基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用与流程

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用。

背景技术：

在复杂的口腔微环境中，牙周组织高度动态平衡。牙周稳态是实现咀嚼、发音等口腔正常生理功能及正畸、种植等临床治疗方式的生物学基础。牙周稳态失衡可导致牙周附着丧失、牙槽骨破坏，引发牙周病。牙周病具有发病率高、破坏易、恢复难的特点，是人类最常见的失牙原因，与多种全身系统性疾病密切相关，已被世界卫生组织列入危害人类健康、需要重点防治的慢性疾病之一。因此，探索牙周稳态维持机制及牙支持组织损伤修复重塑机制是回答牙周病预防及治疗的关键突破点。

牙周组织是由牙槽骨牙骨质两个矿化组织及一个夹在其中的致密纤维结缔组织牙周膜牙龈组成的三层牙齿附着装置。牙周膜，这层未矿化且质韧的组织分泌纤维一端埋入牙骨质，一端埋入牙槽骨如桥梁般将牙齿弹性而牢固地锚定在牙槽窝内。这种弹性连接方式允许了牙周组织在受到外界刺激时牙周膜快速做出应答协调平衡，具体过程包括新骨沉积及旧骨吸收，纤维基质的降解与分泌形成。而牙周膜干细胞(humanperiodontalligamentstemcells，hpdlscs)由于其自我更新及多向分化潜能，在刺激应答及生理改建的过程中发挥着尤为重要的作用。为了更好地回答牙周病如何预防与治疗，我们需要进一步研究hpdlscs在其中发挥的作用及相关机制。目前已经发表了一些文章，从hpdlscs入手解答牙周发病机制或以hpdlscs为种子细胞体外再生牙周组织。但是由于现有技术难以精确定义组织细胞类型——多数研究只能沿用常见间充质干细胞表面标记进行筛选，然而干细胞标记纷繁多样，不同文章所选用的标记不同，这导致了对牙周膜干细胞的定义似是而非缺乏特异性，另一方面其带来的混乱的分化调控机制阻碍了关键机理的研究以及临床治疗的转化。由此，分离，筛选，鉴定牙周膜特异性干细胞成为研究的重中之重。

单细胞测序(single-cellrnasequencing，scrna-seq)的出现突破了现有技术的瓶颈，通过对组织内每一个细胞进行测序获得其独特的转录组特点，进而根据转录组对每一个细胞进行精确分群。在单细胞测序技术的支持下，绘制组织细胞图谱以及发现组织特异性细胞类型成为可能。已有文章报道在骨髓、视网膜，乳腺中发现组织特异性干细胞新亚群。那么对于牙周膜，是否存在这样一群组织特异性干细胞呢？如果存在，在牙周组织稳态的维持与组织损伤修复中又发挥了怎样的作用呢？又是如何促进疾病转归的呢？

技术实现要素：

技术问题：目前临床传统采用牙周洁治、刮治、根面平整等法治疗，只能在一定程度上控制病变发展，对已破坏的牙周组织再生修复无法改善。现有技术局限于基于干细胞的牙周组织工程。但由于研究技术的限制导致组织工程成果无法临床转化——①研究者仅能通过常见间充质表面标记物筛选牙周膜干细胞，通过这种方式获得的细胞群体，是一群生物学功能不同，谱系不同，分化倾向不同的混杂细胞群体，因而对疾病有不同的转归。仅通过常见表面标记物无法真正了解疾病的转归，干预更是无从谈起；②种子细胞是牙周再生治疗的关键。目前，用于牙周组织再生治疗的种子细胞来源有胚胎干细胞和成体干细胞。部分研究者选择胚胎干细胞进行针对性基因编辑辅助牙周组织纤维形成，但取材困难，存在伦理问题，不具有普遍性；还有研究者选择bmscs作为研究对象，但却未考虑到其异体移植的抗原反应及难获取性；③组织工程本身利用表面标记物筛选细胞后体外扩增培养，移植入裸鼠背部皮下形成牙周组织类器官。这种体外模拟的方式与体内实际情况千差万别，无法真实反映体内情况；综上，现有技术均无法从混杂的细胞群体中分离、筛选、鉴定出维持牙周稳态的细胞亚群。

