鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物、引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及鉴定鲟鱼性别的microrna血清标志物、引物组、试剂盒及其应用。
背景技术：
：鲟鱼是极其名贵的鱼类，由鲟鱼籽制成的鱼籽酱富含人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸、维生素等物质，营养价值极高，享有“黑色黄金”的美誉，在2013年其国际售价高达每千克800-900美元，因此雌性鲟鱼比雄性鲟鱼具有更高的经济价值。目前鲟鱼养殖和鱼子酱的生产作为新兴产业，在我国发展异常迅速，据初步统计，我国鲟鱼商品鱼养殖年产量已突破2万吨，占世界鲟鱼总产量的66.17%，占养殖总产量的72.46%，俨然已经是最大的鲟鱼养殖国和主要的鱼子酱出口国，有着巨大的市场潜力。如施氏鲟(acipenserschrenckii)是我国黑龙江水系特有珍稀名贵的大型经济鱼类。施氏鲟的人工繁育早在19世纪30年代开始，因其具有生长速度快、抗病力及适应性强等优点，上个世纪90年代以来已成为养殖鲟鱼中的杂交亲本和鱼籽酱生产的鲟鱼养殖产业中的重要养殖品种之一（weietal.,2011）。在养殖上能够在施氏鲟早期进行性别筛选，对雌、雄群体进行定向选育，可以获得更高的经济效益。但鲟鱼雌雄个体之间在青年期甚至成年期都没有明显的第二性征，从形态上无法辨别雌雄，且性成熟时间较长。不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼养殖产业化的快速发展。因此，鲟鱼性别鉴定的新技术是目前鲟鱼养殖产业可持续化发展的重点关注领域。microrna(mirna)是一类长度为22bp左右、高度保守的非编码小分子rna，主要通过与靶基因的3'末端非翻译区(3'utr)的完全或不完全配对，降解靶基因或抑制其翻译，从而参与广泛的生命活动进程，包括生长、分化、发育、肿瘤发生和配子形成等(ambros,2004;ryazanskyetal.,2014)。mirna在血清中能够长期稳定存在，不易被rna酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等极端条件均不会造成血清mirna的损失。更重要的是，新近研究表明血清中mirna表达谱的变化与肿瘤的组织密切相关，能够提示肿瘤的状态，因此，mirna作为一种有效的肿瘤标志物的新技术用于癌症的早期诊断、恶性分级、个性化诊疗和预后判断被重点关注，甚至mirna可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。新近研究表明mirna靶向性别决定和分化基因在动物雌雄二型性特征形成方面发挥着精确有效的重要调控作用(ryazanskyetal.,2014;fernandez-perezetal.,2018)。如在小鼠，mir-124调控精巢分化sox9基因(sry-boxcontaininggene9)决定卵巢细胞的命运(realetal.,2013)；mir-202-5p/3p受上游sox9基因的调控在精巢分化中起作用(wainwrightetal.,2013)；mir-19a/b靶向性别决定因子dmrt1(doublesexandmab-3relatedtranscriptionfactor1)在性逆转中发挥作用(liuetal.,2015)。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供鉴定鲟鱼性别的microrna血清标志物，所述的标志物为asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c的组合，各microrna的序列为如下所示：asc-mir-133-3p：ugguccccuucaaccagc（seqidno.2）；asc-mir-133a-3p：uuugguccccuucaaccagcug（seqidno.3）；asc-mir-130a-3p：cagugcaauauuaaaagggcau（seqidno.8）；dre-mir-34c：aggcagugcaguuaguugauuac（seqidno.11）。本发明的第二个目的是提供鉴定鲟鱼性别的检测引物组，包括用于检测所述的asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c的检测引物。优选，所述的asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c的检测引物为：asc-mir-133-3p的正向引物如seqidno.16所示；asc-mir-133a-3p的正向引物如seqidno.17所示；asc-mir-130a-3p的正向引物如seqidno.18所示；dre-mir-34c的正向引物如seqidno.19所示；反向引物为通用反向引物，序列如seqidno.20所示。本发明的第三个目的是提供上述的microrna血清标志物作为检测靶标在制备鉴定鲟鱼性别的试剂盒中的应用。本发明的第四个目的是提供上述的检测引物组在制备鉴定鲟鱼性别的试剂盒中的应用。本发明的第五个目的是提供一种鉴定鲟鱼性别的试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测所述的鉴定鲟鱼性别的microrna血清标志物含量的试剂。