一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法与流程

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本发明涉及植物保护技术领域，具体是指一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法。


背景技术：

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三七圆斑病病原菌为槭菌刺孢(mycocentrosporaacerina(hartig)deighton)，该菌属于半知菌门菌刺孢属真菌，该病于1993年云南省文山州首次被发现，是危害三七地上部分非常严重的一种病害。槭菌刺孢喜低温高湿，且传播迅速，在三七生长地区，每年雨季来临，如果防治不及时，发病率可达80％以上，对七农造成严重的经济损失。
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槭菌刺孢以厚垣孢子在土壤或植物病残体中越冬，是翌年三七圆斑病的主要初侵染源，常在每年雨季发病和流行，发病初期叶片病斑较小，呈圆形或近圆形水渍状，病斑中心可见棕褐色侵染小点，随后病斑逐渐扩大，褐色或灰褐色，发病后期可在病斑表面观察到轮纹状白色或粉白色的分生孢子堆。这些分生孢子可借助风力或雨水飞溅传播，造成三七圆斑病的大面积发生。
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槭菌刺孢由于很难在人工培养基上产生分生孢子，目前还没有一种可靠的技术手段可以使槭菌刺孢在人工培养基上稳定的产生分生孢子，专利cn105695389公开了一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，主要是通过圆斑病菌接种三七活体叶片，一定时间后三七叶片上可以产生孢子，该方法操作复杂，且在培养过程中，三七叶片容易受到其他微生物的污染，所获得的分生孢子悬浮液不纯净。专利cn106085945公开了一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，该方法通过制作三七地块的土壤液来诱导槭菌刺孢菌丝产生分生孢子，该方法需要采集三七地块的土壤制备土壤液，不仅操作复杂，而且因土壤液中可能存在其他病原菌导致目的孢子悬浮液不纯净。
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因此，对于三七圆斑病菌的研究，迫切需要一种操作简单、成本低、高效的纯培养产孢方法。


