一种评价聚氨酯降解的体系的制作方法

本发明属于生物处理技术领域，具体涉及一种评价聚氨酯降解的体系。

背景技术：

聚氨酯(pu)，是一种含氨基甲酸酯键重复单元结构的聚合物，由多异氰酸酯、多元醇和扩链剂三种组分缩合而成。因此，通过不同多元醇和异氰酸酯的类型和比例，可以合成各种类型的pus。其中，根据多元醇类型的不同，聚氨酯分为两大类，分别为聚酯型和聚醚型多元醇两大类。聚氨酯制品主要包括以下几种：泡沫塑料、弹性体、纤维塑料、纤维、革鞋树脂、涂料、胶粘剂和密封胶等，其中泡沫塑料所占比重最大，广泛应用于包装、隔音、建筑、汽车、制鞋工业和医疗业等领域。

据统计，2016年全球聚氨酯塑料年产量高达24.2mt(中国10.1mt)，占合成塑料总产量7.5％，其广泛使用导致产生大量废弃物不合理处置，直接威胁生态环境和人类健康。传统的废塑料处理方法主要包括填埋、焚烧和机械回收等，其经济和人力成本高且可造成二次污染，因此生物降解法成为全球研究的热点。然而，聚氨酯抗微生物降解性高，且目前表征聚氨酯降解效果的评估方法参差不齐，无法完整表征聚氨酯塑料的降解效果。本实验建立了一种标准化的聚氨酯塑料降解菌功能表征体系来研究前期所筛的枝孢菌属cladosporiumsp.p7对两种聚氨酯底物(impranildln和pu薄膜)的降解效果。这种标准化的聚氨酯塑料降解菌功能表征体系的建立，为塑料的生物降解方法的评估以及其他菌株对塑料降解的表征方法提供了理论基础与借鉴，具有切实可行的实际应用价值。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种评价聚氨酯降解的体系。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种评价聚氨酯降解的体系，将降解聚氨酯菌的种子液接入含有聚氨酯的无机盐培养基中培养，降解聚氨酯，如图1所示，再通过质量损失、电镜扫描、红外光谱检测、凝胶色谱检测(分子量变化)、浊度和降解产物鉴定中的任意一种或几种组合的方法来评价降解效果。

其中，所述的聚氨酯为两种聚氨酯底物，分别是水性聚氨酯(impranildln)或聚氨酯薄膜。

优选地，所述的降解聚氨酯菌为枝孢菌(cladosporiumsp.)，菌株名为p7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为cctccno：m2020627，保藏日期为2020年11月7日，保藏地址为中国武汉，所述枝孢菌的its的核苷酸序列如seqidno.1所示。

其中，所述的枝孢菌的种子液的制备方法为，将菌株p7接种到pda固体培养基上，于30℃培养5d，取10ml无菌水滴于平板上，用涂布棒刮取表面的菌丝体及孢子，通过血球计数板计数，稀释成终浓度为1×10⁶孢子/ml浓度的菌悬液作为降解试验种子液。

其中，将枝孢菌的种子液按照5％～15％的体积比接种到含有水性聚氨酯的无机培养基，或含有聚氨酯薄膜的无机培养基中；优选地，按照10％的体积比接种到含有水性聚氨酯的无机培养基，或含有聚氨酯薄膜的无机培养基中。

其中，所述的含有水性聚氨酯的无机培养基，水性聚氨酯的含量为0.2％～2％v/v，优选为1％v/v。

其中，所述的含有聚氨酯薄膜的无机培养基中，聚氨酯薄膜的浓度为3～10mg/ml，优选为6mg/ml。

其中，所述的无机培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，加水至1.0l配制，调节ph值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌20min。

其中，所述的聚氨酯为聚氨酯本身或聚氨酯薄膜。

其中，所述的聚氨酯薄膜的制备方法为：将pu固体用二氯甲烷溶解后重新铺膜，具体地，2g的pu固体溶于20ml二氯甲烷，溶解后的溶液倒入玻璃平皿，置于通风橱挥发溶剂，24h用镊子缓慢揭下，裁剪成2*4cm大小的薄膜备用。

其中，所述的培养为20～50℃，80～200rpm震荡培养；优选地，所述的培养为30℃，120rpm震荡培养。

其中，当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时，在培养过程中或培养结束后取样，去除聚氨酯上的菌体，清洗，干燥，得到降解后的聚氨酯，称重，计算质量损失；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为在培养的第2、4、6、8周分别取样。。

