本发明涉及一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法。
背景技术：
偏甘油酯是甘油二酯与甘油单酯的统称，而甘油二酯和甘油单酯都可以作为食品的添加剂。甘油单酯可以作为乳化剂用于食品，药品以及化妆品领域，甘油二酯则已被认证为安全无毒副作用，且可有效预防脂肪积累调节体脂的一种新型健康油脂。一般说来，偏甘油酯的生产可分为化学法与生物酶法，化学法虽然成本低廉，易进行规模化生产，但是其本身具有生成副产物多，污染大，反应能耗高的缺点。生物酶法的出现很好的解决了这些问题，酶法生产偏甘油酯不仅反应效率高，无副反应，且节能环保，可得到色泽，感官，味道优良的加工油品。
目前油脂生产的方法主要分为化学法和生物酶法，因为化学法能耗高、对环境有部分污染、存在安全隐患等问题，生物酶法制备油脂近年来成为了人们的研究热点，生物酶法制备油脂大体上包括酯化法、水解法、甘油解法，酯化法和水解法虽然可以生产出甘油二酯和甘油单酯的混合物，但是水解法会产生大量脂肪酸和甘油副产物，且体系中甘油二酯与甘油单酯的含量较低，而酯化法的生产成本较高且产物的生成率较低，不符合工厂的生产需要，因此我们选择原料利用率高，操作简便，产物生成率高的甘油解法进行生产。
生物酶法制备油脂的体系一般包括无溶剂体系、有机溶剂体系、超临界co2体系等，但是因为使用超临界co2体系费用昂贵，所以一般不采用此方法进行生产。而在无溶剂体系下，甘油的粘度以及其和油脂不互溶的性质会影响反应的进行，而在有机溶剂体系下，不仅可以增进甘油和植物油脂的溶解，而且可以增进物质之间的传质作用。因此开发新的甘油解工艺来提高生产效率生成高含量的偏甘油酯对于工厂生产来说具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对于现有偏甘油酯生产工艺的不足，开发一种固定化脂肪酶制备偏甘油酯的方法，在有溶剂体系下，提高偏甘油酯的产率，且无副产物产生。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法，包括如下步骤：
(1)制备lipasemas1突变体的固定化脂肪酶，lipasemas1突变体为mas1-h108a，其氨基酸序列如seqno.2所示；
(2)酶催化甘油解反应制备偏甘油酯，按质量份计；将1～10份植物油，1～4份的甘油，0～40份有机相试剂，与0.2～1.5份lipasemas1突变体的固定化脂肪酶混合，在40～55℃的温度下反应1～6小时，得到产物混合物；
(3)产物混合物经分离得到偏甘油酯。
优选地，所述固定化载体为ecr8285、ecr8806、xad1180n、xad1180或ecr1030。
优选地，步骤(1)中所述固定化脂肪酶的制备，按质量份计：取3～10份固定化载体，6～20份质量的tris-hcl缓冲液，0.3～1.5份的lipasemas1的突变体混合，在25～35℃下混合搅拌吸附3～5个小时，然后过滤并干燥，得到lipasemas1突变体的固定化脂肪酶。
优选地，所述固定化载体经如下预处理：首先要经过95％的乙醇浸泡24小时，使用蒸馏水水洗至中性；再用5％hcl浸泡24小时，之后使用蒸馏水水洗至中性；再用3％naoh浸泡24小时，之后再使用蒸馏水水洗至中性备用即可。
优选地，所述tris-hcl缓冲液浓度为0.03～0.05mol/l，ph为7.3～7.7。
优选地，步骤(2)的反应体系中水分含量不高于0.05％；固定化脂肪酶加量为底物总质量的2％～15％；植物油与甘油的摩尔比为1：(1～5)；有机相试剂加量为底物总质量的1.5～4倍。
优选地，步骤(2)所述有机相试剂为叔丁醇；所述有机相试剂为15～30份。
优选地，步骤(2)所述反应在气浴摇床转速为150±50rpm/min的条件下进行。
优选地，步骤(3)中分离是指所得混合物经过高速离心分离后，得到上层油脂，再经过多级分子蒸馏，即可得到高纯度的偏甘油酯产品。
优选地，所述离心分离的转速为8000～12000r/min，持续时间为3～5min，所述分子蒸馏蒸发温度为140±20℃，真空压力为10±5pa。
优选地，所述植物油为大豆油，芝麻油，棕榈油，花生油，玉米油，葵花籽油，椰子油，橄榄油，亚麻籽油，山茶籽油，棕榈仁油，棉籽油，红花籽油，稻米油中一种或几种的混合物。
所述游离脂肪酶mas1的氨基酸序列如seqno.1所示。各突变体序列均在此基础上进行单一位点突变获得，mas1-h108a的氨基酸序列如seqno.2所示。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中的lipasemas1突变体的固定化脂肪酶具有很强的生物催化活性以及较高的甘油耐受性，可以在40～55℃、有机溶剂的体系中进行甘油解反应，且不产生脂肪酸等副产物，简化了生产后期有关分离纯化的工序，便于生产作业的进行。
(2)本发明在有溶剂的体系中进行甘油解反应，且反应程度高，反应速率快，生成偏甘油酯含量高，无副反应发生，且固定化酶可以重复利用，成本消耗少，因此有很好的工业前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下提供了几项本发明的实施例，以进一步说明本发明，在所述实施例中，所有百分比均以质量记，同时本发明的保护范围不仅限于此。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
所述固定化载体首先要经过95％的乙醇浸泡24小时，使用蒸馏水水洗至中性；再用5％hcl浸泡24小时，之后使用蒸馏水水洗至中性；再用3％naoh浸泡24小时，之后再使用蒸馏水水洗至中性，放入4℃冰箱中备用即可。
在其中一些实施方式中，控制步骤(1)所述lipasemas1突变体的固定化脂肪酶的制备，选择xad1180、xad1180n、da-201、ecr1030、ecr8285、ecr8806任意一种固定化载体以及mas1-c260s、mas1-c261s、mas1-h108w、mas1-v202f、mas1-v233f、mas1-h108a任意一种脂肪酶mas1突变体进行组合。其中发现，将脂肪酶mas1-h108a与固定化载体ecr8285结合后，固定化脂肪酶mas1-h108a可制备获得最高含量偏甘油酯。
以下实施例中使用的各种酶的来源或参考制备的文献如下：
甘油三酯脂肪酶mas1-h108a参照如下文献制备：李琳琳.固定化脂肪酶mas1-h108a的制备及其催化合成富含α-亚麻酸甘油三酯的应用研究[d].华南理工大学,2019。
甘油三酯脂肪酶mas1-c260s、mas1-c261s、mas1-h108w、mas1-v202f、mas1-v233f参照如下文献制备:赵泽鑫.脂肪酶mas1的结构与耐热及底物选择性关系的研究[d].华南理工大学,2017。
实施例1(无溶剂体系)
