病机制和病毒与植物互作等研究的重要技术手段。目前已成功构建的马铃薯y病毒属病毒侵染性克隆有二十余种，如大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，smv)、马铃薯a病毒(potatovirusa，pva)、芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus，tumv)等。然而该属仍有很多病毒无法顺利构建侵染性克隆。除此之外，传统构建侵染性克隆的方法中涉及到多个亚克隆和酶切酶连步骤，这些步骤会增加病毒序列突变的潜在可能性以及引入非病毒核苷酸，从而影响病毒的侵染、转录等生物学特性。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种经修饰马铃薯y病毒cdna。

本发明的第二目的在于提供经修饰马铃薯y病毒cdna的互补核苷酸序列。

本发明的第三目的在于提供经修饰马铃薯y病毒cdna的rna转录物。

本发明的第四目的在于提供一种载体或原核细胞。

本发明的第五目的在于提供一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种经修饰马铃薯y病毒cdna，在马铃薯y病毒cdna内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；

该内含子用于降低或消除类原核启动子区的启动子活性，所述经修饰马铃薯y病毒cdna编码的氨基酸序列与马铃薯y病毒编码cdna的氨基酸序列相同。

进一步地，所述马铃薯y病毒为pvy^ntn-nw株系，优选为jl-w1；

优选地，所述类原核启动子区的序列如seqidno.1所示。

进一步地，内含子为马铃薯内含子，优选为序列如seqidno.2的内含子。

进一步地，内含子插入位点的两端的任意端均至少有一个碱基与内含子在马铃薯基因组的位点相同；

优选地，含有内含子的类原核启动子区序列如seqidno.3所示。

上述经修饰马铃薯y病毒cdna的互补核苷酸序列。

上述经修饰马铃薯y病毒cdna的rna转录物。

一种载体，含有上述经修饰马铃薯y病毒cdna或互补核苷酸序列。

一种原核细胞，含有上述载体；

优选地，原核细胞包括大肠杆菌。

一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法，将上述经修饰马铃薯y病毒cdna引入原核细胞，通过在原核细胞内复制经修饰马铃薯y病毒cdna来增殖功能性马铃薯y病毒。

进一步地，所述原核细胞包括大肠杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过在马铃薯y病毒cdna的类原核启动子区插入内含子，可以降低或消除类原核启动子区的启动子活性，同时，与马铃薯y病毒编码cdna的氨基酸序列相比，经修饰马铃薯y病毒cdna编码的氨基酸序列并未改变。该方案改善了现有技术中马铃薯y病毒cdna对原核细胞的固有毒性，避免马铃薯y病毒对原核细胞生长产生影响，提高马铃薯y病毒cdna的产率，同时不改变马铃薯y病毒rna转录物的感染性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中jl-w1类原核启动子分析图；

图2为本发明实施例2中重组质粒p35s-pvy-ina、p35s-pvy的结构图；

图3a为本发明实施例2中重组质粒p35s-pvy-ina转化培养后菌落生长；

图3b为本发明实施例2中重组质粒p35s-pvy转化培养后菌落生长；

图4为本发明实施例3中提质粒电泳验证结果，其中，m：dna分子标准；1-12：质粒z1-12；

图5为本发明实施例3中bamhi、psti单酶切电泳检测结果，其中，m：dna分子标准；1-12：质粒z1-12bamhi单酶切；13-24：质粒z1-12psti单酶切；

图6为本发明实施例4中植物生长情况，其中，a：健康植株(阴性对照)；b：基因枪接种植株(接种质粒p35s-pvy-ina)；c：摩擦接种植株(b植株叶片研磨液)；d：摩擦接种(大田感染pvy^ntn-nw植株叶片研磨液，阳性对照)；

图7为本发明实施例5中rt-pcr检测结果，其中，m：dna分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种植株；3：摩擦接种植株；4：阳性对照；5：以p35s-pvy-ina重组质粒为模板扩增片段；

图8为本发明实施例5中elisa检测结果；

图9为本发明实施例5中westren-blot检测结果，其中，m：蛋白分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种；3：摩擦接种；4：阳性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种经修饰马铃薯y病毒cdna，在马铃薯y病毒cdna内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；

该内含子降低或消除了类原核启动子区的启动子活性，经修饰马铃薯y病毒cdna编码的氨基酸序列与马铃薯y病毒编码cdna的氨基酸序列相同。

马铃薯y病毒基因组中含有类原核启动子元件(prokaryotic-promoter-likeelements)，直接将病毒基因组引入原核宿主细胞，该元件会导致病毒表达自身所编码的蛋白，该蛋白对原核细胞致死，对此，本发明通过在类原核启动子区引入内含子破坏其结构，可以降低或消除类原核启动子区的启动子活性，从而阻断病毒蛋白在原核细胞中表达，同时，由于引入的内含子在植物体内可以被切除，所以编码的氨基酸序列没有改变，也没有破坏马铃薯y病毒的功能。该方案改善了现有技术中马铃薯y病毒cdna对原核细胞的固有毒性，避免马铃薯y病毒对原核细胞生长产生影响，提高马铃薯y病毒cdna的产率，同时不改变马铃薯y病毒rna转录物的感染性。

