一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途。


背景技术：

2.苹果(malus domestica)是世界上四大栽培水果之一，而中国是世界上拥有最大的种植面积和水果产量的国家，可满足人口众多的广阔市场消费需求。随着人们生活水平的提高，对水果质量的期望更是日益增加，功能性水果对消费者越来越有吸引力。功能性水果富含某些特殊营养元素，具有很强的抗氧化或抗癌活性。因此，筛选优质苹果不仅有益于人民健康，而且可以增加种植者的收入。
3.黄酮类化合物的生物合成首先通过苯丙烷途径将苯丙氨酸转化为香豆酰-coa，香豆酰-coa再进入黄酮合成途径与3分子丙二酰coa结合生成查尔酮，然后经过分子内的环化反应生成二氢黄酮类化合物。二氢黄酮是其他黄酮类化合物的主要前体物质，通过不同的分支合成途径，分别生成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等。植物类黄酮合成代谢主要有七大分支途径：花青素(anthocyanins)途径、原花青素(proanthocyanidins,pa)也就是浓缩丹宁(condensed tannins)途径、黄酮途径(flavones)、黄酮醇(flavonols)途径、异黄酮(isoflavone)和异类黄酮(isoflavonoids)途径、鞣酐(也叫鞣红,phlobaphenes)途径、橙酮(aurones)途径。
4.黄酮醇途径中，二氢黄酮类化合物能在黄烷醇-3-羟化酶(f3h)的作用下生成二氢槲皮素和二氢山萘酚等二氢黄酮醇类化合物，之后又在黄酮醇合酶(fls)的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物。黄酮醇合酶(fls)是黄酮类化合物合成途径与儿茶素合成途径的桥梁，二氢黄酮醇能在fls的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物，如槲皮素和山萘酚。xu等从银杏叶中克隆到了fls基因，在大肠杆菌中该酶能将二氢山萘酚转化为山萘酚，同时该酶也能将柚皮素转化为山萘酚，该研究表明在黄酮类化合物合成途径中fls是一个双功能酶。
5.近年来，随着对黄酮类化合物的研究深入，研究人员发现植物体内的黄酮类物质具有强抗氧化性，这些物质被人摄取后能清除自由基诱导的组织氧化损伤。另外这类物质还具有抗菌、抗病毒、抗骨质疏松、抗肿瘤等多种生物活性。因而在医药、化工领域有着重要的应用价值。除此外，黄酮类物质在农业上也有着重要的应用价值。例如，牧草中的黄酮类化合物含量过高会严重影响反刍动物的消化导致腹胀，而适量的黄酮类化合物能结合草料中的蛋白，使其不被反刍动物发酵，从而提高了植物蛋白转变成动物蛋白的效率。由此可见，对类黄酮代谢途径及其调控的研究意义十分重大。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组苹果黄酮醇合酶，所述重
组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述重组苹果黄酮醇合酶。
9.本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述的多核苷酸。
10.本发明还提供一种酶蛋白表达系统，所述酶蛋白表达系统含有所述的核酸构建体或基因组中整合有所述多核苷酸的宿主细胞。
11.本发明还提供一种重组苹果黄酮醇合酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将所述核酸构建体转化至宿主细胞中，培养宿主细胞诱导重组苹果黄酮醇合酶表达。
12.本发明还提供所述的重组苹果黄酮醇合酶在制备黄酮醇类化合物中的用途。
13.本发明还提供一种黄酮醇类化合物的制备方法，所述方法包括：以二氢黄酮醇类化合物作为底物，向酶促反应体系中加入重组苹果黄酮醇合酶。
14.如上所述，本发明的重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明是在国内外首次证明苹果黄酮醇合酶可以催化二氢槲皮素和二氢山奈酚分别生成槲皮素和山奈酚。本发明的公开为体外利用酶催化方法合成黄酮类物质提供了可行的方法，避免了用提取或化学合成方法获得黄酮类物质的低效率和专一性。用重组黄酮醇合酶催化方法可以高效、专一性的合成槲皮素和山奈酚(见附图1至附图5)。本发明实施后将为槲皮素和山奈酚合成工业带来巨大经济效益。