所述的试剂盒包括asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c的检测引物，具体为：asc-mir-133-3p的正向引物如seqidno.16所示；asc-mir-133a-3p的正向引物如seqidno.17所示；asc-mir-130a-3p的正向引物如seqidno.18所示；dre-mir-34c的正向引物如seqidno.19所示；反向引物为通用反向引物，序列如seqidno.20所示。优选，还包括逆转录茎环引物，具体为：asc-mir-133-3p的逆转录茎环引物如seqidno.12所示；asc-mir-133a-3p的逆转录茎环引物如seqidno.13所示；asc-mir-130a-3p的逆转录茎环引物如seqidno.14所示；dre-mir-34c的逆转录茎环引物如seqidno.15所示。所述的试剂盒还包括pcr技术常用的试剂。与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明为鲟鱼性别鉴定提供了新的检测方法。与现有技术相比，本发明检测血浆/血清中的稳定的性别相关的microrna，在定量测定方面，mirna的定量灵敏度和特异性非常高，使用实时定量pcr技术，可以有效区别鲟鱼的雌雄性别。利用本发明的鲟鱼性别鉴定的实时定量mirnapcr检测试剂盒的芯片方法检测，其检出率可达80%，可以有效区分未知幼龄鲟鱼样本的雌性和雄性，该鲟鱼种类不限于施氏鲟，对其它种类的鲟鱼例如西杂杂交鲟同样具有很好的检出率。此外本发明对鲟鱼进行性别鉴定是不需要剪取鲟鱼器官获取dna，对鲟鱼的伤害极低。本发明方法操作简单，重复性好，是鲟鱼性别高效早期鉴定
技术领域：
的新突破，适合推广应用，从根本上解决鲟鱼养殖产业中生产成本高、效率低等严重制约产业发展的问题。附图说明图1为荧光定量pcr检测36条mirna在雌、雄性施氏鲟血清中的表达量。图2为11种mirna的roc曲线。图3为检测引物在96孔pcr板（即鲟鱼性别鉴定的荧光定量mirnapcr检测芯片）的排列方式。其中，各简称分别代表的基因为如下：am133（asc-mir-133-3p）、am133a（asc-mir-133a-3p）、am130（asc-mir-130a-3p）、am34c（dre-mir-34c）、u6（内参基因u6）、5s（5srrna）。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明利用高通量小rna测序技术和microrna芯片技术，筛选出3龄施氏鲟性腺（精巢和卵巢）差异表达mirna种类和表达量，筛选其中36条mirna用于筛选施氏鲟性别的血清mirna标记物，通过常规的血清rna抽提、cdna的获得以及实时定量pcr等技术集合，建立了施氏鲟性别鉴定的血清mirna标记物新方法，并在低龄鲟鱼中验证，一定程度上可解决鲟鱼养殖产业的性别鉴定的困难，可促进支持鲟鱼养殖产业的可持续性和绿色健康发展。实施例11、施氏鲟性腺差异表达mirna的筛选将|log2(fc)|>2(fc,foldchange)的施氏鲟性腺差异表达mirna和性腺特异性保守表达mirna(dre-mir-34b和dre-mir-34c)，去除家族相似性100%mirna，保留36个mirna。mirna基因信息列表如下表1所示：表1.36个mirna基因序列信息2、采集血清取3龄施氏鲟一批，称体重、量体长和全长，其中性腺组织制作石蜡切片行苏木素伊红染色法进行组织观察，准确判定性别，尾部静脉采血，置于1.5ml的无菌ep管，室温静置30分钟，低温离心机3500rmp离心15分钟，分离并收集血清，-80℃冰箱保存，最后选取30尾性别确定（15尾雌性个体和15尾雄性个体）的施氏鲟血清用于后续步骤。3、血清mirna提取和逆转录提取试剂盒：tiangen公司的mircute血清/血浆mirna提取分离试剂盒（dp503），按照试剂说明书操作，提取30尾性别确定（15尾雌性个体和15尾雄性个体）的施氏鲟血清的mirna，用紫外分光光度计测定mirna的浓度和纯度。逆转录：将上步提取的mirna按照统一量并采用tiangen公司的mircute增强型mirnacdna第一链合成试剂盒（kr211）进行逆转录，获得逆转录产物。此步将加a尾反应和逆转录反应的整合实现了mirna的加a产物可全部进行进一步的逆转录反应，大大提高了低丰度mirna的检出率。4、荧光定量pcr以上述步骤获得的逆转录产物作为模板，分别对上述的36个施氏鲟性腺差异表达mirna以及内参基因u6进行相对定量pcr，按照tiangen公司的mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒（sybrgreen）(fp411)进行操作。mirna引物序列如下表2所示：表2.mirna检测引物序列荧光定量pcr反应条件：95℃15min；95℃15min，60℃30sec，72℃34sec，5个循环；94℃20sec，60℃34sec，45个循环；溶解曲线分析。5、结果分析u6作为检测内参，实时定量pcr结果以2-△△ct法分析，spss17.0利用两组之间独立样本t检验进行分析（independentsamplet-test），统计差异性显著意义（p<0.05）。结果表明asc-mir-107、asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-140-3p、asc-let-7g、asc-mir-10-5p、asc-mir-10b-5p、asc-mir-130a-3p、asc-mir-16-5p、asc-mir-223-3p和dre-mir-34c等11个mirnas呈现一致性的在雄性施氏鲟血清中显著上调，如图1所示。6、利用统计法，对上述11个mirna单独作为施氏鲟性别的鉴定进行效能评估，检测单个mirna作为鉴定施氏鲟性别的血清标记物的灵敏度和特异性，及对应的roc曲线，如图2和表3所示。