需要说明的是，本发明中，马铃薯y病毒cdna内一个类原核启动子区中含有一或多个内含子，或者，马铃薯y病毒cdna内多个类原核启动子区中均独立地含有一或多个内含子，具体地形式不作限定，实现内含子降低或消除类原核启动子区的启动子活性，但是氨基酸序列不被破坏即可。

在优选地实施方式中，马铃薯y病毒为pvy^ntn-nw株系，优选为jl-w1。jl-w1为发明人于2018年采集自吉林省长春市马铃薯主要种植区，分离鉴定得到的马铃薯y病毒，genbank登录号：mn607713。

在优选地实施方式中，针对jl-w1病毒，发明人经分析鉴定确定了该病毒的类原核启动子区，具体序列如seqidno.1所示。经试验发现，通过在该类原核启动子区插入内含子确实可以实现沉默启动子活性的目的，避免该类原核启动子区的表达影响原核细胞的生长和增殖。

gggtccacaatatcaccttttagagaaggaggaatcataatgtctgag(seqidno.1)。

在优选地实施方式中，内含子为马铃薯内含子，优选为序列如seqidno.2的内含子。在本发明中，插入类原核启动子区的内含子优先选择马铃薯的内含子，例如，马铃薯y病毒为jl-w1病毒，在jl-w1病毒的类原核启动子区中插入内含子，该内含子优选为马铃薯自身的内含子，这样有利于后期该病毒在马铃薯植物中被有效识别和切除，从而不影响该病毒侵染和转录功能。

gtttgtttctgcttctacctttgatatatataataatatcattaattagtagtaaaataatatttccatttttttttcaaaataaaagaatgtaaattaaagcaattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttattacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtttag(seqidno.2)。

在优选地实施方式中，内含子插入位点的两端的任意端均至少有一个碱基与内含子在马铃薯基因组的位点相同。发明人经研究发现，在选取内含子的插入位点时，优选的位点为：根据选取的内含子在马铃薯基因组的位置，选取类原核启动子区中序列与基因组位置两端至少一个碱基相同的位点，例如，选取的内含子序列在马铃薯基因组中两端序列碱基一个为a碱基，另一个为t碱基，即a-内含子-t，该内含子在类原核启动子区的插入位点优选为at，插入后序列为a-内含子-t；又例如，选取的内含子序列在马铃薯基因组中两端序列碱基一个为cg碱基，另一个为gt碱基，即cg-内含子-gt，该内含子在类原核启动子区的插入位点优选为cggt，插入后序列为cg-内含子-gt。

在优选地实施方式中，含有内含子的类原核启动子区序列如seqidno.3所示。

gggtccacaatatcaccttttagagaaggtttgtttctgcttctacctttgatatatataataatatcattaattagtagtaaaataatatttccatttttttttcaaaataaaagaatgtaaattaaagcaattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttattacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtttaggaggaatcataatgtctgag(seqidno.3)。

本发明还保护经修饰马铃薯y病毒cdna的互补核苷酸序列，以及，经修饰马铃薯y病毒cdna的rna转录物。

本发明还保护一种含有经修饰马铃薯y病毒cdna或其互补核苷酸序列载体。以及，含有该载体原核细胞，该原核细胞优选为大肠杆菌。

一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法，将一个或多个内含子引入马铃薯y病毒cdna内一个或多个类原核启动子区，得到的经修饰马铃薯y病毒cdna引入原核细胞，通过在原核细胞内复制经修饰马铃薯y病毒cdna来增殖功能性马铃薯y病毒。该方法实现马铃薯y病毒的蛋白无法在原核细胞中翻译表达，从而依靠原核细胞的生长和增殖复制得到大量马铃薯y病毒，当马铃薯y病毒进入植物体内，内含子又可以被准确切除，得到原始的病毒，病毒的功能性没有遭到任何破坏。原核细胞可以为大肠杆菌等等。具体地，可以将一个内含子引入马铃薯y病毒cdna内的一或多个类原核启动子区，也可以为，将多个内含子引入马铃薯y病毒cdna内的一或多个类原核启动子区。此外，可以根据同源重组的原理，一次性将病毒的全基因组克隆成功，极大地简化构建过程。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实验材料及前期株系鉴定

pvy吉林分离物jl-w1(genbank登录号：mn607713)于2018年采集自吉林省长春市马铃薯主要种植区，前期经血清学鉴定、全基因组扩增、重组分析、系统发育分析、株系关联分析确定此分离物属于pvy^ntn-nw株系。

