使用紫外线制备生物相容的聚γ-谷氨酸水凝胶的方法与流程

使用紫外线制备生物相容的聚
γ-谷氨酸水凝胶的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及使用紫外线制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法，以及涉及通过该方法制备的生物相容的聚γ-谷氨酸水凝胶的用途。


背景技术：

[0002]
水凝胶通常是指具有三维亲水性聚合物网络的材料，其包含大量的水，并且由均聚物或共聚物制成，并形成几乎不受外力诱导的结构稳定的三维结构。由于该结构是由诸如氢键、共价键或物理聚集等各种因素形成的，因此水凝胶在水性溶液中溶胀后是热力学稳定的，并且具有与液体和固体之间的中间形式相对应的机械和物理化学性质。
[0003]
另外，可以根据聚合物的化学结构以及亲水性与聚合物链之间的交联程度对水凝胶的溶胀度进行调节，因此可以根据组成和制备方法，制造具有各种形状和性质的水凝胶。迄今为止，已经对水凝胶的物理化学性质进行了许多研究，并且结果，已开发了各种类型的水凝胶。
[0004]
水凝胶已在工业中用作化妆品材料，从主要基于超强吸水特性的卫生产品开始，目前，它已广泛用于许多领域，包括诸如药物递送系统、栓塞、组织工程支架等的药物应用，化妆品填充剂以及工业应用，并引入各种附加功能。
[0005]
聚γ-谷氨酸是具有γ-肽键的物质，并且它是由诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的gras(通常被认为是安全的)生产的天然氨基酸聚合物材料。正在以各种方式进行根据聚γ-谷氨酸在γ射线照射期间的性质的变化以及使用交联剂的水凝胶的开发、以及它们的工业化的各种研究。
[0006]
然而，由于观察到聚γ-谷氨酸水凝胶在诸如水或缓冲溶液的溶液中溶胀并溶解，因此需要研究和开发在溶液中保持其形态并以稳定状态存在的生物相容的聚γ-谷氨酸水凝胶。


技术实现要素：

[0007]
技术问题
[0008]
如上所述，通过γ射线照射交联的常规的聚γ-谷氨酸水凝胶具有在溶液中溶胀并溶解的问题，并因此为了解决根据化学交联方法的水凝胶毒性问题，本发明提供了通过使用紫外线照射进行交联来制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法。
[0009]
技术方案
[0010]
本发明提供了一种制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法，该方法包括：将聚γ-谷氨酸溶解在溶剂中(步骤1)；将n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵加入并溶解在步骤1的聚γ-谷氨酸的溶液中(步骤2)；以及，用紫外线对步骤2的溶液进行照射(步骤3)。
[0011]
本发明提供了通过上述制备其的方法制备的聚γ-谷氨酸水凝胶。
[0012]
本发明提供了包含该聚γ-谷氨酸水凝胶的组织工程支架。
[0013]
本发明提供了包含该聚γ-谷氨酸水凝胶的人造器官。
[0014]
另外，本发明提供了包含该聚γ-谷氨酸水凝胶的用于3d打印机的生物墨水组合物。
[0015]
有益效果
[0016]
根据本发明，使用紫外线照射制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法解决了聚γ-谷氨酸溶液中的微生物污染的问题，并且仅通过简单的处理工艺，以高收率生产聚γ-谷氨酸水凝胶，并且由于确认了该聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中具有改善的储存稳定性，因此可以提供通过本发明的制备其的方法制备的聚γ-谷氨酸水凝胶作为组织工程支架、人造器官和用于3d打印的生物墨水。
附图说明
[0017]
图1示出了在本发明中使用的聚γ-谷氨酸的凝胶渗透色谱(gpc)分析的色谱图。
[0018]
图2示出了在本发明中使用的聚γ-谷氨酸的凝胶渗透色谱(gpc)分析的分子量分布。
[0019]
图3是示出了用γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶的粘弹性的检查结果(a)以及根据本发明的聚γ-谷氨酸水凝胶的粘弹性的检查结果(b)的图。
[0020]
图4是示出了用γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的稳定性的观察结果(a)以及根据本发明的用紫外线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的稳定性的观察结果(b)的图。