表3.11种mirna单独区分施氏鲟性别的效能评价从图2和表3可以看出，各mirna诊断效能roc曲线下面积均在0.74以上，说明利用上述11种mirna可用于检测施氏鲟性别鉴定，具有一定的鉴定意义。7、进一步分三种情况进行统计分析：①将11个mirna联合；②以特异性指数>0.7的6个mirna(包括asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-let-7g、asc-mir-130a-3p、asc-mir-16-5p和dre-mir-34c)联合分析；③以特异性指数>0.9的4个mirna(包括asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c)联合分析，对综合指标的诊断效能进行评估，检测联合指标鉴定施氏鲟性别的roc曲线下面积、以及准确度和特异性，见表4。表4.多个mirna联合区分施氏鲟性别的效能评价mirna线下面积标准误渐进sig95%置信区间分界点灵敏度特异性11mirna联合0.8030.0270.0000.751-0.855>1.2000.8180.6566mirna联合0.8110.0360.0000.740-0.881>1.2000.8570.6364mirna联合0.8260.0420.0000.743-0.908>3.090.8040.955从表4可以看出，其中4个mirna(包括asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c)联合检测具有最高的区分效果，其诊断效能为：准确率（线下面积）达82.6%，其区分敏感度和特异性分别为80.4%和95.5%。8、鲟鱼性别鉴定的实时定量mirnapcr检测试剂盒的制备用于4个mirna(包括asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p和dre-mir-34c)的特殊专有逆转录的茎环引物：asc-mir-133-3p-rt：5'-ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgaggctggttg-3'；asc-mir-133a-3p-rt：5'-ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgagcagctggt-3'；asc-mir-130a-3p-rt：5'-ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgagatgccct-3'；dre-mir-34c-rt：5'-ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgaggtaatca-3'；鲟鱼性别鉴定的实时定量mirnapcr检测试剂盒的引物对分别保存在96孔pcr板中，引物对序列如下：asc-mir-133-3p-f：5'-acactccagctgggtggtccccttcaaccagc-3'；asc-mir-133a-3p-f：5'-acactccagctgggtttggtccccttcaaccagc-3'；asc-mir-130a-3p-f：5'-acactccagctgggcagtgcaatattaaaagggc-3'；dre-mir-34c-f：5'-acactccagctgggaggcagtgcagttagttgat-3'；通用反向引物：5'-ctcacagtacgttggtatccttgtg-3'。其中，上述优选的引物对分别保存在96孔pcr中的排列方式如图3所示，四个mirna基因简称asc-mir-133-3p（am133）、asc-mir-133a-3p（am133a）、asc-mir-130a-3p（am130）和dre-mir-34c（am34c）。当利用这块96孔pcr板（即鲟鱼性别鉴定的荧光定量mirnapcr检测芯片）检测样品时，我们可以根据设置的雌性血清（灰色区a1-a6）的对照和雄性血清（灰色区a7-a12）的对照的扩增情况，非常准确的同时得到待检血清样本的mirna的表达情况，从而对待检血清样本的性别做出准确的预测。这块96孔pcr板一次性用于14个鲟鱼个体，或者对7个鲟鱼个体（1个体同时检测2次）或最少4个鲟鱼个体（1个体同时检测3次）的性别同时检测。每个96孔pcr板孔中的引物对总量优选为1-20´10-12mol，其中上下游引物对的量相同。优选保存在2-8℃冰箱中。试剂盒其他成分：2´sybrpremixextaqtm，灭菌去离子水。将鲟鱼性别鉴定的荧光定量mirnapcr检测芯片和其他试剂封装好，与使用说明书一起置于盒中，构成检测试剂盒。9、试剂盒的检测验证应用选取1龄左右的施氏鲟和西杂杂交鲟各一批，其活体采集血清方法：鲟鱼离水后迅速转移至备好的冰上静置3-5min，目的是为了减少鲟鱼的应激反应，配合活体采血，使用5ml一次性使用无菌注射器（配0.6´25twlb针头）从鲟鱼尾部即距泄殖腔孔约0.5-1.0cm处以30-45角度进针，尾静脉采血1ml，放置1.5ml无菌离心管中，室温静置30-60min，于低温离心机3500rpm离心15min，收集上清液，放置2ml冷冻管中，-80℃冰箱保存。