专利名称：一种诱导植物抗病促生的抑制素蛋白及基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地说是通过分子生物学技术手段，克隆了细极交链孢菌"/feman'a fe""/肌'mfl)的抑制素基因(pMO，并 表达出对植物具有抗病促生作用的抑制素蛋白(Prohibitin)。
背景技术：
抑制素基因(#6)是一种有效的肿瘤抑制基因，广泛分布于细菌、 植物、酵母、原虫及哺乳类等各种生物细胞中。它所编码的抑制素蛋白(Prohibitin)结构高度保守、具有多种功能，既存在于线粒体内膜上， 发挥分子伴侣作用，也存在于细胞核内，具有负性转录调控作用，因而 对细胞生长、分化、衰老以及细胞凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作 用。抑制素的命名源于历史的原因，最早只发现了这些多功能蛋白的--种功能，即作为细胞增殖的抑制子的功能，所以将其命名为抑制素。抑制素是一类非常重要的蛋白， 一直以来对它的研究主要集中在医 学领域，研究材料多为动物细胞；植物中抑制素类似蛋白的研究在玉米、 水稻、烟草和拟南芥中也有报道，但其生物功能尚不清楚。最近，在矮 牵牛中有抑制素的报道，当下调矮牵牛中抑制素的表达时，矮牵牛的叶 和花变小，并且形状不规则；同时，抑制素基因沉默使矮牵牛花的细胞、 花期、呼吸作用均和对照有较大差异，说明抑制素改变了矮牵牛的发育 和衰老。因此，抑制素在植物的发育和衰老中也起重要作用。目前，国内外尚未见丝状真菌抑制素的报道，也没有将丝状真菌产 生的抑制素用于诱导植物抗病性、提高植物免疫力的专利或报道。因此， 对交链孢菌抑制素及其新功能的发现将补充和完善对抑制素的研究，并 对生命现象进行新的解释，还有助于拓展其在农业上的应用，为人类充 分利用这一蛋白开展有益的尝试。发明内容本发明的目的是提供一种对植物抗病促生、提高植物免疫力的抑制 素蛋白，从而拓展抑制素在农业上的应用。
本发明的主要技术方案是通过从细极交链孢菌的CDNA文库中克 隆抑制素基因，将其在毕赤酵母和大肠杆菌中表达，得到有生物活性的 抑制素蛋白。本发明的抑制素蛋白具有对植物抗病促生、提高植物免疫力的作用。 具体技术方案如下(1) 采用Gateway⑧技术，构建细极交链孢菌cDNA入门文库和表达 文库。通过LR重组把入门文库转换为表达文库。(2) 采用细极交链孢菌激活蛋白免疫兔子，获得抗体；采用免疫学方 法筛选细极交链孢菌cDNA表达文库，筛选和克隆到一段包括起始密码 子和终止密码子在内的849bp的完整编码序列。在NCBI GenBank中比 对发现，在已知蛋白中，该核苷酸序列推测的氨基酸序列和酵母(SaccAaramyces cerev/s/ae)线粒体内膜上的抑制素复合体(PhMp-Phb2p) 亚基高度同源，其一致性(Identities)为79%，相似性(Positives)为89%。 因此，将此基因命名为pW)(见序列表)。(3) PCR扩增pM)基因，并在引物中引入限制性内切酶的酶切位点； 将pW)基因克隆到表达载体的相应酶切位点中，在毕赤酵母或大肠杆菌 中表达细极交链孢菌的抑制素蛋白(见序列表)；纯化表达的抑制素蛋白。(4) 用10-20ug/ml的蛋白溶液中浸泡植物种子或喷施植物叶片，生 物测定法测定交链孢菌抑制素蛋白的抗病促生活性。本发明的优点和效果本发明的抑制素蛋白是由丝状真菌细极交链孢菌的抑制素基因编码 的，对植物具有明显的抗病促生作用。与化学农药相比，本发明无毒、 不污染环境，可作为一种无公害的生物农药，对于保护生态环境，促进 农业可持续发展有着重要意义。
具体实施方式
下面通过具体实例进一步说明本发明特点。 实施例1本实施例采用Gatcway@技术，构建细极交链孢菌cDNA入门文库和表达文库。提取交链孢菌总RNA，纯化mRNA;进行cDNA—链合成、二链合 成，用色谱柱法分级cDNA片段。分级分离后得到的cDNA两端连有attBl
