一种调控番茄抗坏血酸积累的基因及应用的制作方法

文档序号:23817719发布日期:2021-02-03 13:57阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种调控番茄抗坏血酸积累的基因,其特征在于,所述调控番茄抗坏血酸积累的基因的dna为seq id no:1。2.一种利用权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因编码的蛋白,其特征在于,所述蛋白的氨基酸序列为seq id no:2.3.一种利用权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因构建的表达载体,其特征在于,所述表达载体为pgbkt7,dna序列为seq id no:3。4.一种如权利要求3所述表达载体的构建方法,其特征在于,所述表达载体的构建方法包括:以番茄a57叶片cdna为模板进行pcr扩增,得到f-box基因全长orf,连接到中间载体peasy-b上,通过热击转化入大肠杆菌,扩繁后菌液pcr检测并挑选条带大小正确的单克隆测序验证;测序正确的抽取其质粒,并用ecori和sali对pgbkt7空质粒和peasy-b重组载体质粒进行双酶切回收;将回收的基因片段通过t4 dna连接酶连接到线性pgbkt7载体上,构建pgbkt7-f-box重组质粒;将连接产物通过热激转入大肠杆菌,并用含50mg/l spec抗性的平板涂皿筛选单克隆,挑选单克隆在50mg/l spec液体lb中,37℃200r/min摇床上扩繁,菌液pcr检测后挑选正确抽提质粒用于下一步酵母的转化。5.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在番茄抗坏血酸含量测定上的应用,其特征在于,所述在番茄抗坏血酸含量测定上的应用包括总抗坏血酸含量的测定和还原态抗坏血酸含量的测定;总抗坏血酸含量的测定包括:取上清20μl于酶标板中,加入20μl,5mm的dtt,离心混匀后置于37℃反应20min;向反应溶液中加入10μl 0.5%的nem溶液,离心混合后室温下放置1min;加入80μl the color reagent,离心混匀后于37℃反应1h,在550nm波长下测定其吸光值;所述还原态抗坏血酸含量测定包括:取上清20μl于酶标板中,加入30μl磷酸缓冲液;加入80μl the color reagent,离心混匀后于37℃反应1h,在550nm波长下测定其吸光值。绘制标准曲线:用抗坏血酸标样配置成初始浓度为1mg/ml的标准溶液,用6%的三氯乙酸按浓度稀释成不同浓度的溶液,按照还原态抗坏血酸测定方法分别在550nm波长下测定其吸光值,绘制成标准曲线。6.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在叶绿素含量测定上的应用,其特征在于,所述在叶绿素含量测定的应用包括:用液氮取样并将样品于液氮中研磨至粉状,称取粉状样品定量至0.2g于2ml离心管中;向离心管中加入1.5ml浓度为80%的丙酮溶液,并立即混匀并置于黑暗处使样品充分抽提1h;将试管置于离心机离心,12000r/min,10min;吸取200μl上清于酶标板中,用酶标仪在波长646nm和663nm下分别测定样品吸光值;使用叶绿素浓度计算公式计算叶绿素含量;叶绿素浓度(mg/ml)=17.32a
646
+7.18a
663
,a表示相关波长下的吸光值。
7.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在丙二醛含量测定上的应用,其特征在于,所述在丙二醛含量测定上的应用包括:用液氮取样并将样品于液氮中研磨至粉状,称取粉状样品定量0.2g于10ml离心管中;向试管中加入3ml浓度为5%的三氯乙酸(tca)溶液,立即混匀溶液并抽提30min;将样品置于离心机离心,3000r/min,10min;吸取2ml上清溶液转移至新的10ml离心管中,并向试管中加入2ml浓度为0.67%的tba溶液;将上述样品混匀置于沸水浴30min,待溶液冷却后离心;吸取200μl上清液体于酶标板中,用酶标仪在波长450nm,532nm和600nm处分别测定吸光值;使用丙二醛浓度计算公式计算含量;mda(μm/l)=6.45(a
532-a
600
)-0.56a
450
,a为吸光值。0.67%tba配置;称取0.67g硫代巴比妥酸,然后加水至100ml。8.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在番茄叶片h2o2荧光染色鉴定上的应用,其特征在于,所在番茄叶片h2o2荧光染色鉴定上的应用包括:收集mv处理一周的番茄叶片,置于50ml离心管中并加入25μm h2dcfda浸泡,置于黑暗环境15min,然后用20mm,ph 6.0的磷酸钾缓冲液冲洗;将番茄不同株系叶片分别制作临时切片,进行可视化荧光信号apotome鉴定。9.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在gmp酶活测量上的应用,其特征在于,所述在gmp酶活测量上的应用包括:1)酶液提取将样品置于液氮中研磨成粉状,定量抽取0.2g于10ml预冷离心管中;立即加入1.5ml 4℃预冷的提取液;将样品置于冰冻离心机离心,7500r/min,4℃,5min,上清为粗酶提取液;2)gmp酶活测定:gmp的酶活力采用外加无机焦磷酸酶的比色方法测定。将准备好的粗酶提取液稀释20倍;吸取10μl稀释后的提取液于酶标板中,向酶标板加入90μl反应液于30℃,反应30min;待反应完成后,向反应体系中加入100μl显示试剂;将酶标板放入酶标仪设置650nm波长下测量光的吸收;gmp酶活结果用u/30min/g fw表示;粗酶提取液组分:50mmol/l tris(ph 7.5);20%甘油;1mmol/l edta;5mmol/l dtt;1%pvp。反应液组分:50mmol/l tris(ph7.5);8mmol/l mgcl2;100μmol/l gtp;100μmol/l甘露糖-1-磷酸-na;1mmol/l dtt;0.1units ml-1
无机焦磷酸化酶;显色试剂组分:0.03%(w/v)绿孔雀石;0.2%(w/v)钼酸铵;0.05%triton-x-100。10.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在galur酶活测定上的应用,其特征在于,所述在galur酶活测定上的应用包括:1)取植物组织样品于液氮中研磨成粉末,称取0.2g于提前预冷的2ml离心管中,向离心管中加入50mm磷酸缓冲液,于4℃,4000r/min离心30min,收集上清液即为酶提取液,低温保存备用;2)取10μl酶液与290μl反应液混合,加入酶标板中;记录340nm的吸光值变化。
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