一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法与流程

本发明涉及甘薯疮痂病的抗性鉴定技术领域，具体为一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法。

背景技术：

甘薯是世界上重要的粮食、饲料、工业原料和生物能源用作物。同时，甘薯的幼嫩茎枝和叶柄因富含营养和食用美味，在中国越来越多的地区成为广受欢迎的蔬菜作物，茎尖菜用甘薯应运而生，茎尖菜用甘薯是指以甘薯嫩梢或叶柄作为食用部位的一种蔬菜专用型甘薯新品种。我国南方夏季叶菜类最为缺乏，广菜薯5号、福薯7-6茎尖菜用品种成为重要的叶菜来源，但生产中这些品种常因感染疮痂病而遭受损失。

现有的甘薯疮痂病是我国南方薯区重要的病害之一，致病菌为甘薯痂圆孢菌，可侵染甘薯的叶片、茎蔓和嫰稍。叶片病斑初呈红色小斑点，随着叶片伸长而扩大，后成灰褐色隆起疮疤，叶脉向内弯曲成屈膝状。茎蔓病斑初为紫褐色圆形或椭圆形木栓状疮疤，后期凹陷，严重时多个病斑常连接成片，藤蔓乳汁稀少。发病严重的嫩梢皱缩不能伸长。甘薯疮痂病在整个生长期都可发生，若在生长早期发病，发病率可达60％-70％。在国外，美属关岛、巴西、太平洋岛国、马来西亚等国家经常遭受该病流行的严重危害，国内目前广泛分布在东海沿海的广东、广西、福建、浙江、台湾和海南诸省，其中广东地区夏秋炎热多雨，有利于甘薯疮痂病的发生，甘薯产业的发展面临很大威胁。茎尖菜用甘薯因其食用部位为嫰稍和叶柄，其产量品质受疮痂病的影响尤其显著。广东湿润多雨的气候环境极易导致甘薯疮痂病的发生与流行，病害若在甘薯植株生长前期发生，产量损失可达30％-70％，造成严重的经济损失，当环境温度为20-30℃，湿润多雨条件下该病害极易暴发流行。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法，包括s1、待鉴定甘薯材料准备：待鉴定的茎尖菜用甘薯品种或品系材料，种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地，经性状观察，生长健康无病，扩繁后备用。

s2、病原菌准备与活化：通过收集新鲜疮痂病病样，采用组织分离法获得具有致病力的疮痂病病原菌、扩繁待用。亦可将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化。将新分离的疮痂病病原菌或者菌株cj1接种至pda培养基平板，25℃黑暗条件培养，待pda培养基平板上生长出菌丝体后，用于接种体制备。

s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

s4、病圃诱发与人工接种：将生长一致健康无病的待鉴定茎尖菜用品种(品系)种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地病圃，小区面积5.4m²，每个小区栽插90株，每个品种设3次重复，同时种植感病对照和抗病对照品种，按照茎尖菜用甘薯品种种植常规管理，利用步骤s3、接种体的制备中获得的分生孢子液悬液，对种植在甘薯疮痂病病圃的待鉴定材料，进行人工喷雾接种，接种后每天观察，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病评价。

s5、抗病评价：采用病圃诱发结合人工喷雾方法进行抗病鉴定，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算每个待鉴定茎尖菜用甘薯材料和品种的病情指数，根据病情指数进行抗性评价；

其中，发病严重度分级标准如下：

0级:无症状；

1级:茎或叶有少数病斑，但叶片能正常展开；

2级:分枝蔓1/3左右叶片受害皱缩；

3级:分枝蔓2/3左右叶片受害皱缩；

4级:新稍畸形，嫩叶皱缩；

5级:顶芽枯死或受损，分枝蔓病斑密布、枯死或叶片变黄脱落；

根据病情分级方法计算病情指数，di＝σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100：

依据di评价抗病性如下：

抗病r：di≤10.5；

中抗mr：10.6≤di≤30.5；

中感ms：30.6≤di≤50.5；

感病s：di≤50.6。

优选的，所述步骤s1、待鉴定甘薯材料准备：待鉴定甘薯材料生长健康无病。

优选的，所述步骤s2、病原菌准备与活化：通过收集新鲜的疮痂病病样，采用组织分离法获得具有致病力的疮痂病病原菌，亦可将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化。。