附图说明
15.图1显示为纯化后的蛋白用sds-page检测结果图。其中，m为蛋白质分子量标记；序号1泳道为gst标签蛋白，作为对照；序号2泳道为mdfls1-gst融合蛋白。
16.图2显示为纯化后的mdfls1-gst融合蛋白催化二氢槲皮素生成形成槲皮素，催化产物用高效液相色谱(hplc)分析结果图。其中dihydroquercetin为对照组，即纯化的gst标签蛋白与二氢槲皮素的反应体系，无产物合成；mdfls1-gst+quercetin为实验组，即纯化的mdfls1-gst融合蛋白与二氢槲皮素的反应体系，比只含有gst标签蛋白的对照反应体系多出了1个明显的产物峰，该产物被推测为槲皮素。
17.图3显示为二氢槲皮素的催化产物用质谱(lc-ms)鉴定。其中上图表示二氢槲皮素的标准质谱图，下图表示二氢槲皮素的催化产物的质谱图。两图特征峰相同，证明二氢槲皮素在酶的催化下形成了槲皮素。
18.图4显示为纯化后的mdfls1-gst融合蛋白催化二氢山奈酚形成山奈酚，催化产物用高效液相色谱(hplc)分析。其中dihydrokaempferol为对照组，纯化的gst标签蛋白与二氢山奈酚的反应体系，无产物合成；mdfls1-gst+kaempferol为实验组，纯化的mdfls1-gst融合蛋白与二氢山奈酚的反应体系，比只含有gst标签蛋白的对照反应体系多出了1个明显的产物峰，该产物即为山奈酚。
19.图5显示为二氢山奈酚的催化产物用质谱(lc-ms)鉴定。其中上图表示二氢山奈酚的标准质谱图，下图表示二氢山奈酚的催化产物的质谱图。两图特征峰相同，证明二氢山奈酚在酶的催化下形成了山奈酚。
具体实施方式
20.本发明提供一种重组苹果黄酮醇合酶，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
21.在一种实施方式中，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列具有与seq id no.2至少80％、85％、90％、95％或99％以上的相似性。在一种实施方式中，所述重组苹果黄酮醇合酶还包括其功能性片段。所述功能性片段例如为标签蛋白。
22.生物体内编码所述重组苹果黄酮醇合酶的基因为苹果黄酮醇合酶基因mdfls1。所述重组苹果黄酮醇合酶的分子量为36.85kd。通过blastp和scanprosite分析，所述重组苹果黄酮醇合酶在n端氨基酸序列的196位至296位含有典型的2-odd保守基序。
23.本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述重组苹果黄酮醇合酶。
24.所述分离的多核苷酸为从苹果幼嫩叶片中分离得到的能构成苹果黄酮醇合酶基因mdfls1的核苷酸。
25.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
26.在一种实施方式中，所述分离的多核苷酸具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
27.本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的酶或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。
28.本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述分离的多核苷酸。
29.在本发明某些实施方式中，所述核酸构建体由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
30.本发明还提供一种组合物，所述组合物中包括有效量的所述重组苹果黄酮醇合酶、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体中的一种以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一种实施方式中，所述载体可以是缓冲液、水等。
31.本发明还提供一种酶蛋白表达系统，所述酶蛋白表达系统含有所述核酸构建体或基因组中整合有外源的所述多核苷酸的宿主细胞。
