快速检测鸡球虫与组织滴虫的特异性引物、试剂盒及方法与流程

[0001]
本发明涉及一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的特异性引物、试剂盒及双重pcr方法，属于分子生物学技术领域。


背景技术：

[0002]
球虫病和组织滴虫病是禽中常见的寄生虫病。鸡艾美耳球虫(eimeria)是一种肠道寄生性原虫，发病时以引起出血性肠炎、腹泻、血痢、高发病率和高死亡率为主要特征，造成肠炎、腹泻、饲料转化率降低甚至鸡只死亡，对养殖业危害巨大；鸡球虫病发病率可高达80％，是集约化养鸡业最为多发、危害严重且防治困难的疾病之一。组织滴虫病又称盲“肠肝炎”或“黑头病”，是由火鸡组织滴虫(histomonas meleagridis)引起的禽类的一种原虫病，主要侵害火鸡和雏鸡，成鸡、孔雀、鹌鹑也易感染，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫横样粪便为主要特征，可引起家禽的生长发育迟缓、产蛋下降，能对养禽业生产造成巨大经济损失。
[0003]
球虫病和组织滴虫病极易发生混合感染，混感后造成家禽更高的死淘率，对家禽养殖业造成极为严重的危害。目前，球虫病和组织滴虫病的初步诊断主要依赖于流行病学调查、临床症状的观察和剖检。因此，提高检测技术，开展对球虫病和组织滴虫病的pcr检测技术研究，对于保障养禽业的健康快速发展具有重要的意义。
[0004]
多重pcr(multiplex pcr)技术是在普通pcr的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，实现同时对多个靶标进行辅助诊断的技术。目前已成功应用于生物学的多个方面。与常规pcr相比，多重pcr技术可满足同时检测不同dna序列的需要，操作省时省力，在大幅提升检测效率的同时还大大降低了检测成本。