具体实施方式
[0021]
在下文中，将对本发明进行详细描述。
[0022]
本发明的发明人已经进行了改善聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的稳定性的研究，并且确认了使用紫外线照射制备水凝胶的方法能够以高收率生产聚γ-谷氨酸水凝胶，而无需诸如回收工艺的处理工艺，并且可以解决聚γ-谷氨酸溶液中的微生物污染的问题，并具有改善聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的储存稳定性的效果，从而完成了本发明。
[0023]
本发明可以提供一种制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法，该方法包括：将聚γ-谷氨酸溶解在溶剂中(步骤1)；将n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵加入并溶解在步骤1的聚γ-谷氨酸的溶液中(步骤2)；以及，用紫外线对步骤2的溶液进行照射(步骤3)。
[0024]
更详细地，聚γ-谷氨酸的重均分子量可以为30-30,000kda，更优选为33,965-28,939,415da，但不限于此。
[0025]
另外，聚γ-谷氨酸能够以10w/v％-30w/v％，更优选20w/v％的含量被包含在溶剂中。
[0026]
步骤1中的溶剂可以是水。
[0027]
相对于作为聚γ-谷氨酸单体的谷氨酸的分子数，可以以1:1的分子比加入步骤2的n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵。
[0028]
更具体地，当n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵以低于所述添加比加入时，水凝胶性质降低，并因此不能产生正常的水凝胶。
[0029]
在照射紫外线的步骤3中，可以将能量为50-70mw/cm2的紫外线照射至步骤2的溶液。
[0030]
更具体地，从紫外线照射器到溶液的距离可以是30cm，并且可以在365nm的紫外线波长下照射2小时。此时，照射能量可以为50-70mw/cm2。
[0031]
当将紫外线照射到混合有聚γ-谷氨酸和n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵的溶液时，n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵键合至聚γ-谷氨酸，并在聚γ-谷氨酸分子之间发生交联，结果，可以生成聚γ-谷氨酸水凝胶。
[0032]
另外，制备水凝胶的方法可以进一步包括在室温下将在步骤3中用紫外线照射的溶液风干。
[0033]
所述聚γ-谷氨酸水凝胶可以被包含在具有改善的储存稳定性和粘弹性的人造器官、组织工程支架、化妆品材料或用于3d打印机的生物墨水组合物中。
[0034]
根据制备聚γ-谷氨酸水凝胶的方法，本发明可以提供聚γ-谷氨酸水凝胶。
[0035]
聚γ-谷氨酸水凝胶可以具有改善的储存稳定性和粘弹性。
[0036]
根据本发明的实施方式，为了确认通过紫外线照射或γ射线照射而制备的聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的稳定性，确认了水凝胶的形态随时间的变化。在风干之前，将通过上述方法制备的3g聚γ-谷氨酸水凝胶放入培养皿中，并进行风干以制备圆形凝胶，并将蒸馏水、20mm磷酸钾缓冲液(kpb；ph 6.0)、1
×
pbs、0.9％氯化钠(nacl)溶液和人工体液各自倒入凝胶中以浸没凝胶，然后在60％的湿度和25℃的温度下静置以确认形态随时间的变化。将通过以与上述相同的方式照射γ射线而制备的聚γ-谷氨酸水凝胶置于培养皿中，冷冻干燥并压碎，然后在各种溶液中确认形态随时间的变化。
[0037]
结果，如图4所示，确认了通过紫外线照射制备的聚γ-谷氨酸水凝胶的形态保持了8周，而通过γ射线照射制备的聚γ-谷氨酸水凝胶膨胀并溶解。
[0038]
由以上结果确认了，紫外线照射后的经风干的聚γ-谷氨酸水凝胶即使在溶液中也长时间地保持稳定性。
[0039]
因此，本发明可以提供包含具有改善的储存稳定性的聚γ-谷氨酸水凝胶的组织工程支架和人造器官。
[0040]
所述人造器官可以选自于由以下组成的组：人造皮肤、人造角膜、人造血管、人造尿道、人造小肠、人造支气管、人造肝脏、人造肾脏、人造骨骼、人造外周神经和中枢神经、人造膀胱、人造肌腱和人造软骨，但不限于此。