优选的，所述步骤s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

优选的，所述步骤s4、病圃诱发与人工接种：种植感病对照品种广菜薯5号，抗病对照广菜薯16-19，病圃诱发结合人工喷雾接种，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病评价。

优选的，所述步骤s5抗病评价：田间中感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算病情指数，根据病情指数进行抗性评价。

本发明提供了一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法，具备以下有益效果：

1、虽有研究表明药剂防治能明显抑制甘薯疮痂病的发生，但这些药剂的使用既增加了劳动力成本，又增加了农药残留和环境污染的风险，尤其不适合在茎尖菜用甘薯上使用。本发明方法通过用病圃诱发结合孢子悬液人工接种方法，利用抗感表型稳定的对照品种，建立了一种可靠、结果稳定的适于甘薯疮痂病抗性鉴定评价方法。

2、培育高抗虫害和病害的品种应为当前茎尖菜用甘薯的重点育种目标之一，但目前生产上绝大多数的主栽茎尖菜用甘薯品种对疮痂病的抗性未知，本研究采用病圃诱发结合人工接种技术，对30份国内和广东省内茎尖菜用甘薯品种(系)进行了疮痂病的抗性鉴定与评价，期望筛选出一批优异的茎尖菜用甘薯种质资源，为甘薯疮痂病的防治及抗病育种提供基础材料和技术支持

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法，解决了上述背景技术中提出的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法，包括以下步骤：

s1、待鉴定甘薯材料准备：待鉴定的茎尖菜用甘薯品种或品系材料，种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地，经性状观察，生长健康无病，扩繁后备用。

s2、病原菌准备与活化：通过收集新鲜疮痂病病样，采用组织分离法获得具有致病力的疮痂病病原菌、扩繁待用。亦可将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化。将新分离的疮痂病病原菌或者菌株cj1接种至pda培养基平板，25℃黑暗条件培养，待pda培养基平板上生长出菌丝体后，用于接种体制备。

s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

s4、病圃诱发与人工接种：将生长一致健康无病的待鉴定茎尖菜用品种(品系)种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地病圃，小区面积5.4m²，每个小区栽插90株，每个品种设3次重复，同时种植感病对照和抗病对照品种，按照茎尖菜用甘薯品种种植常规管理，利用步骤s3、接种体的制备中获得的分生孢子液悬液，对种植在甘薯疮痂病病圃的待鉴定材料，进行人工喷雾接种，接种后每天观察，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病评价。

s5、抗病评价：采用病圃诱发结合人工喷雾方法进行抗病鉴定，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算每个待鉴定茎尖菜用甘薯材料和品种的病情指数，根据病情指数进行抗性评价；

其中，发病严重度分级标准如下：

0级:无症状；

1级:茎或叶有少数病斑，但叶片能正常展开；

2级:分枝蔓1/3左右叶片受害皱缩；

3级:分枝蔓2/3左右叶片受害皱缩；

4级:新稍畸形，嫩叶皱缩；

5级:顶芽枯死或受损，分枝蔓病斑密布、枯死或叶片变黄脱落；

根据病情分级方法计算病情指数。di＝σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100。

依据di评价抗病性如下：

抗病r：di≤10.5；

中抗mr：10.6≤di≤30.5；

中感ms：30.6≤di≤50.5；

感病s：di≤50.6。

可选的，步骤s1、待鉴定甘薯材料准备：待鉴定材料生长健康无病。

可选的，步骤s2、病原菌准备与活化：病原菌准备与活化：通过收集新鲜的疮痂病病样，采用组织分离法获得具有致病力的疮痂病病原菌，亦可将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化。

