一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M1的方法与流程

本发明提供了一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素m1的方法，属于纳米材料与分子生物技术领域。本发明具体方法为：将时间分辨荧光纳米颗粒(kyf4:eu³⁺np)用生物素化的afm1特异性适配体的互补链(cdna)修饰得到kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针，使用g-c3n4纳米片作为荧光猝灭剂。将afm1特异性适配体用作滚环扩增的引物，加入滚环扩增模版、t4dna连接酶、dntps、phi29dna聚合酶等经滚环扩增反应后，向体系中加入g-c3n4纳米片，通过监测体系的荧光信号强度，达到定量检测afm1的目的。该发明可以用于牛奶等样品中afm1的检测。

背景技术：

黄曲霉毒素(aflatoxin，af)是一类由真菌、黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物(双呋喃环类毒素)的总称，广泛分布于自然界中。目前发现的黄曲霉毒素约20多种，其中研究较多的有黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、黄曲霉毒素m1及黄曲霉毒素m2六种。黄曲霉毒素m1(aflatoxinm1，afm1)主要存在于乳及乳制品、霉变谷物、含有油脂的干果中及动物的肌肉、尿液、乳汁、血液等中，其中乳及乳制品最容易受到afm1的污染，也是afm1的主要存在场所。当泌乳动物摄入饲料中的afb1后，将在动物体内肝微粒体酶作用下经体内循环代谢产生afm1并存在于其乳汁、尿液中。黄曲霉毒素的毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，是目前公认的最毒的化学致癌物质之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(internationalagencyforresearchoncanceroftheworldhealthorganization)将afb1和afm1划分为i类致癌物。由于afm1来源广、监控难并且毒性强，因此，迫切需要开发一种灵敏、快速且易于使用的检测策略来测定食品中的afm1。

目前，afm1检测方法主要有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、高效液相质谱联用法(hplc-ms/ms)及基于抗原-抗体免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫法检测霉菌毒素虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是小分子抗原的制备过程繁琐耗时、成本昂贵，不同批次间抗体存在差异性，储存及使用条件严苛，导致假阳性率高、重复性差。所以开发一种快速方便、稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的检测方法很有必要。

核酸适配体(aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇小分子dna或rna片段。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比较，核酸适配体有诸多优点，比如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验；稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等。滚环扩增(rollingcircleamplification，rca)是以环状dna为模板，短的dna或rna为引物链(与部分环状模板互补)的恒温核酸放大方法，在对应聚合酶和dntps存在的情况下，会从引物链的3′端开始延伸，生成一条长的单链，该单链包含了许多重复的环状dna互补片段，利用这些片段可以得到显著放大的信号。因此，滚环扩增既可以超灵敏地放大检测rna、dna，也可以对目标核酸进行信号放大。这使得滚环扩增技术在传感器的构建中备受青睐。

时间分辨荧光(time-resolvedfluorescence，trf)是一种特殊的荧光现象，是利用物质的荧光寿命长短进行时间分辨，即采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度-时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱，用于对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分实现分辨，并可分别进行测定；通过设置合理的延迟时间(delaytime)和门控时间(gatetime，也称检测时间)消除了检测环境中杂质自发荧光和背景荧光对信噪比的干扰，从而提高分析方法灵敏度。

氮化碳(g-c3n4)纳米片是一种新兴的石墨烯状碳基二维纳米材料。与其他二维纳米材料相比，g-c3n4具有许多优势，即低成本、高量子产率、良好的生物相容性、令人钦佩的稳定性和无毒性。因此可基于g-c3n4纳米片的高表面积、高荧光猝灭能力和对ssdna的亲和力比dsdna强得多等特性，构建相应的荧光生物传感器。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于时间分辨荧光标记-rca信号放大检测黄曲霉毒素m1的方法。本发明检测方法灵敏度高，具有较高的稳定性。本发明首先合成得到了镧掺杂的时间分辨荧光纳米颗粒(kyf4:eu³⁺np)，并生物标记afm1特异性适配体的互补链cdna得到kyf4:eu³⁺-cdna，将其用作信号探针。合成了g-c3n4纳米片用作荧光猝灭剂。接着将afm1特异性适配体用作滚环扩增的引物，在没有靶标的情况下，其将与滚环模版杂交，并在多种酶的作用下启动滚环扩增。而产生的具有多个靶适配体序列拷贝的长ssdna滚环扩增产物将与kyf4:eu³⁺np上标记的cdna杂交形成滚环扩增产物/kyf4:eu³⁺-cdna双链体分子，且其荧光不会被g-c3n4纳米片猝灭。而在靶标存在情况下，afm1特异性适配体将与靶标结合，不再与滚环模版杂交，抑制了环状dna的形成和长ssdna的合成，故kyf4:eu³⁺-cdna中cdna将以单链形式存在且其荧光将被g-c3n4纳米片猝灭。最后以紫外光进行激发，诱导时间分辨荧光为检测信号，通过对不同浓度afm1标准品的检测，建立标准曲线，达到对含afm1样品进行定量/定性检测的目的。