和attB2序列，在BP重组酶的作用下有效的被重组入含有attPl和attP2 的质粒载体中。重组后cDNA亚克隆两边的接头变为attL，它可以通过A -att重组系统中的LR重组反应重组入其它载体中，从而使得文库可以不 必经过繁琐的亚克隆操作，直接转入其它载体用于进一歩研究。构建的 cDNA入门文库经检测，入门文库的滴度达到6X106，文库总容量为5.6 X107，其阳性克性率为100%，平均插入片段大小大约为1.53Kb。通过 LR重组把入门文库转换为表达文库。表达文库的滴度为1.53X 106，文 库总容量为6.2X106，其阳性克性率为100%，平均插入片段大小大约为 1.62Kb。;实施例采用免疫学方法筛选交链孢菌cDNA表达文库。 抗体探针是获得未知基因的基本途径，它可以直接用于分离产生目 的蛋白质的重组克隆。因为很多具有功能的蛋白质的基因结构及氨基酸 序列均是未知的，所以不能采用核酸探针筛选目的基因,但可采用能与表 达产物发生特异性结合的抗体筛选基因。采用细极交链孢菌激活蛋白免疫兔子，获得激活蛋白抗体；采用免 疫学方法筛选交链孢菌cDNA表达文库首先将要筛选的cDNA表达文 库转印到硝酸纤维素膜上，然后使用高特异性抗体进行免疫筛选。经过 筛选将近150000个克隆，得到180个可疑阳性斑，经过多次复筛，最终 得到9个阳性克隆。其中一个阳性克隆的插入片断中包括起始密码子和 终止密码子在内的849bp的完整编码序列。在NCBI GenBank中比对发 现，在己知蛋白中，该核酸序列推测的氨基酸序列和酵母(&"tora，m cewW^e)线粒体内膜上的抑制素复合体(Phblp-Phb2p)亚基高度同源， 其一致性为79%，相似性为89%。该基因被命名为pM。实施例3本实施例是巴斯德毕赤酵母(P/cfc'"中的表达及表达的 抑制素蛋白的纯化。采用上游引物Pl: 5 ， GGAATTCATGGCCGCGATACCTACCTC 3，和 下游引物P2 : 5, TTGCGGCCGCTGACCTCAGGCCCAACAAGAAG 3，， PCR扩增pM基因，在上游引物中引入位点，在下游引物中引入 iVo/I位点；经测序确认后克隆pW)基因于毕赤酵母表达载体pPIC9K， 然后转化至毕赤酵母GS115中，筛选出正确的转化子；用甲醇诱导实现 p励基因的表达，表达的抑制素蛋白分泌到培养液中。使用AktaExplorer蛋白分析仪分离纯化表达的抑制素蛋白。发酵液 上1 ml的Hitrap DEAE柱，用步阶梯度分步洗脱，A缓冲液(20 mM Tris-HCl， pH7.5)' B缓冲液(20 mM Tris-HCl， pH7.5， 2MNaCl)，流 速1 ml/min，收集40% B缓冲液洗脱的组分；将该收集样上Superdex 75 分子筛柱浓縮蛋白，流速0.8 ml/min。分离纯化蛋白时以含有空载体 pPIC9K的毕赤酵母GS115的发酵液为对照。实施例4本实施例是用生物测定法测定交链孢菌抑制素蛋白的抗病促生活性。种子发芽试验精选籽粒饱满的小麦种子15粒于20ug/ml的蛋白溶 液中浸泡8小时后，置于直径9cm的培养皿中，三次重复，于28。C培养 箱中进行发芽试验，以空载体的分离纯化样品为对照，从第三天开始每 天观察种子的发芽情况。本发明抑制素对小麦的促生作用达6.8%。对烟草花叶病毒病的作用当珊西烟长到6片叶时，将中部的一个 叶片套袋覆盖，其它叶面喷施20ug/ml交链孢菌抑制素蛋白，喷完蛋白 后将套袋摘除，5天后采取摩擦接种法接种病毒于套袋覆盖的叶片上， 接种三天后，调查病斑数量。本发明抑制素对烟草花叶病毒病的防治效 果达58.6%。
序列表〈110〉中国农业科学院植物保护研究所〈120〉 一种诱导植物抗病促生的抑制素蛋白及基因序列<130> 05-01<160〉 1<170〉 Patentln version 3. 1 <210> 1 <211〉 849 〈212〉 DNA<213〉 细极链格 包菌(Alternaria tenuissima) <400〉 1ATGGCCGCGA TACCTACCTC ACTCTTCCGC TGGGTCGTTC CTGCTGCCAT CGGCGCCAGC 60 GTGGTGCAGA GCTCCCTCTA CGACGTCAAA GGCGGAACCC GCGCCGTCAT CTTCGACCGT 120 CTGTCCGGAG TCAAGGAAAA 〔:GTCGTCAAC GAGGGCACAC ATTTCTTGGT CCCATGGCTG 180 CAACGGGCAA TTGTCTTCGA TGTCAGGACG AGGCCGAGGA ATATCAGCAC AACGACGGGA 240 TCCAAGGATT TGCAGATGGT CACACTTACA CTGAGGGTGT TGCATCGCCC