发明目的：牙周稳态对于口颌系统功能的发育，维持，改建以及多种口腔治疗方式的开展非常重要。目前对于维持/恢复牙周稳态的真正细胞群体尚未有明确定论。本发明对牙周组织进行单细胞测序，通过转录组水平筛选可能维持/恢复牙周稳态的特异性牙周膜干细胞亚群，通过标记基因进行体外流式分选及多向分化潜能的验证，利用模式动物构建creer-loxp诱导型报告基因系统进行体内谱系示踪验证其干性、命运转归及维持/恢复牙周稳态的核心基因组特征，从而达到分离、筛选、鉴定牙周膜特异性干细胞亚群的目的。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法，包括以下步骤：

a.获取因正畸需要拔除的健康前磨牙；

b.制备牙周膜组织的单细胞悬液；

c.通过细胞染色对单细胞悬液样品质量进行检测；

d.单细胞转录组测序分析；

e.生物信息拟时序分析发现牙周膜干细胞可能新亚群，明确该可能新亚群的高特异性，高灵敏度标志基因；

f.体外根据标志基因分选人牙周膜亚群，体外培养，并验证其干性；

g.构建候选群体的标记基因启动子所驱动的creer小鼠进行谱系示踪及细胞剔除验证；

h.利用步骤g构建的小鼠模型进行体内验证。

进一步的，采用本发明所述的方法获得的牙周膜特异性干细胞新亚群。

进一步的，牙周膜特异性干细胞新亚群特异性表达fbln2及膜蛋白cadm3。

本发明所述的牙周膜特异性干细胞新亚群用于制备牙周病治疗的药物的应用。

有益效果：本发明提供了一种基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用，本发明通过单细胞测序、获得牙周膜特异性干细胞亚群，并通过标记基因进行体外流式分选及细胞亚群性能的验证；本发明筛选的细胞亚群利于寻找牙周稳态失衡的干预靶点，为新药物的开发创造可能；以牙周膜特异性干细胞为种子细胞形成类器官，为医疗器械新材料的研究和验证提供科学依据；进一步探索牙周膜干细胞自体/异体移植可行性，为治疗牙周病提供重塑新思路。

附图说明

图1为人牙周膜组织单细胞悬液制备及单细胞测序示意图。

图2为单细胞转录组测序的结果分析图；a为2d-tsne图展示的5562个牙周膜细胞单细胞rna-seq聚类分析着色结果图；b为单个基因tsne图和violin图显示的已知牙周膜细胞类型和代表性标志基因的表达水平和分布图；c为2d-tsne图显示的5个典型msc标志基因在牙周膜组织中的表达水平和分布图；d为细胞类型富集基因热图；e为牙周膜组织新亚群go分析图；f为单个基因tsne图和violin图显示的新亚群标志基因的表达水平和分布图。

图3为牙周膜组织细分群分析图；a为对原3、5、6、8细胞群进一步细分得到o1～o9细胞亚群的结果图；b为细分群细胞类型富集基因热图；c为2d-tsne图显示的6个典型msc标志基因在细分群的细胞群体中的表达水平和分布图；d为拟时序分析显示各亚群发育轨迹图。

图4为体外验证新亚群特性的结果图；a为单个基因tsne图和violin图显示的新亚群标志基因的表达水平和分布图；b为人和小鼠牙周膜免疫组化ihc显示表达fbln2的结果图；c为小鼠牙周膜免疫荧光if显示表达fbln2的结果图；d为选取cd146作为阳性对照，使用cadm3体外分选新亚群的结果图；e为cadm3+细胞体外单克隆结晶紫染色、alp、茜素红、油红o多向分化染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法