取3gecr1030树脂，6gtris-hcl缓冲液，0.3g的游离脂肪酶mas1-v202f混合，在25℃下混合搅拌3小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-v202f，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-v202f于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应5小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量27.36％,甘油二酯含量28.92％，甘油单酯含量为42.06％。在温度为140℃，压力为10pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为88.3％，甘油二酯含量为10.7％；重相组分中甘油三酯含量为56.68％，甘油二酯含量为43.32％，甘油三酯的转化率为71.46％。
实施例2(无溶剂体系)
取5gxad1180树脂，10gtris-hcl缓冲液，1g的游离脂肪酶mas1-h108w混合，在30℃下混合搅拌3小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-h108w，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.38g甘油，以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108w于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为50℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应4小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量17.9％,甘油二酯含量28.2％，甘油单酯含量为53.9％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为98.5％，甘油二酯含量为1.5％；重相组分中甘油三酯含量为44.47％，甘油二酯含量为55.53％，甘油三酯的转化率为81.33％。
实施例3(无溶剂体系)
取10gecr8806树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-v233f混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-v233f，放入4℃冰箱备用。
取6.58g大豆油，3.42g甘油，以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-v233f于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为60℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应6小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量20.4％,甘油二酯含量30.8％，甘油单酯含量为48.8％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为97.7％，甘油二酯含量为2.3％；重相组分中甘油三酯含量为42.73％，甘油二酯含量为57.27％，甘油三酯的转化率为78.82％。
实施例4(无溶剂体系)
取10gecr8285树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.38g甘油，以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为60℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应3小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量11.4％,甘油二酯含量38.8％，甘油单酯含量为49.8％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.4％，甘油二酯含量为0.6％；重相组分中甘油三酯含量为22.73％，甘油二酯含量为77.27％，甘油三酯的转化率为88.11％。
实施例5(有溶剂体系)
取10gecr8285树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量4.38％，甘油二酯含量38.92％，甘油单酯含量为54.03％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.6％，甘油二酯含量为0.4％；重相组分中甘油三酯含量为10.35％，甘油二酯含量为89.65％，甘油三酯的转化率为95.43％。
实施例6(有溶剂体系)
取3gxad1180n树脂，6gtris-hcl缓冲液，0.3g的游离脂肪酶mas1-h108w混合，在30℃下混合搅拌5小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-h108w，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108w于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应3小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量10.76％,甘油二酯含量34.33％，甘油单酯含量为52.69％。在温度为160℃，压力为15pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.4％，甘油二酯含量为0.6％；重相组分中甘油三酯含量为25.12％，甘油二酯含量为74.88％，甘油三酯的转化率为88.78％。
实施例7(有溶剂体系)
取6gda-201树脂，12gtris-hcl缓冲液，0.6g的游离脂肪酶mas1-c260s混合，在30℃下混合搅拌6小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-c260s，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，20ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-c260s于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为60℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应4小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量17.61％,甘油二酯含量29.29％，甘油单酯含量为54.48％。在温度为160℃，压力为15pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.1％，甘油二酯含量为0.9％；重相组分中甘油三酯含量为42.64％，甘油二酯含量为57.36％，甘油三酯的转化率为81.63％。
