一种提高甲醇甲烷发酵活性的方法及其应用

本发明属于有机废水甲烷发酵技术领域，尤其涉及一种提高甲醇甲烷发酵活性的方法及其应用。

背景技术：

甲醇(methanol，dried，ch3oh)系结构最为简单的饱和一元醇，作为化工产业的支柱产品，广泛应用于有机合成、石油化工和林业化工生产中，由此产生的废水中也含有高浓度的甲醇。甲醇对人体毒性较大，口服中毒最低剂量约为100mg/kg(体重)，经口摄入0.3～1g/kg(体重)可致死。同时甲醇对微生物具有一定毒性，浓度为790mg/l的甲醇就能够降低生物滤池中有机物降解效率，浓度为5000mg/l的甲醇则能够抑制消化池中污泥的消化。

甲醇废水是指在甲醇工业生产或使用过程中产生的含甲醇废水，属于易降解高浓度有机废水，国家对甲醇废水的排放有严格的规定，必须经处理达到一定标准后才能排放。目前常见的甲醇废水处理手段主要分为物理处理法、化学处理法和生物处理法等。其中厌氧生物处理法由于处理所需的费用较低，同时能够回收氢气和甲烷等可再生能源，因此得到了广泛的应用。甲醇的厌氧降解主要由产甲烷菌介导，产甲烷菌属于古菌，其生长代谢速率缓慢，对ph、温度和底物浓度等环境因子变化敏感，因此产甲烷步骤被认为是甲烷发酵的限速步骤。虽然甲醇的可生化性较高，但高浓度的甲醇对微生物具有一定的毒性，使得高浓度甲醇废水的处理效能较差。因此，如何开发一种可以提高产甲烷菌群活性的高效甲醇甲烷发酵技术，增加高浓度甲醇废水甲烷发酵效率并降低甲醇废水的处理成本，成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高甲醇甲烷发酵活性的方法，可以有效提高产甲烷菌的群体代谢活性，进而提高甲醇降解速率和产甲烷速率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种提高甲醇甲烷发酵活性的方法，包括：在甲醇甲烷发酵体系中添加n-己酰基高丝氨酸内酯。

优选的，所述n-己酰基高丝氨酸内酯在甲醇甲烷发酵体系中的添加量为4～6μg/l。

优选的，所述甲醇甲烷发酵体系中甲醇的含量为1～10g/l。

优选的，所述甲醇甲烷发酵体系中含有厌氧活性污泥，所述厌氧活性污泥中含有甲基营养型产甲烷菌。

优选的，所述甲醇甲烷发酵体系中还含有基础厌氧培养基。

优选的，将厌氧活性污泥接种到含有甲醇的基础厌氧培养基中，添加n-己酰基高丝氨酸内酯进行甲烷厌氧发酵。

优选的，厌氧活性污泥的接种量为基础厌氧培养基体积的5～20％。

优选的，所述厌氧活性污泥取自甲烷发酵反应器。

优选的，所述甲醇甲烷发酵温度为30～40℃。

本发明还提供了上述方法在处理甲醇废水中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过向甲醇甲烷发酵体系中添加n-己酰基高丝氨酸内酯，可以调控微生物群体感应信号系统，提高厌氧活性污泥的甲酸降解速率，提高产甲烷菌的群体代谢活性，进而提高甲醇甲烷发酵活性，增加培养体系中产甲烷速率。

本发明有助于甲烷发酵体系耐受高浓度的甲醇，提升高浓度甲醇废水甲烷发酵效率并降低甲醇废水的处理成本，提升了经济性和实效性，更易用于工程实践，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为添加c6-hsl、c4-hsl、c12-hsl和c14-hsl后甲醇含量历时曲线；

图2为添加c6-hsl、c4-hsl、c12-hsl和c14-hsl后累积产甲烷量历时曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种提高甲醇甲烷发酵活性的方法，包括在甲醇甲烷发酵体系中添加n-己酰基高丝氨酸内酯(c6-hsl)。

群体感应(qs)系统可控制微生物活性和胞外聚合物合成等多种群体行为，其中由ahls介导的qs系统是依赖于菌体密度的微生物通信系统，随着微生物密度的增加，ahls的分泌量也同步增加，然而大多数参与甲烷发酵的功能菌群只有在受到饥饿胁迫时才会大量分泌ahls。c6-hsl属于微生物qs信号分子ahls中的一种，与丙酸营养型产氢产乙酸菌群和嗜乙酸产甲烷菌群的生长代谢密切相关。本发明对c6-hsl的具体来源不作限定。

甲醇的厌氧降解需在产甲烷菌的作用下才能完成，但由于甲醇对微生物具有一定的毒性，质量浓度为790mg/l的甲醇可使生物滤池中有机物的分解效果减弱，质量浓度为5000mg/l的甲醇可抑制消化池中污泥的消化反应，这就使得高浓度甲醇的甲烷发酵系统易发生酸化，导致甲烷发酵反应失败。本发明发现通过外加群体感应信号分子—c6-hsl，可以调控微生物群体感应信号系统，能够增加微生物胞外聚合物的浓度，使厌氧活性污泥形成絮凝体，增加微生物对不良环境的抗性。同时，添加c6-hsl后，群体感应系统能够通过控制微生物的群体活性提高产甲烷菌的群体代谢活性，进而提高甲醇甲烷发酵活性，提高甲醇的利用效率。