其中，当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时，在培养过程中或培养结束后取样，去除聚氨酯上的菌体，清洗，干燥，得到降解后的聚氨酯，剪出适当大小表面喷金处理，进行电镜扫描(sem)测试，评价其表面形貌变化；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为在培养的第2、4、6周分别取样。

其中，当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时，在培养过程中或培养结束后取样，去除聚氨酯上的菌体，清洗，干燥，得到降解后的聚氨酯，进行红外光谱检测，分析其表面官能团的变化；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为在培养的第8周分别取样。

其中，当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时，在培养过程中或培养结束后取样，去除聚氨酯上的菌体，清洗，干燥，得到降解后的聚氨酯，将其溶解，过滤去除杂质，进行凝胶色谱检测，分析其分子量的变化；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为在培养的第4、8周分别取样；优选地，所述的溶剂为用二甲基甲酰胺溶解。

其中，上述过程中(当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时)，所述的去除聚氨酯上的菌体是通过2％sds去除。

其中，上述过程中(当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时)，所述的清洗为通过蒸馏水清洗干净。

其中，上述过程中(当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时)，所述的干燥为37℃培养箱烘干。

其中，当所述的聚氨酯为水性聚氨酯时，在培养过程中或培养结束后取样，离心，将上清液于od600nm测量浊度；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为每隔一天取一次样。

其中，还可以采用降解产物进行评价；即当所述的聚氨酯为聚氨酯薄膜时，在培养过程中或培养过程结束后取样，离心，取上清，将上清液用于高效液相色谱(hplc)或者质谱(ms)检测降解产物。

其中，当所述的聚氨酯为水性聚氨酯时，在培养过程中或培养结束后取样，离心，将上清液干燥，所得固体进行红外光谱检测；优选地，所述的在培养过程中或培养结束后取样为在培养的第5天取样。

其中，上述过程中(所述的聚氨酯为水性聚氨酯时)，所述的离心为4000rpm、4℃条件下离心5min，从而使得菌体聚集于底部，降低菌体对透明度的影响。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明建立了一种评价聚氨酯降解的体系，即对两种聚氨酯底物(pu模拟物impranildln和pu薄膜)，通过微生物降解，基于物理表征的浊度变化、质量损失、表面降解情况等手段和基于化学表征的表面官能团变化、分子量变化、降解产物的鉴定等手段来评估聚氨酯底物的降解情况，从而能完整表征聚氨酯的降解效果。

(2)发明所采用的菌株p7可以利用impranildln为唯一碳源生长，在7天内对水性聚氨酯impranildln的降解率达95.8％，是目前降解pu效果较高的一株菌。通过采用该菌株进行降解的评价体系，能够有效提高整个体系的评价效率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为一种标准化的塑料降解菌功能表征体系示意图；其中impranildln作为一种水性聚氨酯，是聚氨酯的一种模拟物，研究其降解表征方法，也会为真实pu的降解提供指导意义。

图2为菌株p7对impranildln的降解表征方法：(a)impranildln的降解曲线；(b)不加菌株p7，处理7天后，对impranildln表面进行ftir测试；(c)菌株p7处理7天后，对impranildln表面进行ftir测试。

图3菌株p7对pu薄膜的降解表征方法：(a)菌株p7处理2,4,6,8周后pu薄膜的质量损失曲线；(b)菌株p7处理2,4,6周后，对pu薄膜表面进行sem测试；(c)菌株p7处理8周后，对pu薄膜表面进行ftir测试；(d)菌株p7处理4和8周后，对pu薄膜进行gpc测试；(e)菌株p7处理薄膜2周时的降解产物hplc鉴定；(f)菌株p7处理薄膜2周时的降解产物ms鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中，所述的种子液的制备方法为菌株p7接种到pda固体培养基上，于30℃培养5d，取10ml无菌水滴于平板上，用涂布棒刮取表面的菌丝体及孢子，通过血球计数板计数，稀释成终浓度为1×10⁶孢子/ml浓度的菌悬液作为降解试验种子液。

实施例1：菌株p7对水性聚氨酯impranildln的降解表征方法：

在impranildln终浓度1％(v/v)的无机盐培养基中，按10％v/v接种量接入种子液，于30℃，120rpm震荡培养，每隔1d取样一次，4000rpm、4℃条件下离心5min(将菌体聚集于底部降低菌体对透明度的影响)，发酵液上清用于od600nm测量浊度，计算dln的降解率；将降解第5d的发酵上清和对照(不接菌)的发酵上清分别用冷冻干燥机冻干，冻干后的固体在2500cm^-1～800cm^-1范围进行ftir光谱分析。