本发明提供了一种基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法，包括以下步骤：

a.选取因正畸需要拔除的健康前磨牙，要求牙齿形态完整，无龋坏、无牙体、牙髓、牙周、根尖周组织疾病，拔出时无污染(考虑因需要可在拔牙前洗牙、漱口、消毒等)，牙齿拔出后立即置于含有2％fbs，2％双抗的α-mem培养液中，低温快速转移至生物安全柜内。

b.牙周膜组织的单细胞悬液制备

①在紫外线照射消毒后的生物安全柜内用持针器牙根朝上夹紧牙齿冠部；

②用含2％的青/链霉素双抗的pbs缓冲液反复冲洗(pbs液清洗根面15-20次)，直至牙齿表面无血污；

③用无菌手术尖刀片刮去根上1/3的牙龈组织，注意保持根部组织湿润；

④将上述去除牙龈组织的牙齿转移至15ml离心管中，按照每颗牙齿加入1.5ml3mg/ml的i型胶原酶和1.5ml4mg/ml的ii型dispase酶于37度恒温摇床220rpm消化45min；

⑤加入10ml含10％fbs的α-mem完全培养液终止消化，通过40μm滤网初步去除杂质，500g离心7min，吸去上层清液；

⑥加入6倍体积的红细胞裂解液，4度条件下孵育5min，再加入过量pbs清洗1～2次，600g，8min离心，去除上层清液，加入200ulbdbuffer。

c.单细胞悬液样品质量检测

①钙黄绿素及draq7荧光染色检测细胞活性及细胞数量，评判是否符合单细胞上机要求。

d.单细胞转录组测序分析

①单细胞捕获；

②cb/umi标签添加；

③rna反转录；

④文库构建；

⑤高通量测序。

人牙周膜组织单细胞悬液制备及单细胞测序示意图如图1所示。

e.生物信息拟时序分析发现牙周膜干细胞可能新亚群，明确该可能新亚群的高特异性，高灵敏度标志基因

数据分析：标准化(cellnormalization)，细胞分群(cellcluster)，rdsplot分析，细胞再分群(recluster)，拟时序分析(pseudotime)，基因功能分析(goanalysis)，信号通路分析(pathwayanalysis)，scenic(singlecellregulatorynetworkinferenceandclustering)，qusage分析，细胞通讯分析(cellphoneanalysis)，scgenemodule分析。

f.体外根据标志基因分选人牙周膜亚群，体外培养，并验证其干性

①如前所述消化酶解人牙周膜组织得到单细胞悬液，使用完全培养液mem(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)贴壁培养，第3d首次换液，弃去悬浮细胞，此后每3d换液一次。待细胞生长达80％融合后用0.25％胰酶进行传代。取第1～4代生长良好的细胞用于后续流式分选。

②流式分选

0.25％胰酶消化得到牙周膜单细胞悬液，cd16/cd32进行细胞表面fc受体封闭，偶联荧光素的cadm3⁺抗体(候选细胞亚群的标记基因编码)进行细胞表面标志染色，dapi(0.05-0.2μg/ml)进行活死染色，流式分选该膜蛋白高表达的活细胞群体，同时分选mcam⁺细胞亚群作为阳性对照。

③检测干细胞特性

成骨向分化：当细胞达到80％融合时更换成骨诱导液，每3天换液。诱导7天时检测相关蛋白、mrna改变，分别于第7天和14天行碱性磷酸酶酶化学染色和茜素红染色。

成软骨向分化：3-4×10⁵细胞用0.5ml人骨髓间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬，放置于37℃，5％co2的培养箱中培养至细胞团出现聚拢现象，每隔2-3d给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基至形成软骨球，阿利欣蓝染色鉴定。

成脂向分化：照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种在六孔板中，待细胞80％融合后，向六孔板中加入2ml成脂诱导分化培养基a液，诱导3天后，吸走六孔板中的a液，加入2ml成脂诱导分化培养基b液，24h后，吸走b液，换回a液进行诱导，a液和b液交替作用3-5次后(12-20天)显微镜观察脂滴。

成神经分化：细胞以5000个/cm²接种于多聚赖氨酸包被的载玻片上，neurobasal培养基，添加1％its，100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)5天；后neurobasal培养基，添加100ng/mlbfgf，10ng/mlfgf8，100ng/ml(shh)5天，后if检测nestin，beta3-tubulin结晶紫染色：用4％多聚甲醛固定，蒸馏水洗涤后，结晶紫染色液染色后显微镜观察所形成单克隆集落。

g.构建候选群体的标记基因启动子所驱动的creer小鼠进行谱系示踪及细胞剔除验证

①通过crispr/cas9技术对候选标记基因进行修饰，在其终止密码子前插入p2a-cre^ert2，获得他莫昔芬诱导的诱导型条件性cre表达小鼠模型，构建候选群体的标记基因启动子所驱动的creer小鼠。

