甘薯β-淀粉酶基因IbBAM1b、其编码的蛋白以及在降解淀粉中的应用的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b、其编码的蛋白以及在降解淀粉中的应用。

背景技术：

碳水化合物是自然界分布最广、含量最高、对动植物的生长发育具有关键作用的一类有机化合物，常以淀粉、蔗糖、纤维素等多种形式存在。其中，淀粉作为葡萄糖的高聚体，是植物中储量最丰富的非结构性碳水化合物。按照对淀粉的作用方式不同，淀粉酶可分为四类：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。β-淀粉酶(β-amylase)是一种外切水解酶，在非还原性末端作用于α-1,4-糖苷键，从而将淀粉转化成麦芽糖和极限糊精。糖类既可以作为一种供能物质为植物萌发、块根中养分储存以及生长发育提供能量，又能够作为信号分子调控植物的逆境响应。增加细胞内的可溶性糖含量，不仅能够提升果实口感，还是植物响应低温胁迫提高自身抗寒能力的重要途径。

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料及新型生物能源作物。β-淀粉酶作为甘薯块根中的重要蛋白质，通过参与淀粉的降解及转运，对其自身的生长发育、营养价值、叶片中光合作用、响应非生物胁迫都有着十分重要的作用。植物中β-淀粉酶活性高、耐热性强，其作为一种糖化剂，在食品工业、发酵工业和医药等行业中发挥着不可替代的作用。在啤酒酿造中，加入适量β-淀粉酶来替代麦芽，不仅能够减少麦芽用量，降低成本，而且β-淀粉酶作为一种外加糖化酶，能促进糖化的完全，提高原料利用率。在医学上，β-淀粉酶的产物—麦芽糖，其甜度低于蔗糖，并且在人体内不经胰岛素的作用也能被身体吸收，较适用于糖尿病人；另外，β-淀粉酶还可以和α-淀粉酶一起用于制作消化剂。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b、其编码的蛋白以及在降解淀粉中的应用，本发明将甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b在大肠杆菌中表达后，重组蛋白具有很强的β-淀粉酶活性，可以水解淀粉。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b，其序列如seqidno:1所示。

克隆上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b的引物对，所述引物对的序列如下：

p1：5′-attttacccatgagtttggcacacc-3′；

p2：5′-ccaggaggggagtctcttaatgcat-3′。

所述p1和p2分别与ibbam1b基因第1-25碱基、第1633-1672碱基对应。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b序列的载体。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b序列的表达盒。

含有上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b序列的重组菌。

上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b表达的蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

上述蛋白的表达方法，步骤如下：

(1)将权利要求1所述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b构建到原核表达载体中，转化表达菌株，筛选阳性重组菌；

(2)取阳性重组菌的菌液200μl加入到10mllb液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌体的od600＝0.6～0.8，加入异丙基硫代β-d-半乳糖苷至终浓度为1mmol/l，24℃220rpm振荡进行过夜诱导培养；4℃、5000rpm离心收集菌体，用磷酸缓冲液将菌体重悬，破碎，离心取上清液即为所述蛋白的粗提液。

在上述方案的基础上，所述原核表达载体为pet22b。

在上述方案的基础上，所述表达菌株为bl21(de3)。

上述甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b在降解淀粉中的应用。

上述蛋白在降解淀粉中的应用。

与现有技术相比，本发明技术方案的优点：

1、本发明从甘薯中克隆了β-淀粉酶基因ibbam1b；

2、将甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b在大肠杆菌中表达后，重组蛋白具有很强的β-淀粉酶活性，可以在体外水解淀粉。

3、重组β-淀粉酶ibbam1b在较高温度下可保持较稳定的酶活性。

附图说明

图1是ibbam1b基因的rt-pcr扩增，其中m：dnamarker,1-5：ibbam1b基因的rt-pcr扩增条带；

图2是pet22b-ibbam1b重组质粒的酶切鉴定，其中m：dnamarker,1-2：限制性内切酶hindiii和ncoi酶切pet22b-ibbam1b重组质粒的结果；

图3是平板圈水解法测定β-淀粉酶ibbam1b的淀粉酶活性，a-d为4次重复。

图4是β-淀粉酶ibbam1b的热稳定性分析。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1、甘薯ibbam1b基因原核表达载体的构建

(1)扩增甘薯ibbam1b基因

克隆所述甘薯ibbam1b基因的引物名称与序列如下：

p1：5′-attttacccatgagtttggcacacc-3′(seqidno:3)；

p2：5′-ccaggaggggagtctcttaatgcat-3′(seqidno:4)；

所述p1和p2分别与ibbam1b基因第1-25碱基、第1633-1672碱基对应。

在上述引物序列的5′分别添加hindiii和ncoi的酶切位点，用于构建原核表达载体的特异性引物对，添加酶切位点的引物对序列如下：

p3：5′-aagcttattttacccatgagtttggcacacc-3′(hindiii)(seqidno:5)；

p4：5′-ccatggccaggaggggagtctcttaatgcat-3′(ncoi)(seqidno:6)；

提取甘薯块根rna，以反转录的cdna为模板，用含有酶切位点的ibbam1b基因特异性引物进行rt-pcr扩增，扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。从图1中可以看出，基因的扩增产物长度约为1600bp。

