一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法及其应用与流程

文档序号:24240874发布日期:2021-03-12 13:15阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法,其特征在于,所述方法包括第一步rpa或rt-rpa反应和第二步rpa反应,具体步骤为:1)配制反应体系使用第一对引物对进行第一步rpa或rt-rpa反应进行扩增;2)在步骤1)的全部或部分产物中直接加入第二对引物对和/或探针继续扩增反应获得反应产物。

2.根据权利要求1的扩增方法,其特征在于,所述第二步rpa反应的第二引物对位于所述第一步rpa或rt-rpa反应第一引物对扩增获得的模板内,且与第一步rpa反应第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。

3.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应分别可用于dna或rna的扩增。

4.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第二步rpa是带有探针的rpa,且里面可添加可以识别/thf/或者/idsp/的核酸内切酶。

5.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述步骤2)可以与步骤1)在同一个容器中进行,也可以在不同容器中进行。

6.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述方法的所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应时间分别为5-30min;优选的,分别为10-15min。

7.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应温度为35℃到45℃,优选的是37℃-42℃,更优选的是37℃或42℃。

8.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,步骤2)的第二步扩增反应中,探针被切割后的带有第一标记的产物与第二步中的带有第二标记的引物组成引物对,参与扩增并形成一端带有第一标记,一端带有第二标记的双链dna,所述第一标记和第二标记分别选自fam、fitc、biotin、地高辛和tamra中的任意一种。

9.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述步骤1)使用第一步rpa或rt-rpa反应试剂进行,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂包括第一步rpa或rt-rpa反应的第一对引物对、缓冲液和/或rpa反应物。

10.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述步骤2)使用第二步rpa反应试剂进行,所述第二步rpa反应试剂包括所述第二对引物对和/或探针。

11.根据权利要求9或10的扩增方法,其特征在于,所述第二步rpa反应试剂只包括第二步rpa反应的引物对和/或探针。

12.一种核酸快速检测方法,其特征在于,其包括如下步骤:

(1)获得待检测核酸;

(2)使用权利要求1-11任意一项所述的巢式重组酶-聚合酶扩增方法扩增步骤(1)的核酸,获得反应产物;

(3)将反应产物稀释后插入胶体金试纸条进行胶体金显色。

13.根据权利要求12的检测方法,其特征在于,所述步骤(3)的胶体金显色具体为:取第二步rpa反应产物加入到depc水中混合均匀进行稀释,吸取稀释产物置于胶体金点样孔中显色拍照。

14.根据权利要求12或13的检测方法,其特征在于,所述方法还包括荧光探针检测步骤。

15.根据权利要求12或13的检测方法,其特征在于,所述胶体金显色为夹心法。

16.根据权利要求15的检测方法,其特征在于,所述胶体层析试纸设置为:胶体金表面为链霉亲和素或fam(或者fitc)抗体或tamra抗体或地高辛抗体。

17.根据权利要求15或16的检测方法,其特征在于,第一条t线为fam(或者fitc)抗体或tamra抗体或地高辛抗体或链霉亲和素;t线与胶体金表面修饰的与小分子结合的大分子分别对应探针与下游引物上修饰的小分子标记物,第二条c线为抗igg的抗体或者链霉亲和素抗体。

18.一种试剂盒,其特征在于,其包含用于权利要求1-11或权利要求12-17任意一项所述方法的引物对、探针、试剂、试纸条和/或其组合。

19.一种用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括第一步rpa或rt-rpa反应试剂和第二步rpa反应试剂,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂包括第一步rpa或rt-rpa反应的引物对、缓冲液和rpa反应物,第二步rpa反应试剂包括第二步rpa反应的引物对和/或探针。

20.根据权利要求19的检测试剂盒,其特征在于,所述第二步rpa反应试剂只包括第二步rpa反应的引物对和/或探针。

21.根据权利要求19或20的检测试剂盒,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂和第二步rpa反应试剂独立包装。

22.根据权利要求19或20的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒还包括显色试纸条。

23.根据权利要求22的检测试剂盒,其特征在于,所述显色试纸条是胶体金试纸条。

24.根据权利要求19或20的检测试剂盒,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂反应完毕获得第一步产物后,在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步rpa反应试剂。

25.根据权利要求19或20的检测试剂盒,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂还包括第一反应容器,所述第一步rpa或rt-rpa反应和第二步rpa反应均在第一反应容器中进行。

26.根据权利要求19或20的检测试剂盒,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应试剂还包括第一反应容器,所述第二步rpa反应试剂还包括第二反应容器,所述第一步rpa或rt-rpa反应在第一反应容器进行,在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步rpa反应试剂的过程在第二反应容器中进行。


技术总结
本发明涉及一种快速、高灵敏度的巢式重组酶‑聚合酶扩增检测方法、以及相关核酸快速检测方法、巢式重组酶‑聚合酶扩增检测试剂盒。可快速且高灵敏度地对核酸进行检测,反应过程无需配制两个反应试剂,直接反应即可获得能够进行灵敏检测的反应产物,极大减化了核酸检测操作步骤,降低了操作复杂性,提高了灵敏度。

技术研发人员:白净卫;刘册;杜娟娟
受保护的技术使用者:清华大学
技术研发日:2020.11.11
技术公布日:2021.03.12
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