主要试剂

rneasyplantminikit为qiagen公司产品、reveraidfirststrandcdnasynthesiskit为赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)产品、bamhi、extaq、primestarhs(premix)、pmd18-tvectorcloningkit、dnamarker、为宝生物工程公司(takara)产品、axyprepdnagelextractionkit为爱思进生物技术公司(axygen)产品、in-fusionhdcloningkits为clontech公司产品、psti为fermentas公司产品。

实施例1构建策略

已报道的pvy^ntn-nw株系分离物syr-ⅱ-2-8(genbank登录号：ab461451)在p3基因中存在类原核启动子原件(图1，加粗下划线标记)，依据这一结果在pvy^ntn-nw株系分离物的jl-w1中也定位到了类原核启动子原件(图1，加粗下划线标记)，在该元件中间部位(图1，加粗斜体标记)插入seqidno.2的内含子a(introna/st-ls1/s.tuberosum)，破坏其结构，从而阻断病毒蛋白在大肠杆菌中的表达。

实施例2侵染性克隆各片段的扩增与连接

以实验室前期保存的jl-w1分离物cdna、马铃薯dna和含有花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子的质粒为模板，分别扩增病毒片段、内含子和载体片段。pcr扩增采用50μl反应体系：primestarhs(premix)25μl、模板1μl、正向引物(10μmoll-1)1μl、反向引物(10μmoll-1)1μl、超纯水22μl。pcr条件：98℃变性10s，退火10s(退火温度见表1)，72℃延伸若干分钟(延伸时间按1kb/min计算)，共30个循环。反应结束后，pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测后切取目的条带，利用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物于-20℃保存。

构建和验证侵染性克隆所用引物如下表1所示：

表1

*a、b：用于构建含内含子侵染性克隆的pvy片段；c、d：用于构建无内含子侵染性克隆的pvy片段；e：内含子片段；f：载体片段；括号中数字表示该片段在病毒基因组中的位置或片段大小。

在冰水浴中配置如下反应体系：

5×in-fusionhdenzymepremix2μl、载体片段f50-200ng、pvy片段a50-200ng、pvy片段b50-200ng、内含子片段e50-200ng，最后加水至(如果需要)20μl；

5×in-fusionhdenzymepremix2μl、载体片段f50-200ng、pvy片段c50-200ng、pvy片段d50-200ng，最后加水至(如果需要)20μl。

以上两个体系，反应条件均为50℃反应15min，然后置于冰上冷却。连接后的重组质粒p35s-pvy-ina、p35s-pvy如图2所示。将重组质粒转入大肠杆菌dh5α中，37℃200rpm振荡培养1h，取100μl菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养。隔天观察菌落生长状况，挑取单菌落接入含氨苄青霉素的培养基中，37℃200rpm振荡培养14-16小时，取5ml菌液提质粒。

重组质粒p35s-pvy-ina转化培养后，在lb固体培养基中有明显的菌落生长(图3a)；重组质粒p35s-pvy转化培养后，在lb固体培养基中未见菌落生长(图3b)。

实施例3重组质粒的鉴定

(1)酶切鉴定：每个所提取的质粒取5μl，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选符合预期大小的质粒。之后选用限制性核酸内切酶bamhi和psti，分别对符合预期大小的重组质粒进行单酶切验证。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

挑取单克隆菌落经进行质粒抽提，抽提结果经琼脂糖凝胶电泳分析，如图4所示(m：dna分子标准；1-12：质粒z1-12)，所提质粒均符合预期大小。

使用限制性内切酶对bamhi和psti对筛选出的阳性重组质粒分别进行单酶切验证，验证结果如图5所示(m：dna分子标准；1-12：质粒z1-12bamhi单酶切；13-24：质粒z1-12psti单酶切)，酶切后各片段大小符合预期。结合测序结果，筛选出了符合预期大小且未发生突变的重组质粒p35s-pvy-ina。

(2)测序鉴定：对酶切验证后符合预期大小的质粒，委托吉林省库美生物科技有限公司进行测序。测序获得的序列使用dnaman6.0软件等软件进行处理。

实施例4基因枪接种和摩擦接种

根据sj-500手提基因枪说明书对四叶期无毒本氏烟进行基因枪接种；取发病叶片加入pbs缓冲液充分研磨，将研磨液滴在叶片表面，使用钨粉对四叶期无毒本氏烟进行摩擦接种。