技术实现要素：

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本发明要解决的技术问题是传统方法操作复杂，在培养过程中，容易受到其他微生物的污染，所获得的分生孢子悬浮液不纯净。
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为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，包括以下步骤：
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步骤1、用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢，获得纯培养菌株；
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步骤2、将纯化后的菌株接种到pda(potato dextrose agar)培养基；
[0010]
步骤3、在20℃、全光照条件下的光照培养箱中培养5～7天；
[0011]
步骤4、首先用灭菌的手术刀将培养皿菌落表面的菌丝刮去，然后将刮去菌丝的菌落切割成直径3～4cm的圆形菌块；
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步骤5、在直径为90mm的无菌培养皿中加入约15～20ml经0.22μm滤膜过滤后的
ddh2o(双蒸水)，再将圆形菌块正面朝上放入ddh2o中，使ddh2o刚好淹没菌块；
[0013]
步骤6、将装有菌块的培养皿放入光照培养箱中，温度设置为20℃，光照和黑暗交替(12h、12h)培养；
[0014]
步骤7、产孢观察，15天后即可观察到有大量的分生孢子产生，产孢量可达1
×
103个/ml。
[0015]
优选的，所述步骤1中的用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢菌株，分离完成后需要2～3次纯化，获得纯培养菌株。
[0016]
优选的，所述步骤2中采用的pda培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，自然ph值，加入100mg/l氯霉素，配制完成后121℃高压灭菌30min。
[0017]
优选的，所述步骤3中全光照条件是指一天之内24h全时间段光照，无黑暗培养，待槭菌刺孢菌落面积占整个培养皿面积的2/3即可。
[0018]
优选的，所述步骤4中所使用的手术刀需在高压灭菌锅中，121℃下灭菌30min后使用，菌块切割需要在超净工作台中操作。
[0019]
优选的，所述步骤5中ddh2o需经0.22μm滤膜过滤后使用，将菌丝块放入到含有无菌ddh2o的无菌培养皿中，使ddh2o刚好淹没菌块。
[0020]
优选的，所述步骤6中需要将培养皿放在恒温20℃和黑暗光照交替条件下15～20天才可以产生孢子，成熟的孢子会漂浮在无菌ddh2o表面，将无菌ddh2o倒入50ml离心管中并加入2％的吐温20之后放入低温离心机，在4℃、10000r/min条件下离心5min，然后再根据需要进行稀释即可得到期望浓度的槭菌刺孢孢子悬浮液。
[0021]
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明针对三七圆斑病病原菌(槭菌刺孢)提出了一种新的分生孢子诱导方法，该方法操作简单，产孢稳定，且整个过程都是在无菌环境下操作的，没有其他杂菌污染，可以获得较为纯净的分生孢子悬浮液；针对产孢量来说，本发明平均每个培养皿中可以产生2
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104个分生孢子；本方法成本低廉，一般实验室都可以满足本发明产孢条件的要求。
附图说明
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图1是纯培养七天的槭菌刺孢菌落图。
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图2是槭菌刺孢菌块在ddh2o中的诱导产孢图。
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图3是ddh2o诱导槭菌刺孢10天后产生的分生孢子漂浮在ddh2o表面的状态图。
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图4是ddh2o诱导槭菌刺孢菌丝产生的分生孢子梗和分生孢子图。
具体实施方式
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下面结合附图对本发明一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法做进一步的详细说明。
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结合附图1-4，对本发明进行详细介绍。
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一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，包括以下步骤：
[0029]
步骤1、用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢，获得纯培养菌株；
[0030]
步骤2、将纯化后的菌株接种到pda(potato dextrose agar)培养基；
[0031]
步骤3、在20℃、全光照条件下的光照培养箱中培养5～7天；
[0032]
步骤4、首先用灭菌的手术刀将培养皿菌落表面的菌丝刮去，然后将刮去菌丝的菌落切割成直径3～4cm的圆形菌块；
[0033]
步骤5、在直径为90mm的无菌培养皿中加入约15～20ml经0.22μm滤膜过滤后的ddh2o(双蒸水)，再将圆形菌块正面朝上放入ddh2o中，使ddh2o刚好淹没菌块；
[0034]
步骤6、将装有菌块的培养皿放入光照培养箱中，温度设置为20℃，光照和黑暗交替(12h、12h)培养；
[0035]
步骤7、产孢观察，15天后即可获得大量的分生孢子，产孢量可达1
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103个/ml。
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所述步骤1中的用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢菌株，分离完成后需要2～3次纯化，获得纯培养菌株。
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所述步骤2中采用的pda培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，自然ph值，100mg/l氯霉素，配制完成后121℃高压灭菌30min。
[0038]
所述步骤3中全光照条件是指一天之内24h全时间段光照，无黑暗培养，待槭菌刺孢菌落面积占整个培养皿面积的2/3即可。
[0039]
所述步骤4中所使用的手术刀需在高压灭菌锅中，121℃下灭菌30min后使用，菌块切割需要在超净工作台中操作。
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所述步骤5中ddh2o需经0.22μm滤膜过滤后使用，将菌丝块放入到含有无菌ddh2o的无菌培养皿中，使ddh2o刚好淹没菌块。
[0041]
所述步骤6中需要将培养皿放在恒温20℃和黑暗光照交替条件下15～20天才可以产生孢子，成熟的孢子会漂浮在无菌ddh2o表面，将无菌ddh2o倒入50ml离心管中并加入2％的吐温20之后放入低温离心机，在4℃、10000r/min条件下离心5min，然后再根据需要进行稀释即可得到期望浓度的槭菌刺孢孢子悬浮液。
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本发明一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法的具体实施过程如下：
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实施例1：实验人员于2019年7月份在云南省文山州丘北县采集三七圆斑病病叶，通过组织分离法分离病原菌，对纯化后的病原菌菌株sdm5在pda培养基上培养7天后，用手术刀切割正方形的菌丝块，放入无菌ddh2o中进行诱导，在20℃的光照培养箱中光照黑暗交替培养15天后开始产孢，随后产孢量越来越多。
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实施例2：实验人员于2019年9月份在普洱市澜沧县林下三七基地采集三七圆斑病病叶，分离纯化出病原菌菌株dlc16，用如同实施例1中同样的方法，在培养10天后开始产生分生孢子。
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本发明针对三七圆斑病病原菌(槭菌刺孢)提出了一种新的分生孢子诱导方法，该方法操作简单，产孢稳定，且整个过程都是在无菌环境下操作的，没有其他杂菌污染，可以获得较为纯净的分生孢子悬浮液；针对产孢量来说，本发明平均每个培养皿中可以产生2
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104个分生孢子；本方法成本低廉，一般实验室都可以满足本发明产孢条件的要求。
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以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。