32.任何适用于核酸构建体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选菌株xl1-blue。
33.本发明还提供一种重组苹果黄酮醇合酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将所述核酸构建体转化至宿主细胞中，培养宿主细胞诱导重组苹果黄酮醇合酶表达，分离得到重组苹果黄酮醇合酶。
34.所述制备方法还包括将分离得到的重组苹果黄酮醇合酶进行纯化。分离、纯化采用本领域技术人员常用的方法即可，本发明不做特别限制。纯化方法的例子包括但并不限
于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
35.在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
36.在一种实施方式中，可以通过向宿主细胞的培养体系中添加iptg(即异丙基硫代半乳糖苷)来诱导重组苹果黄酮醇合酶表达。
37.本发明还提供所述重组苹果黄酮醇合酶在制备黄酮醇类化合物中的用途。
38.所述黄酮醇类化合物是指含有2-苯基-3-羟基(或含氧取代)苯骈γ-吡喃酮(2-苯基-3-羟基-色原酮)类化合物。例如槲皮素、山萘酚。
39.在一种实施方式中，所述用途为在利用二氢黄酮醇类化合物制备黄酮醇类化合物中的用途。所述二氢黄酮醇类化合物为黄酮醇类c2-3位的双键氢化后的衍生物。例如二氢槲皮素、二氢山奈酚。
40.在一种实施方式中，所述用途为所述重组苹果黄酮醇合酶、分离的多核苷酸、所述核酸构建体中的一种或多种作为催化剂在制备黄酮醇类化合物中的用途。
41.进一步的，所述用途为催化二氢黄酮醇类化合物制备黄酮醇类化合物中的用途。
42.本发明还提供一种黄酮醇类化合物的制备方法，所述方法包括：以二氢黄酮醇类化合物作为底物，向酶促反应体系中加入重组苹果黄酮醇合酶。
43.所述酶促反应体系中还包括以下物质中的一种或几种：hepes、mgso4、kcl、h2o。向酶促反应体系中加入hepes能使反应体系的ph较长时间恒定在一定范围，mgso4、kcl的作用是稳定稳定酶活性。
44.在一种实施方式中，反应初始时，反应体系中底物的浓度为0.1～5mm。例如可以为0.1～1mm、1～2mm、2～3mm、3～4mm、4～5mm中的一个。
45.在一种实施方式中，在200微升的反应体系中，重组苹果黄酮醇合酶的加入量为1～2μg。
46.所述酶促反应的温度为适宜酶发挥作用的温度。在一种实施方式中，反应温度为30～37℃。
47.需要终止反应时，可以向酶促反应体系中加入三氯乙酸终止反应。
48.在一种实施方式中，以二氢槲皮素作为底物可制备槲皮素。在另一种实施方式中，以二氢山奈酚作为底物可制备山奈酚。
49.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
50.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
51.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和
科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1苹果黄酮醇合酶基因mdfls1的克隆、原核表达与重组酶蛋白纯化
52.1.苹果黄酮醇合酶基因mdfls1的克隆
53.本发明涉及的苹果黄酮醇合酶基因mdfls1是通过rt-pcr扩增技术从苹果中克隆的。首先利用trizol方法从苹果幼嫩叶片提取rna，然后用rt-pcr方法扩增得到该基因的编码区cdna。扩增时用的一对引物是：mdfls1-a:5
’-
atgatagcggtggaaatggag-3’(seq id no.3)；aafls1-b:5
’-
ttattggggaagcttgttaa-3’(seq id no.4)。rt-pcr扩增程序为：94℃(预变性)，5min；94℃(变性)，10s；58℃(退火)，15s；72℃(延伸)，2min；36cycle；72℃(终延伸)，10min。回收并纯化扩增产物。将扩增获得的目的基因mdfls1与ecorv单酶切的中间载体pbluescript sk连接，获得载体pb mdfls1，对克隆到的基因进行测序。
54.2.mdfls1的序列信息与特性
