一种双胞旋沟藻细胞核增殖抗原基因及其应用

1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种双胞旋沟藻细胞核增殖抗原基因及其应用。


背景技术：

2.从藻类中克隆出目的基因最常用的方法是pcr扩增克隆法，即在已知藻株目的基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库(genbank)中找到有关基因序列，据此合成寡聚核苷酸引物，从生物体中提取dna或rna，进行pcr扩增，扩增的目的片段纯化后插入到合适的质粒载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列比较，以获得目的基因。该技术的优点在于对已知序列的基因进行扩增是基因克隆方法中最为简便的一种，即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据，但旋沟藻的细胞核增殖抗原基因(pcna)还未曾被报道过，没有准确的参考序列以及pcr扩增方法，在双胞沟藻上扩增目的基因序列就尤为艰难，不仅需要从海量的数据库中查找相近物种的细胞核增殖抗原基因序列(pcna)作为依据，还需探究扩增克隆出该基因的方法。
3.已有研究表明，在甲藻中，pcna基因的拷贝数与基因组大小呈较强的正相关关系。细胞快速分裂是浮游植物种群发展和扩大的重要决定因素之一，因此，与增殖状态相关的功能基因pcna可成为赤潮爆发藻快速生长的有用监测物，研究发现pcna基因的表达与某些藻生长速率呈正相关的关系，pcna作为一种潜在的分子标记物，可以用来估计浮游植物的生长速率。另外，蛋白质序列的进化式样较dna序列简单，用于探讨系统发育的效果更好，有研究表示pcna氨基酸序列具有其基因家族特有的保守基序，在不同类群的生物体中具有保守功能，可为研究甲藻的系统发育提供蛋白质方面的证据。