上述甘薯品种为“烟薯25”，由青岛农业大学甘薯中心保存，由烟台农科院甘薯所选育，通过rt-pcr扩增了ibbam1b基因序列(其序列表如seqidno:1所示)，所述seqidno:1编码的氨基酸序列如seqidno:2所示。

seqidno:1

seqidno:2

mslahqigfisgtplevrtesvtreapakaaktaavsisplwrrtagearnlrisvqnlaakavlrggipadlavegedhkmgsrsrgvpvfvmmpldsvkmdhtmnrkkamnvslqalksagvegimvdvwwglvekdspreynwagysellemakkhalkvqavmsfhqcggnvgdscniplprwvteeinkdqdlvytdqwgrrnyeyvslgvdtlpvlkgrtpvqcysdfmgafrdefhhllgetiveiqvgmgpagelrypfypeqngtwkfpgigafqcfdkymvrslkgaaeaaghpewghsgptdageynswpedtnffrregggwnspygefflswysqmlldhgerilqpakssfegykdvkisvkvagihwhygtrshapeltagyyntrsrdgylpiaqmlarhdaifnftcvemrdheqpqhaqcapeklvkqvvlatrearvplagenalprfdgsafeqivsaaapkfgdgakmcaftylrmnpelfearnwiqfvgfvkkmkegeqrreceaehfvhsnesnpplmqealmh*

(2)甘薯ibbam1b基因与克隆载体puc18及原核表达载体pet22b的连接

回收步骤(1)中的pcr产物，并在t4dna连接酶作用下与克隆载体puc18(购买于takara)进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用hindiii和ncoi进行双酶切，回收含ibbam1b基因的酶切片段，并连接到原核表达载体pet22b(由青岛农业大学遗传研究室实验室保存)的对应酶切位点中。将10μl的连接产物转入大肠杆菌菌株bl21(de3)中，涂布于含有抗生素(100mg/lamp)的lb固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单克隆进行pcr、双酶切和测序鉴定，将携带该基因的原核表达载体命名为pet22b-ibbam1b。

用限制性内切酶hindiii和ncoi分别酶切原核表达载体pet22b-ibbam1b，得到了1600bp左右的目的基因小片段和5493bp的pet22b载体大片段(图2)。说明该基因已经连接到表达载体pet22b中，将该原核表达载体命名为pet22b-ibbam1b。

2、平板圈水解法测定β-淀粉酶活性

将鉴定出的阳性表达菌株接种于淀粉培养基上，37℃培养24h，滴加稀碘液进行染色，使碘液均匀分布于平板上。根据淀粉遇碘变蓝的特性，若菌株具有酶活性，能够产生淀粉酶分解菌落周围的淀粉，则该菌株附近的培养基不会被碘液染上颜色，在菌落周围就会有透明圈出现(图3)。测定各个重复菌落的直径和透明圈直径，根据水解圈面积与菌落面积比值的平均值初步确定菌株产淀粉酶活性的大小(表1)。

表1水解圈直径比较

3、热处理对重组淀粉酶活性的影响

(1)取阳性表达菌株的菌液200ul加入到10mllb液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌体的od600＝0.6～0.8，加入异丙基硫代β-d-半乳糖苷(iptg)至终浓度为1mmol/l，24℃低温220rpm振荡进行过夜诱导培养。4℃、5000rpm离心收集菌体，用磷酸缓冲液(ph＝6.0)将菌体重悬，在细胞破碎机上破碎。破碎程序为：200w,3s工作，6s间歇，破碎30min，破碎完毕后，4℃、5000rpm离心，上清即为粗酶液。

(2)将可溶性淀粉溶液2.5ml(新鲜配制)，和等体积的磷酸缓冲液加到试管中，充分混匀，40℃恒温水浴平衡10min。

(3)每个试管加入0.5ml粗酶液，摇匀，分别在45℃、55℃、65℃、75℃四个梯度条件下保温1h,期间每隔15min取样，每次反应结束后立即加入5ml0.1mhcl以终止反应，吸取0.5ml的上述混合液到新的试管中，加入5ml稀碘液混匀，立即于660nm波长下，用10mm玻璃比色皿迅速测定其吸光度(r)，以未进行热处理的酶液活力为100％(r0)，根据公式计算相对酶活力。

重组淀粉酶活力的计算

待测酶活＝100×d(r0－r)/r0

d：样品的稀释倍数

r0：对照吸光度值

r：待测酶液吸光度值

重组β-淀粉酶在45℃时保持良好的酶活稳定性，即使温度提高到55℃，1小时后仍有70％以上的酶活力(图4)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>甘薯β-淀粉酶基因ibbam1b、其编码的蛋白以及在降解淀粉中的应用

<130>2020

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1672

<212>dna

<213>甘薯(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>1

attttacccatgagtttggcacaccaaattggttttatttctggaacgccactagaggtc60

cgaacggaaagtgttacccgagaggcgccggcgaaggcggcgaagacggcggcggtgtcg120

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aatctggcggcgaaggcggtgctgagaggcggcattccggcggatctggcggtggagggg240

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ttgcagccagccaaatcaagttttgagggctacaaggatgttaaaatatcagttaaggtt1140

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gctgcagcaccgaaatttggcgatggcgcgaaaatgtgtgcgtttacttacttgagaatg1500

aacccggagttgttcgaggctcggaactggatacagtttgtggggtttgtgaagaagatg1560

aaggaaggggagcagagaagagagtgcgaggctgagcattttgtgcattcaaatgaatca1620

aatcctccattgatgcaagaagctctcatgcattaagagactcccctcctgg1672

<210>2

<211>548

<212>prt

<213>甘薯(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>2

metserleualahisglnileglypheileserglythrproleuglu

151015

valargthrgluservalthrargglualaproalalysalaalalys

202530

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859095

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100105110

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115120125

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355360365

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370375380

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385390395400

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450455460

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545

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>3

attttacccatgagtttggcacacc25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>4

ccaggaggggagtctcttaatgcat25

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>5

aagcttattttacccatgagtttggcacacc31

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(dioscoreaesculentalour.burkill)

<400>6

ccatggccaggaggggagtctcttaatgcat31