55.对克隆的黄酮醇合酶基因mdfls1测序后发现，该基因的cdna编码区长度为1008bp，编码335个氨基酸，编码的蛋白质分子量为36.85kd，其氨基酸序列如seq id no.2所示。通过blastp和scanprosite分析，mdfls1在n端氨基酸序列的196位至296位，含有典型的2-odd保守基序，该基序与之前克隆到的拟南芥、烟草、玉米等模式植物的fls相同，是其保守的结构域。
56.3.苹果黄酮醇合酶基因mdfls1的原核表达载体构建
57.用bamhi和kpni双酶切原核表达载体pgex-3h(山东大学侯丙凯教授实验保存)，回收载体片段备用。同时用bamhi和kpni双酶切前述载体pb mdfls1，回收得到目的基因片段，并将其连入上述原核表达载体中，得到苹果黄酮醇合酶基因mdfls1的原核表达载体pgex-mdfls1。
58.4.转化大肠杆菌、诱导蛋白表达及酶蛋白的纯化
59.将上述原核表达载体pgex-mdfls1转化大肠杆菌菌株xl1-blue，pcr和酶切验证正确后，保存菌种，此菌种用于融合蛋白(gst-mdfls1或写成mdfls1-gst，即融合了gst标签蛋白的重组苹果黄酮醇合酶)的表达纯化。
60.在添加了氨苄青霉素(100mg/l)的2
×
yt液体培养基中过夜培养上述菌种，以活化该菌种。然后将过夜培养物按照1:100(过夜培养物:新的2
×
yt液体培养基)的比例扩大至75ml培养液中，37℃培养至od
600
＝0.8。然后加入iptg至0.2mm，转到20℃震荡培养24h以诱导目的蛋白表达。到时间后通过离心收集菌体。
61.菌体加入2ml blast buffer(0.5mm edta，750mm蔗糖，200mm tris-hcl，ph＝8.0)重悬，立即加入14ml稀释的1/2blast buffer(事先添加2mg溶菌酶)，混匀后于冰上放置30min，离心收集菌体，用pbs(内含0.2mm的pmsf)重悬,冰上放置30min后10000rpm离心20min,取上清。在上清中加入100μl的谷胱甘肽琼脂糖珠子，按照pgex蛋白纯化手册操作，最后用elution buffer(50mm tris-hcl，10mm还原型谷胱甘肽，ph＝8.0)洗脱目的蛋白。目的蛋白的纯度用sds-page方法检测，蛋白浓度按照bradford试剂盒说明书中的方法进行测定(用bsa作为蛋白标准)。
62.实施例2重组苹果黄酮醇合酶催化槲皮素和山奈酚的合成
63.1.二氢槲皮素和二氢山奈酚的酶催化反应
64.用纯化到的重组苹果黄酮醇合酶mdfls1的融合蛋白(gst-mdfls1，能够反映mdfls1的催化活性，属于常用的做法)进行体外的酶催化反应，二氢槲皮素和二氢山奈酚为底物。催化反应中所用酶促反应体系如下：
[0065][0066]
将以上混合好的反应体系放于37℃恒温水浴锅中，反应3小时。然后加入20μl浓度为240mg/ml的三氯乙酸终止反应。将反应管用液氮速冻后存放在-20℃，直到hplc分析。
[0067]
2.酶催产物的hplc鉴定
[0068]
用高效液相色谱(hplc)分析以上的反应混合体系，所用的仪器为岛津lc-20at，柱子为c18(ultimate，4.6
×
150mm，5μm)，工作站为ver 1.21，二极管阵列检测器。流动相为甲醇和水(均含有0.1％的磷酸)，二元高压梯度洗脱，其中有机相的比例分别为35％-90％。洗脱时间为22min。上样量为20μl。
[0069]
hplc分析显示，与对照(反应体系中只含有纯化的gst标签蛋白)相比，gst-mdfls1融合蛋白对二氢槲皮素和二氢山奈酚化合物都能催化合成相应的槲皮素和山奈酚(见附图2，4)。
[0070]
3.酶催产物的质谱鉴定
[0071]
对酶催化产物进行lc-ms鉴定，仪器为surveyor msq，所用的流动相为甲醇和水(均含有0.1％的磷酸)，有机相梯度和洗脱时间同上述hplc方法。
[0072]
结果发现酶促反应生成的产物为各合成产物(见附图3，5)。由此得出结论：苹果黄酮醇合酶mdfls1可用于催化二氢槲皮素和二氢山奈酚合成槲皮素和山奈酚。
[0073]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
[0074]
本发明属于国家重点研发计划，“用于新型生物药物的稳定剂类药用辅料工艺优化及质量提升”，项目编号为sq2020yff0422322。