同时按照上述步骤2的方法检测鲟鱼的性别，筛选性别分化完全且性别确定的鲟鱼样本（包括施氏鲟雌雄各10尾和西杂杂交鲟雌雄各10尾），然后按照上述步骤3的方法抽提mirna，按照反转录试剂盒（takara公司,货号6210a）说明书操作方法，利用4个特异逆转录茎环引物（asc-mir-133-3p-rt、asc-mir-133a-3p-f、asc-mir-130a-3p-f、dre-mir-34c-f）分别获得4个microrna血清标志物asc-mir-133-3p、asc-mir-133a-3p、asc-mir-130a-3p、dre-mir-34c的cdna，pcr仪反应程序：42℃孵育60min；72℃保持15min；再降至4℃转移至-20℃冰箱保存。然后按照鲟鱼性别鉴定的实时定量mirnapcr检测试剂盒方法，20μl反应体系里包括1.0μlcdna、0.5μlmirna特异引物和0.5μl反向通用引物以及10μl2´sybrpremixextaqtm，其余用双蒸水补齐；pcr仪反应程序：95℃2min；40循环体系（95℃15sec，60℃30sec和72℃30sec）。，用性别双盲法检测。根据本发明上述4个mirna标记物的相对上下调和雌雄性血清对照的表达情况来判断未知鲟鱼样本的性别，判断标准：如果出现未知鲟鱼血清样本相比雌性对照血清的4个mirna标志物相对均显著上调，且相对表达倍数至少在2倍以上，判定为待检测鲟鱼样本为潜在雄性，否则认为待检测鲟鱼样本为潜在雌性，最后统计结果表明利用本发明的鲟鱼性别鉴定的实时定量mirnapcr检测试剂盒的芯片方法检测，对幼龄施氏鲟和西杂杂交鲟的检出率均可达80%，可以相对有效区分未知幼龄鲟鱼样本的雌性和雄性。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>广东省生物资源应用研究所<120>鉴定鲟鱼性别的microrna血清标志物、引物组、试剂盒及其应用<141>2020-04-13<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agcagcauuguacagggcuauc22<210>2<211>18<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ugguccccuucaaccagc18<210>3<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3uuugguccccuucaaccagcug22<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4accacaggguagaaccacgga21<210>5<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ugagguaguuguuuguacagu21<210>6<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acccuguagauccgaauuuguu22<210>7<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7uacccuguagaaccgaauuugu22<210>8<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cagugcaauauuaaaagggcau22<210>9<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9uagcagcacguaaauauuggcg22<210>10<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ugucaguuugucaaauacccc21<210>11<211>23<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aggcagugcaguuaguugauuac23<210>12<211>60<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgaggctggttg60<210>13<211>60<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgagcagctggt60<210>14<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgagatgccct59<210>15<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ctcacagtacgttggtatccttgtgatgttcgatgccatattgtactgtgaggtaatca59<210>16<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16acactccagctgggtggtccccttcaaccagc32<210>17<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17acactccagctgggtttggtccccttcaaccagc34<210>18<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18acactccagctgggcagtgcaatattaaaagggc34<210>19<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19acactccagctgggaggcagtgcagttagttgat34<210>20<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ctcacagtacgttggtatccttgtg25当前第1页12