抗H5亚型禽流感病毒的重组抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及重组抗体，尤其涉及抗禽流感病毒的重组抗体，属于生物制药领域。
背景技术：
：在2017年1月至2018年上半年期间，国家禽流感参考实验室对国内重点省市的家禽养殖场、屠宰场和活禽市场进行了禽流感的主动监测和临床样品收集。先后对养殖场、屠宰场和活禽市场中的家禽群体或市场摊位采集咽喉和泄殖腔拭子样品、集环境样品和野鸟样品。通过对h5亚型禽流感病毒进行了ha基因序列分析，发现这些禽流感病毒ha主要分属于2.3.2.1和2.3.4.4这2个大的分支。其中，h5n1亚型2.3.2.1分支病毒a/chicken/liaoning/sd007/2017(简写为ck/ln/sd007/17)位于ha进化分支中部，其血清与监测到的h5亚型2.3.2.1分支病毒均具有良好的hi抗体反应性，是具有良好代表性的毒株，可以作为该分支流行株的代表。为了检测新出现的2.3.2.1分支h5亚型禽流感病毒，需要有相对应的特异性抗体。同时疫苗免疫后，利用血凝抑制试验、竞争elisa等方法检测抗体水平时候，也需要用到特异性抗体标定抗原或者竞争与抗原反应的抗体。目前用于检测的抗体是通过免疫实验动物获得的多克隆抗体，采用这种方法制备抗体需要使用大量的spf鸡，不同批次spf鸡制备的抗体还会因为采血、血清分离、收集等繁琐的操作过程出现批间误差。为了改进抗2.3.2.1分支h5亚型禽流感病毒抗体的制备技术，本发明提供一种可以应用于2.3.2.1分支h5禽流感的诊断以及应用于抗体水平测定的重组单抗。技术实现要素：发明人实验室以ck/ln/sd007/17(h5n1)为ha基因和na基因为两个表面基因供体，并且通过定点突变和删除了ha基因裂解位点决定其高致病力所必须的连续碱性氨基酸，以流感病毒a/pr/8/34株(h1n1)为6个内部基因供体，利用反向遗传操作技术，人工构建出的用于h5亚型灭活疫苗种毒，命名为re-12株(商品名“禽流感病毒re-12血凝抑制抗原”)。通过一系列的生物学特性研究和免疫学分析，该毒株作为灭活疫苗的种毒株应用于生产实践中，取得了非常好的免疫预防效果。本发明在h5亚型禽流感病毒的re-12株的基础上，获得了抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白的重组表达的抗体，解决抗体制备离不开实验动物、抗体质量不稳定等技术瓶颈问题，同时还可以永久保留单克隆抗体序列信息，防止杂交瘤细胞不稳定丢失单抗反应性能的问题。因此，本发明首先提供一种重组单克隆抗体(重组单抗)，该重组单抗可以用于h5亚型禽流感病毒的诊断，应用于竞争elisa等方法对抗体水平的检测，以及对特异性抗体标定抗原或者竞争与抗原反应的抗体的检测。所述h5亚型禽流感病毒进一步包括根据ha基因序列进行分型的各种h5亚型禽流感病毒，更进一步包括2.3.2.1和2.3.4.4的h5亚型禽流感病毒分支。进一步，本发明的重组单抗是通过能分泌特定抗体的b细胞和瘤细胞融合后得到的杂交瘤细胞产生的抗h5亚型禽流感病毒单克隆抗体，进一步所述单克隆抗体应用测序技术测得包括5'和3'端完整序列的重链与轻链序列，将所得到的重链与轻链全序列克隆到表达载体上，转染细胞后获得抗h5亚型禽流感病毒重组表达的重组单体。进一步，本发明的杂交瘤细胞产生的是抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白单克隆抗体。进一步，本发明的重组单抗是抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白的重组表达的抗体。优选表达载体是真核表达载体，更优选是载体pcdna3.1。优选转染细胞是真核细胞，更优选是中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell,cho)。进一步，本发明的重组单抗包括序列为seqidno:1的重链和序列为seqidno:2所示的轻链。更进一步，本发明提供一种抗体组合物，该组合物包含重组抗h5亚型禽流感病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列为seqidno：1所示，轻链可变区的氨基酸序列为seqidno:2所示。其次，本发明提供一株杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞通过禽流感病毒纯化蛋白免疫小鼠后，制备的杂交瘤细胞，用禽流感病毒抗原进行筛选，获得一株命名为22g3的具有特定免疫性能的杂交瘤细胞(保藏编号：cctccno:c2020145)。进一步，用于免疫小鼠的禽流感病毒纯化蛋白是h5亚型禽流感病毒纯化蛋白，优选是禽流感病毒h5亚型re-12株纯化蛋白。更进一步，用于筛选杂交瘤细胞的禽流感病毒抗原是h5亚型禽流感病毒，优选是禽流感病毒h5亚型re-12株。