技术实现要素：

4.因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中的旋沟藻的细胞核增殖抗原基因(pcna)还未曾被报道过，没有准确的参考序列以及扩增方法，在双胞旋沟藻上扩增目的基因序列更为艰难，从而提供一种核酸分子，生物材料，引物对，一种扩增藻细胞核增殖抗原基因的方法，蛋白片段，蛋白片段在甲藻的系统发育中的应用，核酸分子、生物材料、或引物对在制备胁迫条件下藻pcna基因表达量变化的产品中的应用。
5.本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列为seq no.1。
6.如下任一所述生物材料，为下述a1)至a7)中的任一种：
7.a1)含有权利要求1所述核酸分子的表达盒；
8.a2)含有权利要求1所述核酸分子的重组载体；
9.a3)含有a1)所述表达盒的重组载体；
10.a4)含有权利要求1所述核酸分子的重组微生物；
11.a5)含有a1)所述表达盒的重组微生物；
12.a6)含有a2)所述重组载体的重组微生物；
13.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物。
14.一种引物对，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
15.一种扩增藻细胞核增殖抗原基因的方法，以旋沟藻属的基因组dna或cdna为模板，用引物对进行pcr；pcr扩增体系中上游引物和下游引物的浓度均为5um
‑
10um；pcr反应程序：预变性：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s；35个循环；延伸：72℃，10min。
16.所述藻为旋沟藻属(cochlodinium schutt)；可选的，所述藻为双胞旋沟藻(cochlodinium geminatum)。
17.蛋白片段，是如下a)或b)或c)的蛋白片段：
18.a)氨基酸序列如seq id no:2所示；
19.b)在seq id no:2所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；
20.c)将seq id no:2所示的氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白片段。
21.上述蛋白片段在甲藻的系统发育中的应用。
22.上述核酸分子、上述生物材料、或上述引物对在制备胁迫条件下藻pcna基因表达量变化的产品中的应用。
23.可选的，所述胁迫为生物胁迫或者非生物胁迫；可选的，所述非生物胁迫为溶藻细菌胁迫。
24.可选的，所述藻为旋沟藻属(cochlodinium schutt)；可选的，所述藻为双胞旋沟藻(cochlodinium geminatum)。
25.本发明技术方案，具有如下优点：
26.1、本发明提供一种一种扩增藻细胞核增殖抗原基因的方法，以旋沟藻属的基因组dna或cdna为模板，用上述引物对进行pcr；pcr扩增体系中上游引物和下游引物的浓度均为5um
‑
10um；pcr反应程序：预变性：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s；35个循环；延伸：72℃，10min。以该方法可为旋沟藻属的其它种的pcna基因的扩增提供技术参考。
27.2、本发明提供核酸分子。扩增出的双胞旋沟藻pcna基因序列是后续研究的前提，可用于探究旋沟藻pcna基因的拷贝数，其表达量与细胞生长的关系，以及作为分子标记物监测赤潮爆发藻快速生长情况等。
28.3、本发明提供蛋白片段，是如下a)或b)或c)的蛋白片段：a)氨基酸序列如seq id no:2所示；b)在seq id no:2所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；c)将seq id no:2所示的氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白片段。pcna氨基酸序列具有其基因家族特有的保守基序，在不同类群的生物体中具有保守功能，构建甲藻的pcna氨基酸系统发育树，探讨它们之间的亲缘关系，可为研究甲藻的系统发育提供蛋白质序列方面的证据。
29.4、本发明提供核酸分子、生物材料或引物对在研究胁迫条件下藻pcna基因表达量变化中的应用。双胞旋沟藻pcna基因在溶藻细菌胁迫下的表达量变化见图6，从图6中可以看出，加入溶藻细菌上清液后，7h pcna基因的表达没有受到抑制，20h pcna基因表达受到抑制，其表达量降低，推测20h后藻的细胞核遗传受到影响。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1是本发明实施例目的片段电泳图；
32.图2是本发明实施例重组子在平板上长出单菌落；
33.图3是菌液pcr鉴定结果；
34.图4(a)是核苷酸序列blast比对结果；
35.图4(b)是氨基酸序列blast比对结果；
36.图5 pcna蛋白的系统发育树；
37.图6是实施例2pcna基因的表达量变化。
具体实施方式
38.实施例1双胞旋沟藻(cochlodinium geminatum)细胞核增殖抗原基因的获得
39.1双胞旋沟藻(cochlodinium geminatum)总rna的提取(此过程冰上操作)
40.①
取50ml双胞旋沟藻(cochlodinium geminatum)于离心管中静置，待藻液自然沉淀在底部，8000rmp离心5min，吸去上清后迅速加入500μlrnaiso plus(takara，货号9108)；
41.②
加入100μl氯仿，上下颠倒5
‑
6次，室温放置10min；
42.③
4℃，10000rpm，离心15min；
43.④
取上清200μl，加入200μl异丙醇(
‑
20℃预冷)，上下颠倒5
‑
6次，室温放置10min；
44.⑤
4℃，10000rpm，离心15min；
45.⑥
弃上清，加入500μl75％(v/v)乙醇(3ml乙醇+1ml rnase free水)洗涤，4℃，10000rpm，离心15min(重复2次，空离心1次)；
46.⑦
用10μl移液枪小心吸走多余的乙醇，超净台上干燥3min后加入10μl rnase free水。
47.2 rna检测
48.使用nanodrop 2000c超微量分光光度计，用rnase
‑
free水调零，测定rna样品浓度和纯度(od
260nm
/od
280nm
)。经测定rna的浓度和纯度分别为634.2ng/ul，纯度2.03。
49.3 rna的反转录反应
50.cdna的合成采用primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)试剂盒(takara，货号rr047a)，操作方法如下：
51.①
去除基因组dna
52.冰上溶解各种试剂后，依次加入2μl的5
×
gdna eraser buffer，1.0μl的gdna eraser，1μl的total rna和6.0μl的rnase free dh2o，充分混匀并短暂离心后，置于42℃孵育2min，取出后4℃暂存。
53.②
反转录反应
54.在所得的上步10.0μl反应液中，依次加入1.0μl的primescript rt enzyme mix i，1.0μl的rt primer mix，4.0μl的5
×
primescript buffer 2(for real time)和4.0μl的