由图2a可以看出，对照组(不接菌)，并没有降解迹象，说明impranildln不会自发进行水解；处理组中，菌株p7接种到培养基中1d，就开始降解impranildln，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，在在第七天降解率达95.8％，随后保持稳定。

经过ftir光谱分析，与对照组(图2b)相比，测试样品(图2c)中1735cm^-1代表酯羰基官能团，吸收峰消失表明酯键水解了；而2938cm^-1处的峰，代表脂肪族ch2中c-h的振动，也显著降低。由于impranildln的软段含有大量的脂肪族ch2，峰强度的降低可能代表聚合物软段处链的断裂，这些特征峰的变化皆与文献相符合。此外其他峰的无明显变化代表impranildln中的关键化学键酰胺键比较稳定并未产生降解。而目前大多数文献关于pu的降解机制都是发生在多元醇部分酯键的断裂，而本文目前的分析结果是和文献相吻合的。

实施例2：菌株p7对pu薄膜的降解表征方法：

在pu终浓度0.3g/l的无机盐培养基中，按10％v/v接种量接入种子液，于30℃，120rpm震荡培养，其中，对照组不接菌，培养条件一致。在第2，4，6，8周分别取样，将薄膜上的菌体用2％sds去除，再用蒸馏水清洗干净，于37度培养箱烘干，使用分析天平进行称重，计算重量损失；将用于称重的薄膜，剪出适当大小表面喷金处理，用于扫描电镜(sem)测试；将用于sem测试剩下的薄膜，在2500～800cm^-1范围进行ftir光谱分析；将用于ftir测试剩下的薄膜，用二甲基甲酰胺将pu膜片溶解，过滤除去杂质后用于凝胶渗透色谱(gpc)测试；将培养2周后的发酵液8000rpm离心取上清，用于hplc和ms测定。

将菌株p7与pu薄膜一起培养不同周数后，发现对照种薄膜也出现了质量损失，可能的原因是薄膜在震荡培养时有少量薄膜脱落，而无法测量，因此后面所述的质量损失都减去了空白对照的质量损失。在第二周菌株p7对薄膜的降解达到了26.99％；而后4，6，8周菌株p7对薄膜降解的速率减缓，且在第8周质量损失达到稳定为35.42％(图3a)。同时对不同周数的菌株p7处理后的pu薄膜表面进行sem分析，在2周时，薄膜表面已经出现了明显的孔洞和裂纹；4周和6周时孔洞和裂纹进一步加深，该结果与质量损失结果相呼应(图3b)。经过ftir光谱分析(图3c)，与对照组相比，降解8周后的pu薄膜中1735cm^-1代表酯羰基官能团，吸收峰强度明显减弱表明酯键水解了。经过gpc(图3d)分析，两种培养基中薄膜的重均分子量(mw)和数均分子量(mn)都有一定程度的下降，在降解4周时间内，mw和mn分别下降了11.03％和5.79％，在第8周的时候，mw和mn进一步下降，分别下降了15.55％和21.17％，说明聚合物发生了降解引起了分子量的降低。降解产物经过hplc分析，处理组在17.2min出峰，和己二酸标样出峰时间一致，因此推测该降解产物为己二酸；同时通过ms分析，鉴定其m/z分别为145.04(m+h)⁺，结合pu的化学结构及其分子中各化学键的稳定性，因此鉴定为己二酸，也进一步说明了是pu软段部分的酯键水解。

经过基于这些物理及化学的表征手段建立的标准化的塑料降解表征体系，发现p7不仅对pu结构模拟物impranildln有降解效果，也对真实固体pu具有一定的降解效果，将为pu的生物降解研究奠定坚实的理论基础，且在pu或者其他塑料的生物治理上具有巨大潜能。该标准化的聚氨酯塑料降解菌功能表征体系的建立，不仅可以对pu的生物降解程度进行全面而统一的评估，也对其他微生物对塑料的生物降解表征方法提供理论基础以及借鉴，将会大大推动关于塑料的生物降解进程。

本发明提供了一种评价聚氨酯降解的体系的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一种评价聚氨酯降解的体系

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>535

<212>dna

<213>枝孢菌(cladosporiumsp.)

<400>1

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