一种检测血浆游离DNA中EGFR基因T790M突变的引物对及试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测技术，具体涉及一种检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对及试剂盒。

背景技术：

现有技术提供了用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、检测方法及试剂盒，检测引物能与egfr基因保守序列结合，扩增突变序列；检测方法采用检测荧光信号基团能与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。现有技术公开了检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒，所述特异性探针为核酸序列并包含非配对区、突变检测区、配对区；非配对区和配对区的碱基序列分别与待测位点的特异性序不配对和配对；突变检测区的碱基种类与待测位点的突变位点突变前或突变后的碱基种类相配对；所述非配对区的一个碱基修饰有第一修饰基团，配对区的第一个碱基修饰有第二修饰基团；第一修饰基团和第二修饰基团为相配合的荧光基团和淬灭基团。现有技术公开的一组用于检测egfr基因t790m点突变的引物组，其包含以下引物：t790m-f:ctccaccgtgcagctcatctt；t790m-r:tgcacacaccagttgagcaggt；taqman-mgb探针：tcggctgcctcctgga。传统扩增受阻突变系统（arms）的引物设计时，若引物过长，容易导致非特异性扩增，导致特异性下降，若引物过短，导致扩增效率低下，灵敏度降低；现有引物无法兼顾灵敏度与特异性。

技术实现要素：

本发明公开了检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对及试剂盒，采用与现有技术不同的引物设计思路，尤其是创造性的设计引物2没有长片段的辅助，无法在起始阶段扩增，只能对第一步pcr反应的产物进行扩增，确保特异性，在arms中首次公开该设计方案。血浆游离dna中egfr基因t790m突变为人egfr基因t790m突变。

本发明采用如下技术方案：

一种检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对，由上游引物与下游引物组成，其中，上游引物由引物1与引物2组成；引物1由模板完全匹配区序列、spacer、模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成；引物2由所述模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成。

本发明公开了一种检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物体系，包括检测引物、内控引物；所述检测引物由上游引物与下游引物组成，其中，上游引物由引物1与引物2组成；引物1由模板完全匹配区序列、spacer、模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成；引物2由所述模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成。

本发明公开了一种检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的试剂盒，包括检测引物、内控引物、taqman探针、内控探针；所述检测引物由上游引物与下游引物组成，其中，上游引物由引物1与引物2组成；引物1由模板完全匹配区序列、spacer、模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成；引物2由所述模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成。

本发明还公开了上述检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对、检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物体系或者检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的试剂盒在检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变中的应用；或者上述检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对、检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物体系或者检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的试剂盒在制备检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变试剂盒中的应用。

本发明中，模板完全匹配区序列的长度为20～30bp，比如seqidno.1；spacer为spacerc3、spacerc6、spacerc9或者spacerc18，优选两个spacerc3；模板匹配区序列的长度为8～12bp，模板不匹配区序列的长度为8～12bp；模板不匹配区序列、模板匹配区序列、突变碱基适配区序列依次连接组成的序列为seqidno.2。本发明利用spacer连接seqidno.1的3'端与seqidno.2的5'端，形成引物1。

本发明中，引物2的序列为seqidno.2。引物1与引物2之间没有连接，本发明首次提出引物2，无法在起始阶段扩增，只能对第一步pcr反应的产物进行扩增，确保特异性。

本发明中，下游引物为seqidno.3。检测引物用于针对突变进行扩增和检测，内控引物用于监控反应体系dna模板量；优选的，内控引物为seqidno.4、seqidno.5，taqman探针为seqidno.6，其5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团，内控探针seqidno.7，其5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。

本发明中，检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的试剂盒还包括常规扩增组分，比如pcr检测反应液、酶混合液等常规组分。

本发明公开了血浆游离dna中egfr基因t790m突变的扩增方法，其采用上述检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对为扩增引物，进一步使用内控引物、taqman探针、内控探针；具体包括以下步骤，将引物、探针、模板、常规pcr反应组分混合后进行pcr反应，完成血浆游离dna中egfr基因t790m突变的扩增。

本发明公开了检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的方法，其采用上述检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对为检测引物，进一步使用内控引物、taqman探针、内控探针；具体包括以下步骤，将引物、探针、模板、常规pcr反应组分混合后进行pcr反应，反应结束后，根据扩增曲线，划定荧光阈值，得到不同通道ct值并计算△ct值，根据△ct值判断egfr基因t790m的突变情况。

以本发明检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对进行血浆游离dna中egfr基因t790m突变扩增时，使用双引物扩增体系，引物1含有一段长片段（20-30bp）能够与模板完全匹配，辅助引物与模板结合，使用space（c3）与短片段区域分开，短片段区域（只有10bp）与模板配对，且末端只能与突变型的模板匹配结合，此步反应特异性较高，而且space（c3）确保下游引物扩增不会将长片段序列一同扩增；进一步的，在下一步扩增中，引物2作为高效扩增引物，迅速放大扩增信号，此步反应灵敏度较高，引物2没有长片段的辅助，无法在起始阶段扩增，只能对第一步pcr反应的产物进行扩增，确保特异性。