实施例8(有溶剂体系)
取6gda-201树脂，12gtris-hcl缓冲液，0.6g的游离脂肪酶mas1-c261s混合，在30℃下混合搅拌6小时，然后过滤干燥得到固定化脂肪酶mas1-c261s，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，20ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-c261s于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为60℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应4小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量18.16％,甘油二酯含量27.30％，甘油单酯含量为54.54％。在温度为160℃，压力为15pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.4％，甘油二酯含量为0.6％；重相组分中甘油三酯含量为44.45％，甘油二酯含量为55.55％，甘油三酯的转化率为81.06％。
实施例9(有溶剂体系)
取10gxad1180n树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量10.38％，甘油二酯含量34.90％，甘油单酯含量为52.05％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.6％，甘油二酯含量为0.4％；重相组分中甘油三酯含量为20.35％，甘油二酯含量为79.65％，甘油三酯的转化率为89.17％。
实施例10(有溶剂体系)
取10gxad1180树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量12.76％，甘油二酯含量29.72％，甘油单酯含量为57.52％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.7％，甘油二酯含量为0.3％；重相组分中甘油三酯含量为42.96％，甘油二酯含量为57.04％，甘油三酯的转化率为86.69％。
实施例11(有溶剂体系)
取10gda-201树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量15.76％，甘油二酯含量27.24％，甘油单酯含量为57.00％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.6％，甘油二酯含量为0.4％；重相组分中甘油三酯含量为45.72％，甘油二酯含量为54.28％，甘油三酯的转化率为83.56％。
实施例12(有溶剂体系)
取10gecr1030树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量8.76％，甘油二酯含量32.20％，甘油单酯含量为59.04％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.7％，甘油二酯含量为0.3％；重相组分中甘油三酯含量为19.12％，甘油二酯含量为80.88％，甘油三酯的转化率为90.86％。
实施例13(有溶剂体系)
取10gecr8806树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取7.62g大豆油，2.37g甘油，25ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应2小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量9.41％，甘油二酯含量31.55％，甘油单酯含量为59.04％。在温度为150℃，压力为13pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为99.7％，甘油二酯含量为0.3％；重相组分中甘油三酯含量为24.33％，甘油二酯含量为75.67％，甘油三酯的转化率为90.18％。
实施例14(有溶剂体系)
取10gecr8285树脂，20gtris-hcl缓冲液，1.5g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在35℃下混合搅拌4小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，25ml叔丁醇以及1.5g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为40℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应3小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量5.76％,甘油二酯含量38.33％，甘油单酯含量为53.69％。在温度为160℃，压力为15pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为98.4％，甘油二酯含量为1.6％；重相组分中甘油三酯含量为13.12％，甘油二酯含量为86.88％，甘油三酯转化率为94.64％。
实施例15(有溶剂体系)
取6gecr1030树脂，12gtris-hcl缓冲液，0.6g的游离脂肪酶mas1-h108a混合，在30℃下混合搅拌6小时，然后过滤干燥得到固定化酶mas1-h108a，放入4℃冰箱备用。
取8.28g大豆油，1.72g甘油，20ml叔丁醇以及1g上述固定好的脂肪酶mas1-h108a于烧瓶中，置于气浴摇床中，在温度为60℃下，气浴摇床转速为150rpm/min下反应4小时，停止反应。将反应物倒入离心管以10000rpm/min进行离心分离3min，得到上层油相即为富含偏甘油酯的混合物。取上层油相进行检测，甘油三酯含量7.61％,甘油二酯含量39.29％，甘油单酯含量为54.48％。在温度为160℃，压力为15pa的条件下对离心后对上层油脂进行分子蒸馏，得到轻相组分中甘油单酯含量为97.9％，甘油二酯含量为2.1％；重相组分中甘油三酯含量为16.64％，甘油二酯含量为83.36％，甘油三酯转化率为92.91％。
序列表
<110>华南理工大学
广州永华特医营养科技有限公司
<120>一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法
<160>2
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