更进一步，本发明的杂交瘤22g3细胞含有序列为seqidno:1的重链和序列为seqidno:2所示的轻链。22g3单抗重链可变区种系为ighv6，包括三个互补决定区(cdr)(如seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5所示)所示，22g3单抗轻链可变区种系为igkv8，包括三个cdr(如seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8所示)所示，更进一步，本发明继续提供22g3杂交瘤细胞的制备方法，所述方法包括用h5亚型禽流感病毒的re-12株纯化蛋白免疫小鼠，取免疫效价最高的的小鼠的脾细胞和sp2/0细胞细胞混合培养，获得融合的杂交瘤细胞，利用hi试验方法筛选阳性杂交瘤细胞，用re-12抗原进行筛选，获得有血凝抑制活性且不与其它亚型以及h5亚型其它分支病毒反应的单抗共35株，其中效价最高的一株命名为22g3，属于igg亚型。更进一步，本发明继续提供上述重组单抗的制备方法，其包括如下步骤，将22g3杂交瘤细胞的重链与轻链全长基因通过双酶切，与真核表达载体pcdna3.1连接，构建表达质粒，重链与轻链同时通过瞬时共转染cho细胞，检测重组抗体表达情况，有荧光产生则表明抗体已成功表达，所表达的重组单抗命名为r22g3。再次，本发明还提供所述的抗h5亚型禽流感病毒的重组抗体在诊断h5亚型禽流感病毒疾病中的应用，h5亚型禽流感病毒进一步包括根据ha基因序列进行分型的各种h5亚型禽流感病毒，更进一步包括2.3.2.1和2.3.4.4的h5亚型禽流感病毒分支，更进一步优选抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白的重组抗体。本发明继续提供h5亚型禽流感病毒的重组抗体可用于对h5亚型re-12分支aiv的抗原抗体监测及免疫保护的评价。本发明提出的抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白的重组抗体为进一步建立高效检测禽流感的方法提供了依据，同时也为研究ha蛋白的结构和功能奠定了基础。以此重组抗体为基础建立的h5亚型aiv抗体检测方法可用于对h5亚型re-12分支aiv的抗原抗体监测及免疫保护的评价。本发明的22g3杂交瘤细胞已于2020年08月17日向cctcc-中国典型培养物保藏中心提供了生物保藏，保藏物名称：杂交瘤细胞株22g3，保藏号：cctccno:c2020145。附图说明图1：22g3重链可变区抗体重排结果图2：22g3轻链可变区抗体重排结果图3：22g3表达载体转染cho细胞后ifa验证抗体表达情况图4：22g3表达载体转染cho细胞后westernblot结果：(注：m：marker；1：22g3腹水纯化的抗体原倍煮样；2：22g3腹水纯化的抗体原倍未煮样；3：10倍稀释后腹水纯化的抗体煮样；4：22g3腹水纯化的抗体原倍未煮样；5：r22g3体外重组表达的细胞上清煮样。)图5：竞争elisa分析不同样本对r22g3重组抗体的抑制率具体实施方式通过以下实施例，对本
发明内容做详细示例性说明。实施例1：分泌抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白单抗的杂交瘤细胞的制备首次免疫用100μg/每只的h5亚型re-12株全病毒纯化抗原与等量的弗氏完全佐剂乳化免疫6-8周龄balb/cspf小鼠，首次免疫后分别间隔两周，用100μg/每只的抗原剂量与等量的弗氏不完全佐剂乳化，继续三次免疫。最后一次免疫两周后采血测定效价，取效价高的小鼠断颈处死。把小鼠的四肢固定，在腹部皮肤剪开一小口，暴露腹膜。剪开腹膜，暴露腹腔，找到脾脏。摘除脾脏上粘连的脂肪组织，将脾脏的两端各剪开一小口后置于研磨器。加入3ml1640基础培养基于研磨器，研磨至脾细胞全部变至白色后取出研磨棒。再加入10ml1640基础培养基，静置2min，将上层细胞悬液小心的吸取10ml至50ml离心管，继续加入10ml1640基础培养基。此操作重复2次，最后将剩余不含组织的细胞悬液吸取；1000rpm、室温离心10min，用10ml基础1640培养基，于5％co2、37℃培养箱放置。将sp2/0细胞从瓶壁上轻轻吹下，通过计数的方式取2×107个细胞。将计好数的sp2/0细胞加至10ml免疫脾细胞中并混匀，以1000rpm、室温离心8min；弃上清，再利用灭菌的滤纸吸干，轻轻敲击管底；将1640基础培养基和50％peg于37℃水浴锅中预热，再将细胞混合物的离心管于39℃水浴锅中融合。在1min内慢慢滴入50％peg0.7ml，边加边搅拌；继续搅拌30s，静置30s；慢慢滴入1640基础液共10ml，用量安排依次为：第1min滴入1ml、第2min滴入lml、第3和4min滴入3ml、第5分钟滴入剩余的5ml，整个滴加过程均需缓慢，并不断轻轻地搅拌；整个滴加溶液过程不可超过10min。