可选的，步骤s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

可选的，步骤s4、病圃诱发与人工接种：种植感病对照品种广菜薯5号，抗病对照广菜薯16-19，病圃诱发结合人工喷雾接种，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病评价。

可选的，步骤s5、抗病评价：品种资源抗病鉴定中，采用病圃诱发结合人工喷雾方法进行抗病鉴定，直至田间中感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算病情指数，根据病情指数进行抗性评价。

本发明提供了一种方便快捷的高频模块机hpm3350监控模块，具备以下有益效果：

1、虽有研究表明药剂防治能明显抑制甘薯疮痂病的发生，但这些药剂的使用既增加了劳动力成本，又增加了农药残留和环境污染的风险，尤其不适合在茎尖菜用甘薯上使用。本发明方法通过用病圃诱发结合孢子悬液人工接种方法，利用抗感表型稳定的对照品种，建立了一种可靠、结果稳定的适于甘薯疮痂病抗性鉴定评价方法。

2、培育高抗虫害和病害的品种应为当前茎尖菜用甘薯的重点育种目标之一，但目前生产上绝大多数的主栽茎尖菜用甘薯品种对疮痂病的抗性未知，本研究采用病圃诱发结合人工接种技术，对30份国内和广东省内茎尖菜用甘薯品种(系)进行了疮痂病的抗性鉴定与评价，期望筛选出一批优异的茎尖菜用甘薯种质资源，为甘薯疮痂病的防治及抗病育种提供基础材料和技术支持。

附图说明

图1为本发明实施示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

本发明提供一种茎尖菜用甘薯疮痂病的抗性鉴定方法，包括以下步骤：

s1、待鉴定甘薯材料准备：选取阜菜13-14、广菜薯7号和福菜薯25等10份茎尖菜用甘薯品种或品系材料，种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地，经性状观察，生长健康无病，扩繁后备用。

s2、病原菌准备与活化：将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化，接种至pda培养基平板，25℃黑暗条件培养，待pda培养基平板上生长出菌丝体后，用于接种体制备。

s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

s4、病圃诱发与人工接种：将生长一致健康无病的待鉴定茎尖菜用品种品系种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地病圃，小区面积5.4m²，每个小区栽插90株，每个品种设3次重复，同时种植感病对照和抗病对照品种，按照茎尖菜用甘薯品种种植常规管理，利用步骤s3、接种体的制备中获得的分生孢子液悬液，对种植在甘薯疮痂病病圃的待鉴定材料，进行喷雾接种，接种后每天观察，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病等级调查。

s5、抗病等级鉴定：

采用病圃诱发结合人工喷雾方法进行抗病鉴定，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算每个待鉴定茎尖菜用甘薯材料和品种的病情指数，根据病情指数进行抗性评价；

其中，发病严重度分级标准如下：

0级:无症状；

1级:茎或叶有少数病斑，但叶片能正常展开；

2级:分枝蔓1/3左右叶片受害皱缩；

3级:分枝蔓2/3左右叶片受害皱缩；

4级:新稍畸形，嫩叶皱缩；

5级:顶芽枯死或受损，分枝蔓病斑密布、枯死或叶片变黄脱落；

根据病情分级方法计算病情指数。di＝σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100。

依据di评价抗病性如下：

抗病r：di≤10.5；

中抗mr：10.6≤di≤30.5；

中感ms：30.6≤di≤50.5；

感病s：di≤50.6。

本实施例1应用发明的方法，对10份茎尖菜用甘薯品种或品系材料进行了不同年度、不同生长季试验的抗性鉴定，其鉴定结果如表1所示。

表1育成品种(系)对甘薯疮痂病的抗性鉴定

抗病对照品种广菜薯16-19和感病对照广菜薯5号在不同年度、不同生长季试验的鉴定结果表现稳定一致。对10份茎尖菜用甘薯品种或品系材料疮痂病抗性鉴定，侵在年度间和不同月份间均表现出较好的重复性，鉴定结果结果有效且稳定。