本发明的技术方案如下：

一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素m1的方法，所述具体方法如下：

s1：将kyf4:eu³⁺np时间分辨荧光纳米用生物素化的afm1特异性适配体的互补链(cdna)修饰得到kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针；并选用g-c3n4纳米片作为荧光猝灭剂；

s2：将afm1特异性适配体用作滚环扩增的引物，与滚环扩增模版、t4dna连接酶、dntps、phi29dna聚合酶混合经滚环扩增反应后得到反应产物，并与s1中所述kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针混合孵育，之后向体系中加入g-c3n4纳米片并孵育，检测所得体系的荧光信号强度。

s1中所述kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针的通过以下方法制备得到：

步骤1、kyf4:eu³⁺np的合成：将充分溶解有kcl、ycl3、eu³⁺和聚醚酰亚胺的乙二醇溶液添加到含有nh4f的乙二醇溶液中，在室温下继续搅拌反应30min，放入高压反应釜中在200℃下反应4h，经室温冷却后，离心收集产物，并将产物用乙醇和水分别洗涤3次，最后得到kyf4:eu³⁺np时间分辨荧光纳米；

步骤2、将步骤1中所得kyf4:eu³⁺np时间分辨荧光纳米颗粒进行亲和素修饰：将浓度为1～2mg/ml的kyf4:eu³⁺np时间分辨荧光纳米溶液与戊二醛在室温下避光震荡活化2h，之后除去未反应的戊二醛，接着用pbs至少清洗三次，然后加入浓度为1mg/ml亲和素并在37℃震荡过夜，反应结束后清洗并取固相，得到亲和素修饰的时间荧光分辨纳米材料av-kyf4:eu³⁺；

步骤3、时间分辨荧光纳米kyf4:eu³⁺np与cdna结合：将步骤2中制备得到的亲和素修饰的时间荧光分辨纳米材料av-kyf4:eu³⁺分散于pbs缓冲溶液中，并加入生物素化的cdna，在37℃摇床中孵育12h，收集固相并用pbs至少清洗三次，最终得到所述cdna修饰的时间分辨荧光纳米kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针。

步骤1中所述kcl、ycl3、eu³⁺的摩尔比为2：1：0.1。

步骤3中所述cdna序列为5′-biotin-tcgaccccagcgtcagagcagg-3′。

s1中所述g-c3n4纳米片的制备方法为：将三聚氰胺以2.3℃/min的升温速率在550℃条件下加热4h即得块状g-c3n4，将制备得到的块状g-c3n4分散在水中，超声16h，将得到的g-c3n4分散液离心，以除去残留的未充分剥落的块状g-c3n4。

所述afm1特异性适配体序列为5′-atccgtcacacctgctctgacgctggggtcgacccggagaaatgcattcccctgtggtgttggctcccgtat-3′。

所述滚环扩增模版为5′-phosphate-gtcagagcaggtaacgacgagaaagggctgccagatactcttcgcaatttttcgaccccagc-3′。

s2中所述滚环扩增反应步骤具体为：

步骤1、滚环模板dna的环化：将afm1特异性适配体和滚环扩增模版在95℃加热10min，然后逐渐冷却至室温，之后将10μl0.1μm的滚环扩增模版、1μl350u/μl的t4dna连接酶和4μl10×t4dna连接酶缓冲液的反应混合物中进行滚环模版的连接反应，将所得反应混合物在37℃下孵育1h，然后在65℃终止反应10min以使t4dna连接酶失活；

步骤2、滚环扩增反应：将步骤1中所得10μl反应混合物添加到10μl的rca混合物，随后将整个混合物在37℃下孵育90min，并在75℃下终止反应15min，得到滚环扩增产物；其中所述rca混合物包含2μl10×rca反应缓冲液、2μlbsa、5μl5mmdntps和1μl10u/μl的phi29dna聚合酶；