最后加入终止液；1000rpm、室温离心5min，弃上清；hat完全培养基(含饲养层细胞)与融合后的细胞混合，滴加至96孔细胞板中，250ul/孔，于5％co2、37℃培养箱培养。融合后第4天用ht完全培养基半换液。待细胞集落大多长至培养孔1/4时，用ht完全培养基换液，2天后可抗体检测。利用hi试验方法筛选阳性杂交瘤细胞。将筛选的阳性孔细胞进行至少三轮亚克隆并检测，直至所有检测孔为阳性或者确定为单个细胞株。使用上述筛选出的21株单抗制备腹水，并对纯化的腹水通过proteing柱子纯化，用纯化的抗体，以4μg/ml包被elisa板过夜，纯化抗体1μg/ml，鸡阳性血清1:50稀释，抗鼠二抗1:20000稀释，结果表明22g3单抗的竞争抑制率最高，选择该株单抗进行了后续的测序和重组表达工作。实施例2：抗禽流感病毒h5亚型re-12株ha蛋白单抗的测序用试剂盒提取实施例1制备的杂交瘤细胞22g3株总rna，按照如下组成进行反转录。反应条件为37℃15min，42℃45min，95℃5min。反转录后，进行pcr扩增，反应体系如下：反应条件为94℃10min；94℃30s，52℃1min，72℃2min，30次循环；72℃10min，4℃∞。扩增出部分片段后，用5'race，3'race方法扩增获得重链与轻链全长完整的片段，测序，得到全部序列(见图1和图2)。(将该序列在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/网页上分析可得22g3(图1和图2)重链与轻链抗体可变区重排情况，22g3单抗重链可变区种系为ighv6，包括三个互补决定区(cdr)(如seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5所示)所示，22g3单抗轻链可变区种系为igkv8，包括三个cdr(如seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8所示)所示。实施例3：重组抗体r22g3的体外表达按照如下组分扩增重链与轻链全长，22g3重链上游引物：acaaacacagaattcgaacactcacc，22g3重链下游引物：gctccaaggacactcgagtcat。22g3轻链上游引物：gacaggcaggggaattcag，22g3轻链下游引物：tggtggcgtctcgagacctttgtct。反应条件为98℃10s，52℃5s，72℃1min，30次循环；72℃10min，4℃∞。扩增出来的片段进行双酶切，用t4连接酶连接到pcdna3.1载体、转化dh5α感受态细胞、提取质粒，转染cho细胞。抗体重链与轻链同时进行共转染，同时设立阴性对照，37℃5％co2培养箱内培养6h后，换成10％fbs的dmem培养基，继续培养72h，收集细胞用4％甲醛固定，5％脱脂乳封闭，1％tritonx-100透化，fitc标记的抗鼠igg抗体孵育，在荧光显微镜下观察有荧光产生，说明抗体已成功表达，结果见图3；上清进行westernblot分析，结果观察到目的条带，说明抗体已成功表达，结果见图4。实施例4：重组抗体r22g3的竞争elisa实验1、收集转染的cho细胞，超声破碎，利用gehealthcare的hitraptmproteinahp过柱纯化。采用过碘酸钠法将纯化的重组抗体标记辣根过氧化物酶。2、包被：用5μg/ml纯化的re-12全病毒抗原包被elisa板，100μl/孔，加入96孔酶标板中，4℃过夜包被。3、洗板：倒掉酶标板中液体，用pbst洗涤3次，每次5min，在摇床上震荡洗涤。最后一次洗涤时，拍干酶标板底部的液体。4、封闭：用5％脱脂乳，200μl/孔，加入酶标板中，37℃封闭2h。5、洗板：倒掉酶标板中液体，用pbst洗涤3次，每次5min，在摇床上震荡洗涤。最后一次洗涤时，拍干酶标板底部的液体。6、竞争反应：将酶标重组抗体与待检血清等体积预混，100μl/孔，加入封闭后的酶标板中，37℃孵育1h。以阴性血清作为空白对照。7、洗板：倒掉酶标板中液体，用pbst洗涤3次，每次5min，在摇床上震荡洗涤。最后一次洗涤时，拍干酶标板底部的液体。8、显色：使用tmb显色液，等体积预混a液、b液，100μl/孔，室温避光10min。9、终止：使用0.25％hf，50μl/孔，终止显色。10、读数：在655nm波长下测定酶标板各孔od值。根据公式：pi＝(1-od655nm被检血清/od655nm阴性血清)×100％计算抑制率，(结果见图5)该重组抗体r22g3与2.3.2.1分支h5亚型流感病毒有血凝抑制反应与其他亚型以及2.3.4.4分支h5亚型流感病毒不反应，见表1。