植物生长情况如图6所示(a：健康植株(阴性对照)；b：基因枪接种植株(接种质粒p35s-pvy-ina)；c：摩擦接种植株(b植株叶片研磨液)；d：摩擦接种(大田感染pvy^ntn-nw植株叶片研磨液，阳性对照))。使用基因枪将筛选出的重组质粒p35s-pvy-ina接种到四叶期无毒本氏烟上，四周后症状如图6中b图所示；取基因枪接种的发病植株叶片研磨液，对四叶期无毒本氏烟进行接种，四周后症状如图6中c图所示；将实验室留存的采集自大田的感染jl-w1分离物的马铃薯叶片摩擦接种的四叶期无毒本氏烟作为阳性对照，四叶期无毒本氏烟作为阴性对照。结果显示接毒植株均出现预期病害症状。

实施例5pvy侵染性克隆的鉴定

观察接种本氏烟的发病情况，对接种四周后的植株进行定性rt-pcr检测，elisa检测与western-blot检测。

(1)rt-pcr检测

接种四周后，取发病植株叶片，按照rneasyplantminikit试剂盒说明书提取总rna。以所提取的叶片总rna为模板，使用随机引物，按照反转录试剂盒说明书合成cdna第一链。pcr引物使用p3f、p3r，反应体系和反应条件参考extaq说明书，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行验证，验证后将目的片段纯化回收，与pmd-18t载体连接，并转化到dh5α感受态细胞中，经菌落pcr鉴定筛选得到的阳性克隆子，随机选择其中3-5个进行测序，验证内含子在植物体内是否被准确切除。

rt-pcr结果如图7所示，其中，m：dna分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种植株；3：摩擦接种植株；4：阳性对照；5：以p35s-pvy-ina重组质粒为模板扩增片段。目的条带符合预期大小，测序结果也显示p3基因中的内含子片段在植物体内被准确切掉。

(2)elisa检测

取100mg发病植株叶片，加入1ml包被液进行研磨，4℃，12000rpm离心10min，提取上清液，100μl/孔加入96孔板。37℃孵育1h，pbst洗脱3遍(阴性对照为健康本氏烟叶片)；5％脱脂奶300μl/孔，37℃封闭1h，pbst洗脱3遍；100μl/孔，加入5000倍稀释的检测抗体37℃孵育1h，pbst洗脱3遍；100μl/孔，加入5000倍稀释的酶标抗体37℃孵育1h，pbst洗脱6遍；100μl/孔，碱性磷酸酶显色液显色15min；100μl/孔，3mol/lnaoh终止反应；酶标仪检测样品od405值，当p/n值即检测值/阴性对照值大于2.1时，表示检测到该植株中的病毒蛋白。

接种四周后，以实验室制备的5000倍稀释后的马铃薯y病毒单克隆抗体3d3后作为检测抗体，5000倍稀释后的商品化鼠源抗体作为酶标抗体，对实验植株进行elisa检测，结果如图8所示，基因枪接种和摩擦接种结果p/n值均大于2.1，初步表明本实验所构建的侵染性克隆能够侵染植株并包装出病毒。

(3)western-blot检测

取100mg发病植株叶片，加入1mlpbs缓冲液进行研磨，4℃，12000rpm离心10min，取上清液16μl，5×sds4μl，配制为20μl，100℃煮沸5min，随后进行sds-page电泳。依据胶大小剪取膜和滤纸，先将滤膜浸入甲醇活化5s，然后和滤纸一起放入转移缓冲液中平衡10min。按照海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序每层放好后，用试管赶去气泡，胶对应负极面放置。加上转移缓冲液，恒流转膜，取出杂交膜。室温下，pbst缓冲液震荡洗膜5min，再将杂交膜置于5％脱脂奶溶液中，室温封闭1h。pbst缓冲液洗膜6次，将杂交膜浸入一抗中，室温震荡孵育过夜。pbst缓冲液洗膜6次，将杂交膜浸入酶标抗体中，室温震荡孵育1h，pbst缓冲液洗膜6次，dab显色，观察条带情况。

接种四周后，以实验室制备的5000倍稀释后的马铃薯y病毒单克隆抗体3d3后作为检测抗体，5000倍稀释后的商品化鼠源抗体作为酶标抗体，对实验植株进行western-blot检测，结果如图9所示，其中，m：蛋白分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种；3：摩擦接种；4：阳性对照。基因枪接种和摩擦接种结果均出现特异性免疫印迹，进一步表明本实验所构建的侵染性克隆能够侵染植株并包装出病毒。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

sequencelisting

<110>吉林省农业科学院

<120>在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法

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<170>patentinversion3.5

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gtttgtttctgcttctacctttgatatatataataatatcattaattagtagtaaaataa60

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tctaatatatgaccaaaacatggtgatgtttaggaggaatcataatgtctgag233

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