GGAGGTCAAG 300 CAGCTGCCCA AGATCTACCA AAATCTCGGT CTCGACTACG ACGAGCGTGT TCTCCCCTCC 360 ATCGGTAACG AAGTCCTGAA AGCCATCGTT GCACAGTTCG ATGCCGCAGA ACTCATCACT 420 CAGCGAGAGG CCGTCTCCAA CCGCATCCGG ACCGATCTGC TCAAGCGCGC CAACGAGTTC 480 AACATTGCCC TCGAAGACGT CTCCATCACA CACATGACTT TCGGCAAAGA GTTCACCAAG 540 GCCGTCGAAG AGAAGCAGAT CGCACAACAA GAAGCCGAGC GCGCGCGCTT CATTGTAGAG 600
AAGGCAGAGC AAGAGCGGCA AGCAAACGTT ATCAG(;GCCG AG(;GTGAAGC CGAGGCTGCC 660GACACAATCT CAAAGGCAGT GGCAAAGAGT GGTGACGGTC TM;TGTTGAT TAGGCGCATT 720GAGACCCAGA AGGATATTGC GCAGATGCTG GCGAG〔;AACC CCAACGTCAG CTATCTGCCT 780GGTGGTAACT CTGGTGGCM CGGTGGCGGT TCAA(;TGGT(; GTAGCTTCTT GTTGGGCCTG 840AGGTCATGA 849Met Ala Ala 1lie Gly AlaThr Arg Als 35Val Asn Glu 50Veil Phe Asp 65Ser Lys AspPro Glu ValTyr Asp Glu 115丄丄e Val AJa 130Val Ser Asn 145Asn lie AlaGlu Phe ThrGlu Arg Ala 195Asn Val l丄e210 Lys Ala VpiI 225[le Pro Thr 5Ser Val Val 20Val lie PheGly Thr HisVal Arg Thr 70Leu Gin Met 85Lys Gin Leu 100Arg Val LeuGin Phe AspArg lie Arg 150Leu Glu Asp 165Lys Ala Va] 180Arg Phe lieArg Ala GluA丄a Lys Ser 230SerGinAspPhe55ArgValProProAla 135 ThrValGluValGly 215 GlyLeuSerArg40LeuProThrLysSer 120 AlaAspSerGluGlu 200 GluAspPheSer25LeuValArgLeulie 105 I]eGluLeulieLys 185 LysArg Trp 10 LeuSerPro TrpAsn lie 75 Thr匕eu 90Tyr GinG丄y AsnLeu JleLeu Lys 155 Thr His 170Gin lieAla GluA]a Glu AlaGly Leu Val 235Val ValAsp ValVal Lys45 Leu Gin 60Ser ThrArg Va]Asn Leu(;lu Val 125 Thr G]n 140Arg AlaMet ThrAla GinGin Glu 205 Alei Asp 220Leu liePro Ala Ala 15Lys Gly Gly 30Glu Asn ValArg Ala lieThr Thr Gly 80Leu His Arg 95Gly Leu Asp 110Leu Lys AlaArg GJ.lj AlaAsn Glu Phe 160Phe (;ly Lys 175Gin ()lu A]a 丄90Arg Gin AlaThr [le SerArg Arg 1 l.e 240 Glu Thr Gin Lys Asp lie Ala Gin Met Leu A]a Arg Asn Pro Asn Val244 250 255Ser Tyr Leu Pro Gly Gly Asn Ser Gly Gly Asn Gly Gly Gly Ser Ser260 265 270G]y Gly Ser Phe Leu Leu Gly Leu Arg Ser 275 280