技术实现要素：

[0005]
针对上述现有技术，本发明提供了一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的特异性引物、试剂盒及双重pcr方法。
[0006]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007]
一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的特异性引物，包括co5s/5a和tr11s/11a，其核苷酸序列如下所示：
[0008]
co5s：5
’-
aacggctaccacatctaa-3’；如seq id no.1所示；
[0009]
co5a：5
’-
cgaggtcctatcttattattc-3’；如seq id no.2所示；
[0010]
tr11s：5
’-
gaaactaaggcgaaagca-3’；如seq id no.3所示；
[0011]
tr11a：5
’-
cccagagcccatgaacta-3’；如seq id no.4所示。
[0012]
上述特异性引物在特异性检测球虫与组织滴虫中的应用。
[0013]
一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的试剂盒，包括上述特异性引物，还包括pcr反应所必需的试剂。
[0014]
上述试剂盒在检测球虫与组织滴虫中的应用。
[0015]
一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的双重pcr方法：提取待检测样品的dna；以dna为模板，利用上述特异性引物或试剂盒进行pcr扩增，得扩增产物；扩增产物进行凝胶电泳，依据凝胶电泳结果进行判断：若同时扩增出428bp和176bp的产物，则该样品为球虫和组织滴虫阳性；若单独扩增出428bp的产物，则该样品为球虫阳性，组织滴虫阴性；若单独扩增出176bp的产物，则该样品为组织滴虫阳性，球虫阴性；若未扩增出428bp和176bp的产物，则该样品为球虫和组织滴虫阴性。
[0016]
进一步的，所述pcr扩增的反应体系为：
[0017][0018]
进一步的，所述pcr扩增的扩增程序为：94℃3min，94℃30s，56.8℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
[0019]
本发明的特异性引物，是参考genbank上已发表的鸡球虫和组织滴虫的序列，选择在鸡球虫和组织滴虫的保守区分别设计一对特异性引物，该引物体系可特异性的对艾美尔球虫和组织滴虫进行特异性检测。本发明基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行检测的扩增基因方法体系，能够快速准确的对鸡球虫和组织滴虫进行检出，该方法可分别可最低检测到0.026ng球虫dna和0.35ng组织滴虫dna，说明该方法有较高的敏感性。
[0020]
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
[0021]
图1：引物的特异性检测电泳结果。
[0022]
图2：本发明鸡球虫和组织滴虫双重pcr检测电泳结果。
[0023]
图3：鸡球虫和组织滴虫双重pcr特异性检测电泳结果；其中，m-dl2000；1-球虫和组织滴虫；2-球虫；3-组织滴虫；4-新城疫；5-禽流感h9；6-腺病毒；7-传染性支气管炎；8-大肠杆菌；9-沙门氏菌。
[0024]
图4：球虫和组织滴虫双重pcr检测灵敏度结果；其中，m-dl2000；1-球虫26ng+组织滴虫35ng；2-球虫2.6ng+组织滴虫3.5ng；3-球虫0.26ng+组织滴虫0.35ng；4-球虫0.026ng+组织滴虫0.035ng；5-球虫0.0026ng+组织滴虫0.0035ng。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
[0026]
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
[0027]
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0028]
实施例1引物设计
[0029]
本实施例所述的检测鸡球虫特异性引物，是根据genbank中已登录的鸡球虫基因序列(jx312808.1、jx312811.1、jx093898.1、jx093899.1、jx093900.1、jx093901.1、ef175928.1、eu025110.1、eu025111.1、eu025112.1、eu025113.1、eu025114.1、eu025115.1、eu025116.1、dq136184.1、dq136183.1、dq136181.1、dq136176.1、ku192975.1、hg793040.1)，对比后取生物进化过程中具有高度保守性的18s rna基因，设计多对引物；本实施例所述的检测组织滴虫的特异性引物，是根据genbank中已登录的组织滴虫基因序列(af293056、aj920323.1、hg008077.1、hg008078.1、hg008079.1、hg008080.1、hg008081.1、hg008082.1、hg008083.1hg008084.1、hg008085.1、hg008086.1、hg008087.1、hg008088.1、hg008089.1、hg008090.1、hg008091.1、hg008092.1、hg008093.1、hg008094.1、hg008095.1、hg008096.1、hg008097.1、hg008098.1、jn390974.1、mh449665.1、eu647887.1、eu647885.1、eu647884.1)，对比后取生物进化过程中具有高度保守性的18s rna基因，设计若干对引物。经过条件优化发现，引物对(co5s/co5a和tr11s/tr11a)特异性、重复性好，灵敏度高(如图1所示，引物对10为本发明要求保护的引物，由图可知，引物对10从样品中同时扩增出了428bp和176bp的产物，条带清晰，无二聚体，而其它引物或条带大小不对或扩增不出目的条带或有杂带，效果不佳)，引物对10序列如下：
[0030]
co5s：5
’-
aacggctaccacatctaa-3’；
[0031]
co5a：5
’-
cgaggtcctatcttattattc-3’；
[0032]
tr11s：5
’-
gaaactaaggcgaaagca-3’；
[0033]
tr11a：5
’-
cccagagcccatgaacta-3’。
[0034]
实施例2核酸提取
[0035]
按常规方法提取鸡球虫与组织滴虫的感染组织的总dna。
[0036]
实施例3双重pcr条件优化
[0037]
对pcr反应用引物的浓度、退火温度进行优化，得到双重pcr最佳反应体系和反应程序。
[0038]
反应总体积为25μl，最佳反应体系为：2μl组织dna、1
×
taq pcr mix，引物co5s、co5a各0.5μl，tr11s、tr11a各3μl，加水补齐至25μl。扩增程序为：94℃3min；94℃30s，56.8℃30s，72℃20s共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，于2％琼脂糖凝胶电泳，90v，30min，观察结果如图2所示。
[0039]
如图2所示的结果，如果从样品中同时扩增出了428bp和176bp的产物，则该样品为球虫和组织滴虫阳性混感；如果从样品中单独扩增出了428bp的产物，则该样品为球虫阳性；如果从样品中单独扩增出了176bp的产物，则该样品为组织滴虫阳性，球虫阴性；如果样品未扩增出428bp和176bp的产物，则该样品不含有球虫与组织滴虫。
[0040]
实施例4特异性验证
[0041]
分别为鸡球虫与组织滴虫的混合dna、球虫dna、组织滴虫dna、腺病毒dna、大肠杆菌dna、沙门氏菌dna，禽流感h9rna、新城疫rna、鸡传染性支气管炎rna为模板，用上述优化条件进行双重pcr扩增，产物进行凝胶电泳，实验结果如图3所示。建立的双重pcr方法只能特异性的针对鸡球虫和组织滴虫的单独或混合感染进行扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为阴性，说明本发明特异性良好。
[0042]
实施例5灵敏度验证
[0043]
将球虫与组织滴虫的dna样品以10倍系列稀释，用上述优化的双重pcr方法进行扩增，结果见图4。本发明最低可检测到0.026ng球虫dna和0.35ng组织滴虫dna，本发明所述检测方法的具有较高的灵敏性。
[0044]
实施例6临床样品检测
[0045]
用建立的双重pcr方法对收集到的疑似球虫与组织滴虫感染病料进行检测，并与单重pcr结果进行比较，结果发现双重pcr检测结果与单重pcr检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重pcr方法检测结果准确性较高，适合鸡球虫与组织滴虫的快速鉴定。
[0046]
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。