rnase free dh2o，混匀后，将反应管置于pcr仪器中进行反转录反应，37℃孵育15min，85℃处理5s，取出的cdna样品保存在
‑
20℃。
55.4引物设计与合成
56.设计细胞核增殖抗原基因特异性引物，由华大基因公司合成。
57.kbf(正向)：5
’‑
agtcgatgccatgaaggac
‑3’
(seq id no：3)
58.kbr(反向)：5
’‑
catggtctcgccaaactcct
‑3’
(seq id no：4)
59.5目的基因序列的pcr扩增
60.pcr扩增体系为：模板dna 2μl，正反引物各1μl(正向引物的浓度为10um，反向引物的浓度为10um)，premix taq(takara code no.rr902a)25μl，补充ddh2o至50μl。pcr反应程序：预变性：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s；35个循环；延伸：72℃，10min。pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行电泳，用凝胶成像仪观察结果并拍照，见图1。由图1可知扩增到的目的片段大约为430bp。
61.6 pcr产物切胶回收
62.将凝胶转移至紫外灯上，切下清晰单一的条带切胶，用凝胶回收试剂盒(omega，货号d2500
‑
01)回收。
63.7目的基因的克隆
64.①
在灭菌的0.2ml离心管中加入4.5μl的目的片段dna，加入0.5μlpmd18
‑
t vector(takara，货号6011)，再加入ligation solution 5μl，16℃反应连接8个小时。
65.②
将5μl连接产物加入到50μl e.coli dh5α感受态细胞中(takara，货号9057)，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30min；
66.③
42℃水浴热激转化90sec，立即放回冰上，放置3min；
67.④
每管加入500μl lb培养基(室温放置)，37℃170rpm振荡培养60min，使菌体复苏并表达抗性基因；
68.⑤
在含有amp(500μg/ml)的选择性平板上加入60μl菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用parafilm膜封好；
69.⑥
将培养皿正放，37℃约30min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养12h。
70.⑦
待菌落长出后(见图2)，用无菌枪头挑取平板上的单菌落，接种到3ml lb液体培养基中(含500μg/ml amp)，37℃，165rpm振荡培养12h。
71.⑧
用2μl菌液做进行pcr鉴定，操作步骤同5，结果见图3，第二泳道所用引物是pcna目的片段引物kbf/r(seq id no：3和seq id no：4组成的引物对)，扩出目的片段约430bp，第三泳道所用的引物为载体通用引物m13
‑
47和rv
‑
m，m13
‑
47的序列为cgccagggttttcccagtcacgac(seq id no：9)；rv
‑
m的序列为gagcggataacaatttcacacagg(seq id no：10)，扩增出600bp左右的片段(若载体未插入目的基因片段，通用引物m13
‑
47/rv
‑
m的扩增的条带片段大小为150bp左右)，说明载体中已插入目的片段并导进e.coli dh5a感受态细胞中。阳性菌液由华大基因公司测序，得到430bp的核苷酸序列，具体序列见seq id no：1，该基因序列编码的蛋白片段的氨基酸序列如seq id no：2所示。
72.8目的基因序列与蛋白质序列系统发育分析
73.seq id no：1在ncbi用blastn进行比对鉴定(见图4a)，用expasy软件将目的基因序列翻译成氨基酸(seq id no：2)在ncbi用blastp进行同源比对(见图4b)。从图4中可以看
出，在ncbi上对pcna核苷酸序列进行比对，与karlodinium rotundatum同源性为79.86％，与prorocentrumminimum同源性为78.65％，与karenia mikimotoi同源性为77.49％，与karenia brevis同源性为75.75％，因此，将核苷酸序列如seq id no：1所示基因命名为pcna基因。氨基酸序列在ncb上对pcna氨基酸序列进行比对，与akashiwo sp.同源性为90.21％，与prorocentrum minimum同源性为90.21％，与karenia brevis同源性为89.51％，与alexandrium affine同源性为89.51％，与karenia mikimotoi同源性为88.81％，因此将氨基酸序列如seq id no：2所示的蛋白命名为pcna蛋白。
74.下载与seq id no：2有较大相似性的相关序列，采用clustal x进行多序列对齐排列，mega7的kimura 2
‑
parameter模型计算各序列间的距离，采用邻接法neighbour
‑
joining(nj)法构建系统发育树，自举数据集(bootstraptest)为1000，见图5。从图5中可以看出，裸甲藻目(gymnodiniales)、膝沟藻目(gonyaulacales)、多甲藻目(peridiniales)、原甲藻目(prorocentrales)、suessiales目，各自为一大类群，双胞旋沟藻的pcna蛋白的氨基酸序列在裸甲藻目(gymnodiniales)分支里。
75.实施例2双胞旋沟藻pcna基因在溶藻细菌胁迫下的表达量变化
76.1、加入溶藻细菌上清液到2216e液体培养基中培养的双胞旋沟藻中，使得溶藻细菌上清液在液体培养基中的体积百分含量为3％，为处理组；加入等量2216e培养基作为对照组，分别在7h和20h取对照组和处理组各100ml藻液，进行rna提取(具体方法同实施例1)。溶藻细菌上清液的获得过程为：1ml的菌液加入到100ml的2216e液体培养基中，30℃，180rpm培养48h，将发酵液12000rpm离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后即得。
77.2、提取的总rna，采用primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)试剂盒进行反转录(具体方法同实施例1)。
78.3、采用tb green premix ex taq
tm
ii荧光定量试剂盒(takara，货号rr820a)进行实时荧光定量pcr反应，实时荧光定量pcr所用引物见下表，实时荧光定量pcr反应体系见下表。
79.表1实时荧光定量pcr所用引物
[0080][0081]
表2实时荧光定量pcr反应体系
[0082]
[0083]
qrt
‑
pcr反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
[0084]
以18s rrna作为内参基因，pcna为目的基因，采用2^
‑
δδct法计算双胞旋沟藻pcna基因在溶藻细菌胁迫下的表达量变化见图6，从图6中可以看出，加入溶藻细菌上清液后，7h pcna基因的表达没有受到抑制，20h pcna基因表达受到抑制，其表达量降低，推测20h后藻的细胞核遗传受到影响。
[0085]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。