[0041]
另外，本发明可以提供包含所述聚γ-谷氨酸水凝胶的用于3d打印机的生物墨水组合物。
[0042]
实施例
[0043]
在下文中，将对实施例进行详细描述，以帮助理解本发明。但是，以下实施例仅旨在用于对本发明进行说明，但本发明的范围不限于以下实施例。本发明的实施例被提供以用于向本领域技术人员更完整地解释本发明。
[0044]
以下参考例旨在提供通常应用于根据本发明的每个实施例的参考例。
[0045]
参考例：实验材料
[0046]
本发明中使用的分子量为3,965da-28,939,415da的聚γ-谷氨酸(图1和图2)购自bioleaders(韩国，daejeon)，并且其批号为f1pb0316fk。
[0047]
n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵(目录号323-22842)购自wako pure chemical industries.ltd.(日本)，并且其分子量为220.74。
[0048]
实施例1：聚γ-谷氨酸水凝胶的制备
[0049]
1.聚γ-谷氨酸溶液的制备
[0050]
将30ml蒸馏水加入到100ml螺口瓶中后，放入磁棒，使用微量天平准确称量10g聚γ-谷氨酸(分子量为3,965da-28,939,415da)，并将其放入螺口瓶中，将溶液的体积调节至50ml，并通过在室温下以300rpm的搅拌速度搅拌24小时使混合物溶解。
[0051]
之后，用微量天平称取并加入17.11g的n,n,n-三甲基-3-[(2-甲基丙烯酰基)氨基]丙烷-1-铵，其为根据存在于聚γ-谷氨酸中的作为聚γ-谷氨酸的单体的谷氨酸的分子数，以1:1的分子比计算得到的计算量，然后在室温下以300rpm的搅拌速度搅拌24小时以使其溶解，从而制备20w/v％聚γ-谷氨酸溶液。
[0052]
2.通过uv线照射和干燥工艺制备聚γ-谷氨酸水凝胶
[0053]
用紫外线对实施例1中制备的20w/v％聚γ-谷氨酸溶液进行照射，以制备水凝胶。在uv线照射过程中，使用两个玻璃板和橡胶组装框架，并使用注射器将实施例1中制备的20w/v％的聚γ-谷氨酸溶液注入该框架的内部，然后照射uv线。
[0054]
用uv照射器以15cm的间距照射365nm波长的uv线2小时。此时的照射能量为50-70mw/cm2。将由此制备的高粘性溶液转移至培养皿，并在室温下风干以制备凝胶状水凝胶。
[0055]
比较例1：γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶的制备
[0056]
将kh2po4加入到5w/v％聚γ-谷氨酸溶液中以使其为0.1w/v％，并通过以20kgy的剂量照射γ射线，来制备经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶。
[0057]
实施例2：确认经紫外线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶的粘弹性
[0058]
使用流变仪确认实施例1和比较例1的通过用紫外线和γ射线照射而制备的聚γ-谷氨酸水凝胶的粘弹性。
[0059]
在从0.01hz至100hz的25个点处以0.8mm的间隙测量10ml的经风干的水凝胶的粘弹性。
[0060]
结果如图3所示，经紫外线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶在所有hz下均显示出高粘度和弹性，并且特别是在0.01hz至10hz的范围内，其粘度高于弹性，而且确认了用γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶的粘度和弹性显著较差，因此确认了通过上述方法制备的经紫外线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶表现出凝胶的特性。
[0061]
实施例3：确认聚γ-谷氨酸水凝胶分子的粒径
[0062]
使用微量天平称量1g通过对所制备的聚γ-谷氨酸水凝胶进行冻干和研磨而制备的聚γ-谷氨酸粉末，然后溶解在蒸馏水中以使最终体积达10ml，从而制备1％的聚γ-谷氨酸水凝胶溶液。使用超声波处理器以30％的输出量对所制备的1％聚γ-谷氨酸水凝胶溶液进行超声波处理，处理时间为1分钟，运行时间为1秒，且断开时间为2秒。取2ml所制备的溶液，并使用粒径测量装置对聚γ-谷氨酸水凝胶分子的粒径进行测量。
[0063]
结果，确认了聚γ-谷氨酸水凝胶分子的粒径为1054.0
±
243.9nm。