实施例2：

利用本发明方法对28份茎尖菜用甘薯品种或品系材料进行抗病鉴定，包括以下步骤：

s1、待鉴定甘薯材料准备：选取广菜薯11-52、黔菜薯2号和福菜薯18等28份茎尖菜用甘薯品种或品系材料，种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地，经性状观察，生长健康无病，扩繁后备用。

s2、病原菌准备与活化：将保存在广东省农业科学院作物研究所的甘薯疮痂病菌株cj1活化，接种至pda培养基平板，25℃黑暗条件培养，待pda培养基平板上生长出菌丝体后，用于接种体制备。

s3、接种体的制备：将s2活化病原菌在pda平板上扩繁，生长7d后，加入1-3ml灭菌水，用涂布棒反复涂刮菌落表面，使部分菌丝和孢子溶解于水中，将菌悬液涂布于pda平板上，并在25℃黑暗条件下进行预培养5-7d，再将长出的菌落夹取到含有100μl去离子水的离心管中，震荡培养10h，获得分生孢子悬液并调整浓度为3×10⁴个孢子/ml，加入吐温80使其浓度为2％。

s4、病圃诱发与人工接种：将生长一致健康无病的待鉴定茎尖菜用品种品系种植于广东省农业科学院钟落潭白云基地病圃，小区面积5.4m²，每个小区栽插90株，每个品种设3次重复，同时种植感病对照和抗病对照品种，按照茎尖菜用甘薯品种种植常规管理，利用步骤s3、接种体的制备中获得的分生孢子液悬液，对种植在甘薯疮痂病病圃的待鉴定材料，进行喷雾接种，接种后每天观察，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，进行抗病等级调查。

s5、抗病等级鉴定：

采用病圃诱发结合人工喷雾方法进行抗病鉴定，直至田间感病对照广菜薯5号完全发病后，开始调查发病情况，每个重复随机选取10株进行发病严重度调查，然后计算每个待鉴定茎尖菜用甘薯材料和品种的病情指数，根据病情指数进行抗性评价；

其中，发病严重度分级标准如下：

0级:无症状；

1级:茎或叶有少数病斑，但叶片能正常展开；

2级:分枝蔓1/3左右叶片受害皱缩；

3级:分枝蔓2/3左右叶片受害皱缩；

4级:新稍畸形，嫩叶皱缩；

5级:顶芽枯死或受损，分枝蔓病斑密布、枯死或叶片变黄脱落；

根据病情分级方法计算病情指数。di＝σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100。

依据di评价抗病性如下：

抗病r：di≤10.5；

中抗mr：10.6≤di≤30.5；

中感ms：30.6≤di≤50.5；

感病s：di≤50.6。

本实施例2应用发明的方法，对广菜薯11-52、黔菜薯2号和福菜薯18等28份茎尖菜用甘薯品种或品系材料进行了抗性鉴定，其待鉴定抗性评价结果如表2所示。

表2待鉴定茎尖甘薯材料的抗性评价结果

通过本发明提供的方法，对28份茎尖菜用甘薯品种或品系材料进行抗病鉴定，其中抗病品种有广菜薯11-52、广菜薯15-6、广菜薯16-1、广菜薯16-19、广菜薯17-23、广菜薯17-9、广菜薯18-6，中抗品种有ec01、广薯菜2号、广菜薯3号、广菜薯6号、广菜薯7号、广菜薯17-25、广菜薯18-3。通过本发明方法可筛选出对甘薯疮痂病抗病品种和抗病材料，为甘薯疮痂病的防治及抗病育种提供基础材料和技术支持。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。