权利要求
1.一种编码抑制素蛋白的基因phb，其特征在于它是由细极交链孢菌(Alternaria tenuissima)产生的，其核苷酸序列为1ATGGCCGCGA TACCTACCTC ACTCTTCCGC TGGGTCGTTC CTGCTGCCAT CGGCGCCAGC61 GTGGTGCAGA GCTCCCTCTA CGACGTCAAA GGCGGAACCC GCGCCGTCAT CTTCGACCGT121 CTGTCCGGAG TCAAGGAAAA CGTCGTCAAC GAGGGCACAC ATTTCTTGGT CCCATGGCTG181 CAACGGGCAA TTGTCTTCGA TGTCAGGACG AGGCCGAGGA ATATCAGCAC AACGACGGGA241 TCCAAGGATT TGCAGATGGT CACACTTACA CTGAGGGTGT TGCATCGCCC GGAGGTCAAG301 CAGCTGCCCA AGATCTACCA AAATCTCGGT CTCGACTACG ACGAGCGTGT TCTCCCCTCC361 ATCGGTAACG AAGTCCTGAA AGCCATCGTT GCACAGTTCG ATGCCGCAGA ACTCATCACT421 CAGCGAGAGG CCGTCTCCAA CCGCATCCGG ACCGATCTGC TCAAGCGCGC CAACGAGTTC481 AACATTGCCC TCGAAGACGT CTCCATCACA CACATGACTT TCGGCAAAGA GTTCACCAAG541 GCCGTCGAAG AGAAGCAGAT CGCACAACAA GAAGCCGAGC GCGCGCGCTT CATTGTAGAG601 AAGGCAGAGC AAGAGCGGCA AGCAAACGTT ATCAGGGCCG AGGGTGAAGC CGAGGCTGCC661 GACACAATCT CAAAGGCAGT GGCAAAGAGT GGTGACGGTC TAGTGTTGAT TAGGCGCATT721 GAGACCCAGA AGGATATTGC GCAGATGCTG GCGAGGAACC CCAACGTCAG CTATCTGCCT781 GGTGGTAACT CTGGTGGCAA CGGTGGCGGT TCAAGTGGTG GTAGCTTCTT GTTGGGCCTG841 AGGTCATGA
2.按照权利要求1所述的基因编码的抑制素蛋白，其氨基酸序列为:1MAAIPTSLiFRWVVPAAIGASWQSSIiYDVKGGTRAVIFDR41lsgvkenvvnegthflvpwlgraivfdvrtrprnistttg81skd:lgmvt:ltlrvlhrpevkq:lpkiyq虹gldydervlps121IGNEVLKAIVAQFDAAELITGREAVSNRIRtd1^KRANEF161nialedvs工thmtfgkeftkaveekqiaqqeaerarfive201kaeqerqanviraegeaeaadtiskavaksgdglvlirri241etqkdiaqmlarnpnvsylpggnsggngggssggsfllgl281
3. —种用于表达该抑制素蛋白的表达质粒，其特征在于该质粒含有 权利要求1中所述的基因的DNA片断。
4. 权利要求l所述的基因表达的抑制素蛋白的使用方法，其特征在 于含该抑制素蛋白的毕赤酵母或大肠杆菌的发酵培养物、粗制品或精制 品，使用时用水稀释至浓度为10-20微克/毫升。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白，其特点是从细极交链孢菌(Alternariatenuissima)的cDNA文库中克隆到抑制素基因(phb)，并将其在毕赤酵母和大肠杆菌中表达，表达的抑制素蛋白(Prohibitin)对植物具有抗病促生作用。
文档编号C12N15/31GK101148675SQ200610152200
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月19日 优先权日2006年9月19日
发明者峥 刘, 刘文平, 宁 张, 曾洪梅, 杨秀芬, 董健伸, 袁京京, 赵明治, 邱德文 申请人:中国农业科学院植物保护研究所