综上所属，本方案以长引物1的高特异性扩增出少量含有突变的模板，使用引物2高效特异性放大信号，解决传统扩增受阻突变系统（arms）的引物设计时在引物设计时难以兼顾特异性和灵敏度的问题。本方法检测灵敏度可达到0.125%甚至更低，较传统方法检测灵敏度0.5%取得显著进步。

附图说明

图1为本发明引物1、引物2的结构示意图；

图2为本发明上游引物进行突变型模板扩增时的示意图；

图3为本发明上游引物进行野生型模板扩增时的示意图；

图4为含有0.5%的定量阳性标准品扩增曲线；

图5为含有0.25%的定量阳性标准品扩增曲线；

图6为含有0.125%的定量阳性标准品扩增曲线；

图7为阴性标准品扩增曲线。

具体实施方式

本发明引物的具体制备方法为现有技术，pcr常规组分为现有技术，具体pcr操作方法也为现有技术，且反应体系无dna污染。本发明的创造性在于采用新的思路设计引物1与引物2，两者用于血浆游离dna中egfr基因t790m突变的扩增具有好的特异性与灵敏度。

参见附图1，为本发明引物1、引物2的结构示意图；附图2为本发明上游引物进行突变型模板扩增时的示意图；附图3为本发明上游引物进行野生型模板扩增时的示意图。

实施例一

检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对，由引物1、引物2以及下游引物组成；其中引物1的序列如下：

5'-ctttgtgttcccggacatagtccagg(spacerc3)(spacerc3)tactaatcctggcatgagctcca-3'

seqidno.1为5'-ctttgtgttcccggacatagtccagg-3'；

seqidno.2为5'-tactaatcctggcatgagctcca-3'

引物2的序列为seqidno.2，具体如下：

5'-tactaatcctggcatgagctcca-3'

下游引物的序列为seqidno.3，具体如下：

5'-cggacatagtccaggaggc-3'。

实施例二

检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物体系，由引物1、引物2、下游引物、内控引物组成，其中引物1、引物2、下游引物与实施例一一致；内控引物的序列如下：

seqidno.4：5'-ccctagagttgccacagc-3'

seqidno.5：5'-ggtaagcagcaagagagc-3'。

实施例三

检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的试剂盒，由检测引物、内控引物、taqman探针、内控探针以及常规pcr反应组分组成，其中检测引物由与实施例一一样的引物1、引物2、下游引物组成，内控引物与实施例二一样。常规pcr反应组分为去离子水、10xacetaqbuffer、dntp、acetaqdna等。

实施例四检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变

方法原理

针对egfr基因20号外显子t790m突变，设计特异性的引物和探针，与pcr缓冲液等制备成突变检测反应液。待检样品中含有突变dna模板时，对应突变的检测反应体系中的引物、探针与模板dna结合，pcr扩增得以进行并释放荧光信号；待检样品中不含突变dna模板时，突变检测反应体系中的引物、探针不与模板结合或与模板的结合受阻，无pcr扩增或pcr扩增受到抑制，无荧光信号的释放。利用荧光定量pcr仪对pcr过程中的荧光信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

样品

常规方法肿瘤组织dna，提取的dna：od260/od280在1.8～2.0之间；浓度>5ng/μl。

主要试剂和仪器

人类egfrt790m基因突变检测试剂盒；qiaampdnaffpetissuekit；离心机艾本德5415r、5417r；超净工作台、生物安全柜；qubit核酸定量仪；罗氏ⅱ代lc480荧光pcr仪；2.5ul-1000ul移液器

性能指标

检测特异性阴性参考品，检测结果均为阴性。

检测特异性阳性参考品，检测结果均为阳性。

可以检出20ngdna样品中含量低至0.125%的egfrt790m基因突变。

操作步骤

pcr反应液配制，将表1各引物探针干粉稀释为10um浓度工作液进行配制，混合后储存，组分见表2。

试剂配制（试剂配置区），从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，快速离心10秒。每份样品同弱阳性对照、空白对照、质控品（第三方）同时检测，pcr反应体系见表3。

按照20μl孔分装量将配制好2管pcr反应混合液分装至pcr反应管中。小心盖上pcr反应管的反应条管盖。pcr反应管盖顶部标记编号，用于样品和质控品的标识。pcr反应管转移至样本准备区。剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱冷冻避光保存。

试剂与样品混合：（样本准备区）。样本dna提取：按照石蜡样本dna提取和纯化标准操作规程进行。

加样：将待测样本的基因组dna、弱阳性对照、空白对照、质控品，分别加入已加入2种pcr反应混合液的pcr反应管中，即每个待测样本分别用此2种pcr反应混合液进行检测。加入量为4.8μl/孔。待测样本的基因组dna浓度为10ng/μl。小心盖上pcr反应管的反应条管盖，轻甩pcr管反应条。将pcr管反应条放置在冰盒上，并把冰盒放置在通往基因扩增区的传递窗。