步骤3、荧光测量步骤：将步骤2得到的滚环扩增产物与kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针在pbs中混合，并在37℃下孵育30min得到滚环扩增产物kyf4:eu³⁺-cdna杂交混合物，将其与g-c3n4纳米片溶液混合，并在室温下放置10min，最后检测所得体系的荧光信号强度。

s1中所述溶液荧光检测采用bioteksynergyh1酶标仪，并设置参数为激发波长273nm，延迟时间为100μs，检测时间为1000μs。

本发明有益的技术效果在于：

1，利用镧系掺杂纳米材料荧光寿命长的特点，通过时间分辨使得检测背景的荧光衰减，从而大大的提高了检测的灵敏度。

2，使用具有较高荧光猝灭效率的g-c3n4纳米片作为荧光猝灭剂，又进一步提高了检测的灵敏度。

3，利用适配体对检测物质的特异性结合，有效的提高了检测的准确性和稳定性。

4，在靶标afm1存在的情况下，不会发生滚环扩增反应，抑制了环状dna的形成和长ssdna的合成，从而确保了传感系统的特异性。

附图说明

图1是基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素m1的原理图；

图2是本发明实施例1中的时间分辨荧光强度随黄曲霉毒素m1浓度变化叠加图(a)；黄曲霉毒素m1检测标准曲线图(b)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

牛奶样品中黄曲霉毒素m1的检测及加标回收

1，kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针的制备

kyf4:eu³⁺np的合成：将含有kcl(2.0mmol)，ycl3(1.0mmol)，eu³⁺(0.1mmol)和pei(1ml)的充分混合的乙二醇溶液(20ml)添加到45℃含有nh4f(6.0mmol)的乙二醇溶液(20ml)中。在室温下继续搅拌反应30min，之后将全部混合物移入有特氟龙内衬的高压反应釜(50ml)中，在200℃下反应4h。经室温冷却后，离心收集产物，并将产物用乙醇和水分别洗涤3次；

kyf4:eu³⁺np进行亲和素修饰：将浓度为1mg/ml的时间荧光分辨纳米材料kyf4:eu³⁺np溶液分别与戊二醛在室温下避光轻微震荡活化2h，之后除去未反应的戊二醛，接着用pbs至少清洗三次，然后加入浓度为1mg/ml亲和素并在37℃震荡过夜，反应结束后清洗并取固相，得到亲和素修饰的时间荧光分辨纳米材料av-kyf4:eu³⁺np。

时间分辨荧光纳米颗粒与适配体结合：利用亲和素(avidin)与生物素(biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲和素的kyf4:eu³⁺纳米颗粒与生物素修饰的cdna连接。具体方法为：将5mg制备得到的亲和素修饰的时间荧光分辨纳米颗粒av-kyf4:eu³⁺np分散于5ml(10mm)pbs缓冲溶液中，并加入生物素化的cdna，在37℃摇床中孵育12h，收集固相并用pbs至少清洗三次，最终得到所述cdna修饰的时间分辨荧光纳米颗粒kyf4:eu³⁺-cdna荧光探针。

2，g-c3n4纳米片的制备

将三聚氰胺在空气条件下以约2.3℃/min的升温速率在550℃的空气中加热4h。将制备得到的块状g-c3n4(20mg)粉末分散在水(20ml)中，超声处理16h。在使用前，将形成的初始悬浮液以10000rpm离心，以除去残留的未剥落的g-c3n4纳米片。

3，对黄曲霉毒素m1标准品进行检测并建立标准曲线

将浓度分别为0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1和0.5ng/ml的afm1标准品和含有适配体(0.1μm)、rct(0.1μm)、t4dna连接酶和10xt4dna连接酶缓冲液的检测溶液在37℃孵育1h。随后，将包含10xrca反应缓冲液、bsa、dntps和phi29dna聚合酶的10μlrca混合物与上述检测溶液混合，并在37℃下孵育90min。将所得的产物与kyf4:eu³⁺-cdna混合，并在37℃下孵育30min，然后添加g-c3n4溶液并孵育10min。最后使用酶标仪测量最终混合物的荧光发射光谱。根据荧光值与对应的标准品浓度建立标准曲线。

4，对牛奶样品中afm1的含量进行检测并建立标准曲线

样品预处理：将牛奶样品在5000rpm下离心10min。收集上清液。

分别添加0.05、0.1和1.0ng/ml浓度的黄曲霉毒素m1标准品到待测物中，同样利用本发明方法再次检测其中黄曲霉毒素m1的含量，得到检测值，见附图2。回收率(％)＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表1的结果来看，回收率在92.0％～99.8％，说明本发明稳定、灵敏、准确，适合用于玉米样品中黄曲霉毒素m1的检测。

表1