[0064]
实施例4：确认聚γ-谷氨酸水凝胶分子的表面电势和游离羧基
[0065]
使用微量天平称量1g通过对实施例1和比较例1中制备的聚γ-谷氨酸水凝胶进行冻干并研磨而制备的聚γ-谷氨酸粉末，并溶解在蒸馏水中以使最终体积达10ml，从而制备
1％的聚γ-谷氨酸水凝胶溶液。使用超声波处理器以30％的输出量对所制备的1％聚γ-谷氨酸水凝胶溶液进行超声波处理，处理时间为1分钟，运行时间为1秒，且断开时间为2秒。取2ml所制备的溶液，并使用表面电势测量装置对聚γ-谷氨酸水凝胶分子的表面电势进行测量。将所有实验组滴定至ph 4.8，其为聚谷氨酸(pga)的pka。在实验中，使用ph为4.8的1μmol/ml聚γ-谷氨酸溶液作为对照。
[0066]
结果如下表1所示，经紫外线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶分子的表面电势为-29.30
±
0.77mv，而经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶分子的表面电势为-35.18
±
1.72mv。
[0067]
作为使用所测定的表面电势计算水凝胶中余留的游离羧基的数量的结果，经uv线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶中的游离羧基的数量为4.5μmol/g，而经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶中的游离羧基的数量为14μmol/g。
[0068]
表1
[0069]
样品表面电势(mv)游离羧基的数量(ph 4.8)聚γ-谷氨酸溶液(1μmol/ml)-40.20
±
0.330.5μmol/ml经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶-35.18
±
1.7214μmol/g经uv线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶-29.30
±
0.774.5μmol/g
[0070]
结果，确认了比起经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶，经uv线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶具有更多的交联。
[0071]
实施例5：确认在溶液中的稳定性
[0072]
为了确认通过紫外线照射而制备的聚γ-谷氨酸水凝胶在溶液中的稳定性，与用γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶一起确认了水凝胶的形态随时间的变化。
[0073]
将3g经uv线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶置于培养皿中并风干以制备圆形凝胶，并将蒸馏水、20mm磷酸钾缓冲液(kpb；ph 6.0)、1
×
pbs、0.9％氯化钠(nacl)溶液和人工体液各自倒入以浸没凝胶，然后使其在60％的湿度和25℃的温度下静置，以检查形态的变化。
[0074]
另外，将kh2po4加入到5w/v％的聚γ-谷氨酸溶液中以使其为0.1w/v％，并以20kgy的剂量通过γ射线照射来制备经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶，然后冷冻干燥以制备粉末，并将该粉末溶解于蒸馏水中至15w/v％，以与上述相同的方式将3g经γ射线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶置于培养皿中，并将蒸馏水、20mm磷酸钾缓冲液(kpb；ph 6.0)、1
×
pbs、0.9％氯化钠(nacl)溶液和人工体液各自倒入以浸没凝胶，然后使其在60％的湿度和25℃的温度下静置，以确认形态的变化。
[0075]
结果如图4所示，确认了通过紫外线照射制备的聚γ-谷氨酸水凝胶的形态保持了8周，而通过γ射线照射制备的聚γ-谷氨酸水凝胶膨胀并溶解。
[0076]
由以上结果确认了，根据uv线照射的聚γ-谷氨酸水凝胶即使在溶液中也长时间地保持稳定性。
[0077]
尽管已经参考本发明的具体实施方式对本发明进行了具体描述，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，该具体描述仅是优选的实施方式，而本发明的范围不限于此。即，本发明的实际范围由所附的权利要求及其等同物限定。