②构建诱导型条件性荧光表达小鼠模型：标记基因-cre^ert2小鼠与r26^tdtomato小鼠经过一代杂交获得诱导型条件性荧光表达小鼠。

③构建诱导型细胞剔除小鼠模型：标记基因-cre^ert2和r26^dta(rosa26-loxp-stop-loxp-dtr)小鼠交配，获得细胞剔除模型小鼠。

h.体内验证

①利用诱导型条件性荧光表达小鼠，通过谱系示踪分析特定细胞亚群的命运转变及功能效应。

②利用诱导型细胞剔除小鼠模型验证牙周膜特异性干细胞亚群在牙周组织生长改建及组织损伤修复过程中的作用及功能。

③流式分选特定细胞亚群，体外培养后通过生物材料植入免疫缺陷小鼠皮下验证能否形成牙周组织类器官。

实施例2实验结果分析

(1)单细胞转录组测序分析发现新亚群

根据单细胞转录组测序分析，绘制了牙周膜组织图谱，共分为14个亚群，分别为成纤维细胞(0～4)、成骨细胞(5)、新亚群newpopulation(6)、内皮细胞(7)、周细胞(8)、t细胞(9)、上皮细胞(10)、巨噬细胞(11)、中性粒细胞(12)、单核细胞(13)和可能施旺细胞(14)。从图2可知，单细胞转录组测序揭示可能存在牙周膜组织特异性新亚群(群体6)，图2a的2d-tsne图展示5562个牙周膜细胞单细胞rna-seq聚类分析着色结果，牙周膜组织新亚群以深蓝色颜色标注圈出；2b的单个基因tsne图和violin图显示了已知牙周膜细胞类型和代表性标志基因的表达水平和分布；2c的2d-tsne图显示5个典型msc标志基因在牙周膜组织中的表达水平和分布，渐变颜色从灰色到红色表示基因表达水平从低到高；2d为细胞类型富集基因热图，每列代表一种细胞，每行代表一个标志基因；2e的牙周膜组织新亚群(群体6)go图分析其可能功能效应；2f的单个基因tsne图和violin图显示了新亚群(群体6)标志基因的表达水平和分布。

(2)进一步对已知群体与新亚群进行细分群，通过常见msc标记以及生信拟时序分析推测新亚群(群体6)可能是牙周膜组织特异性干细胞亚群

为了进一步了解新亚群的功能，对原3，5，6，8细胞群进一步细分得到o1～o9细胞亚群，其中o2和o6亚群由原先新亚群(newpopulation)分出，如图3a所示；细分群细胞类型富集基因热图如图2b所示，每列代表一种细胞，每行代表一个标志基因；图3c的2d-tsne图显示6个典型msc标志基因在细分群的细胞群体中的表达水平和分布，渐变颜色从灰色到红色表示基因表达水平从低到高，说明常见msc标志较集中表达在新亚群；图3d为拟时序分析显示各亚群发育轨迹图，拟时序分析显示新亚群位于发育上游起点位置，从而得出o6是牙周膜组织特异性干细胞。

(3)体外验证该亚群具有干性及多向分化潜能

分析o6的高表达基因，从特异性与灵敏度挑选新亚群的标志基因，分别为fbln2及膜蛋白cadm3，图4a显示了新亚群标志基因的表达水平和分布；免疫组化及免疫荧光染色结果证实在人和小鼠的牙周膜中fbln2于血管周围特异性表达，见图4b-c；进一步利用亚群特异性表达膜蛋白cadm3，流式分选，体外培养，观察及多向分化明确其干性；以前人常用的msc标志cd146作为阳性对照，分选cadm3强阳性的细胞群体，见图4d；图4e的cadm3+细胞体外单克隆结晶紫染色、alp、茜素红、油红o多向分化染色显示，cadm3+细胞具有体外形成单克隆集落能力以及多向分化潜能，表明其具有干性。