基因扩增（基因扩增区）。打开仪器窗口，按照以下说明的扩增程序图进行设置，并开始进行pcr扩增。反应结束后，根据扩增曲线，划定合适荧光阈值（将阈值划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间），得到不同通道ct值并计算相关△ct值。

扩增程序（总体系：20μl）：

第一阶段：37℃,10分钟，1个循环；

第二阶段：95℃,5分钟，1个循环；

第三阶段：93℃,15秒;60℃,60秒，40个循环。

信号收集：第三阶段60℃时收集fam和hex（或vic）信号,执行实时pcr保存文件；t790m基因—fam通道采集荧光信号。内标基因—hex/vic/joe通道采集荧光信号。

检验结果的判读

试剂盒有效性判定

弱阳性对照：fam通道ct值≤30，扩增曲线有明显指数增长期。

空白对照：fam通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长。

内标基因：空白对照中hex/vic/joe通道ct值＜30，扩增曲线有明显指数增长期；检测样本和弱阳性反应管中，若fam通道有信号，hex/vic/joe通道偶尔没有信号，此为内标基因的扩增被目的基因的扩增所抑制，属正常现象。

阳性质控品有效性的判定：阳性质控品：fam通道ct值≤30，扩增曲线有明显指数增长期。

样本有效性的判定：

质控pcr反应液：fam通道ct值＜16，样本基因组dna加入过量，建议稀释后重新检测。

质控pcr反应液：fam通道16≤ct≤22，样本基因组dna加入量适中。

质控pcr反应液：fam通道22＜ct＜30，样本基因组dna加入量较低，只有突变dna含量较高的样本可以检测出突变类型。

质控pcr反应液：fam通道ct值≥30，样本基因组dna含量过低，需重新制备样本或者增加使用量进行检测。

检测结果的判定：

根据上述步骤确定有效性后，根据公式“△ct=突变检测ct-质控检测ct”计算有效检测样本的△ct值，并按照以下方法对样本检测结果进行判定，确定样本是否存在突变。

1)样本突变检测ct值＞30或无ct值，则该样本为突变阴性或低于本试剂盒检测下限；

2)样本突变检测ct值≤30，则计算该反应管的△ct值。若该反应管的△ct值小于9，则样本为该反应管对应的突变阳性；反之则为该反应管对应的突变阴性或低于本试剂盒检测下限应的突变阴性。

本发明实施例一的引物可以检出20ngdna样品中含量低至0.125%的egfrt790m基因突变。

效果验证例

使用经数字pcr绝对定量的阳性标准品（catalogno.cbp10402lotno.cgd95017552），做梯度稀释使用现有引物和本发明引物进行对比实验；本发明方法与现有方法的区别仅在于，本发明方法采用的检测引物为实施例一的引物1、引物2以及下游引物，现有方法的检测引物如下；其余都一样，为可对比的平行实验。

现有引物序列如下：

上游引物：tccaccgtgcagctcgttat

下游引物：gcaggtactgggagccaata

探针：fam-atgcccttcggctgc-mgb

特异性检测

阴性参考品是浓度为20ng/μl的野生型人dna，阳性参考品为浓度150拷贝/微升、50拷贝/微升的定量的阳性标准品。经过上述pcr反应体系配置、基因扩增，得到的检测结果为阴性参考品、阳性参考品符合率100%。

灵敏度检测

阴性参考品是浓度为50ng/μl的野生型人dna，阳性参考品为10ng含有0.5%的定量阳性标准品、10ng含有0.25%的定量阳性标准品、10ng含有0.125%的定量阳性标准品。

经过上述pcr反应体系配置、基因扩增，结果见附图4-图7，可以看出，本发明方法对阴性参考品未见扩增曲线，对含有0.125%的定量阳性标准品具有明显的扩增效果。经过样本有效性以及结果判定得到的结论如下：

与现有技术相比，本发明可显著提升检测灵敏度，可将检测灵敏度从0.5%提升至0.125%。

进一步的，利用本发明引物对5ng含有0.1%的定量阳性标准品也具有明显的扩增效果，结果判读为阳性。

进一步的，如果仅采用引物1或者仅采用引物2作为上游引物，进行同样的扩增反应（10ng含有0.5%的定量阳性标准品），没有扩增曲线。综上所述，本方案以长引物1的高特异性扩增出少量含有突变的模板，使用引物2高效特异性放大信号，解决传统扩增受阻突变系统（arms）的引物设计时在引物设计时难以兼顾特异性和灵敏度的问题。本方法检测灵敏度可达到0.125%甚至更低，较传统方法检测灵敏度0.5%取得显著进步。

序列表

<110>苏州科诺医学检验实验室有限公司

<120>一种检测血浆游离dna中egfr基因t790m突变的引物对及试剂盒

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>2

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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tccaccgtgcagctcgttat20

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gcaggtactgggagccaata20

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