表1用hi试验分析重组抗体r22g3的特异性h1h2h3h4h6h7h8h9h10h11h12h13h14h15h5-2.3.4.4h5-2.3.2.1hinononononononononononononononoyes将禽流感re-12株病毒纯化蛋白包被elisa，用辣根过氧化酶标记重组单抗r22g3与spf血清、re-12、h5-2.3.4.4、h7、h9、ndv、ibv阳性血清，结果发现re-12阳性血清能特异性抑制r22g3与包被抗原的结合，通过待检样品的对拉跟过氧化酶标记r22g3重组抗体的抑制率可以判断被检样品是否含有re-12类血清抗体。<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)<120>抗h5亚型禽流感病毒的重组抗体及其制备方法和应用<160>8<210>1<211>1612<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>1　　gagacgcacaaccctggactcacaagtctttctcttcagtgacaaacacagaaatagaacactcaccatgtacttgggactgaactgtgtattcatagtttttctcttaaaaggtgtccagagtgaagtgaaacttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctttggattcactttcagtaattattggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattaaattgaaatctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatctattactgtactctcattactacggaactacactattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatgatcccagtgtccttggagccctcgggtcctacaggactctgacacctccctccccccctccccgtataaataaagcacccagcactgccttgggaccccgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa<210>2<211>1007<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>2　　agacaggcaggggaagcaagatggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacccgtggggacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttactctgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatagctatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttagagacaaaggtcctgagacgccaccaccagctccccagctccatcctatcttcccttctaaggtcttggaggcttccccacaagcgacctaccactgttgcggtgctccaaacctcctccccacctccttctcctcctcctccctttccttggcttttatcatgctaatatttgcagaaaatattcaataaagtgagtctttgcacttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa<210>3<211>24<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>3ggattcactttcagtaattattgg<210>4<211>30<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>4attaaattgaaatctaataattatgcaaca<210>5<211>45<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>5actctcattactacggaactacactattactatgctatggactac<210>6<211>36<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>6cagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactac<210>7<211>9<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>7tgggcatcc<210>8<211>27<212>prt<213>h5亚型禽流感病毒re-12株<400>8cagcaatattatagctatccgctcacg序列表当前第1页12