本发明中，c6-hsl在甲醇甲烷发酵体系中的添加量为4～6μg/l，进一步优选为5μg/l。

在本发明甲醇甲烷发酵体系中甲醇的含量为1～10g/l，优选为3～9g/l，更进一步优选为5～7g/l。本发明发现，添加c6-hsl后可以提高产甲烷菌的抗性，在发酵体系中甲醇质量浓度1～10g/l时，并不会发生产甲烷菌活性降低，甲烷发酵反应被抑制的现象。

在本发明甲醇甲烷发酵体系中还可以含有基础厌氧培养基，所述基础厌氧培养基优选为每升培养基中含有2～10g甲醇。本发明对基础厌氧培养基的具体配方和配制方法不作限定。作为一种可选的实施方式，基础厌氧培养基的配制方法为：1l去离子水中加入甲醇10g，nahco34g，na2hpo4·2h2o530mg，kh2po4410mg，nh4cl300mg，cacl2·2h2o110mg，mgcl2·6h2o100mg，nacl300mg，fecl2·4h2o4.5mg，edta·na21.65mg，微量元素液1ml，维生素液1ml。微量元素液配方(mg/l)：h3bo450，zncl250，cucl2·h2o38，mncl2·4h2o50，cocl2·6h2o50，nicl2·6h2o92，na2seo3·5h2o26，na2wo4·2h2o33，na2moo4·2h2o24。维生素液配方(mg/l)：生物素4，烟酸40，维生素b610，维生素b220，维生素b140，维生素b1220，叶酸20，硫辛酸40，对氨基苯甲酸20。取去离子水加入到电热锅中，待加热煮沸后继续加热并用高纯氮气通入锅中，用来吹脱水中的溶解氧，待水中溶解氧含量降低后，将沸水与培养基成分混合，继续通入高纯氮气，待培养基温度降低至35℃～40℃时，用1～2mol/l的naoh和hcl调节ph为6.5～7.5。

在本发明甲醇甲烷发酵体系中含有厌氧活性污泥，优选的，所述厌氧活性污泥中含有甲基营养型产甲烷菌。作为可选的实施方式，厌氧活性污泥可以直接取自升流式厌氧污泥床反应器作为接种物使用，也可以经甲烷发酵体系进行2～3次富集培养后作为接种物使用。本发明对厌氧活性污泥的具体来源不作限定。本发明发现，c6-hsl主要针对厌氧活性污泥中的甲基营养型产甲烷菌进行调控，通过提高菌体对不良环境的抗性和群体活性提高甲烷产量。

本发明对厌氧活性污泥的富集培养方法作详细解释：在上述基础厌氧培养基中接种厌氧活性污泥，并在恒温摇床中培养厌氧活性污泥，待培养体系中甲醇完全降解，将厌氧活性污泥转移至新的发酵体系中，如此重复2～3次得到富集培养后的接种污泥；优选的，厌氧活性污泥的接种量为基础厌氧培养基体积的15～25％，更优选为20％；恒温摇床的培养温度为30～40℃，转速为120～140rpm。本发明发现，通过重复的富集培养，可以提高厌氧活性污泥中甲基营养型产甲烷菌的丰度，减少后续实验时间。本发明中富集培养不是必须步骤。

本发明将厌氧活性污泥接种到含有甲醇的基础厌氧培养基中，添加c6-hsl进行甲烷厌氧发酵。所述厌氧活性污泥的接种量为基础厌氧培养基体积的5～20％，优选为6～10％。本发明对厌氧活性污泥和c6-hsl的添加顺序和添加方式不作限定。作为一种可选的实施方式，将配制好的基础厌氧培养基用注射器转移至血清瓶内，血清瓶事先用高纯氮气吹脱排除空气，装入培养基后继续用高纯氮气吹脱5min，接种培养基体积10％的厌氧活性污泥，用丁基橡胶塞密封后，用注射器向发酵体系中加入5μg/l的c6-hsl。

本发明中甲醇甲烷发酵体系的反应温度为30～40℃，进一步优选为35～37℃。本发明发现，上述反应温度为产甲烷菌生长代谢的最适温度，该温度下进行厌氧发酵更有利于提高菌株的活性，进而提高产甲烷速率。

本发明还提供了上述方法在处理甲醇废水中的工业应用。作为一种可选的实施方式，在实际工业废水处理过程中，不需要添加基础厌氧培养基，直接在甲醇甲烷发酵体系中添加c6-hsl，可以达到提高产甲烷菌对不良环境的抗性和群体活性的效果，进而提高甲烷产量和产甲烷速率。工业废水实际上等同于本发明上述的基础厌氧培养基，两者作用相同。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

接种物取自升流式厌氧污泥床反应器的厌氧活性污泥，该反应器的有机负荷为5kg/(m³·d)，日容积产气率为2.1l/(l·d)。

基础厌氧培养基配方：1l去离子水中加入甲醇10g，nahco34g，na2hpo4·2h2o530mg，kh2po4410mg，nh4cl300mg，cacl2·2h2o110mg，mgcl2·6h2o100mg，nacl300mg，fecl2·4h2o4.5mg，edta·na21.65mg，微量元素液1ml，维生素液1ml。

微量元素液配方(mg/l)：h3bo450，zncl250，cucl2·h2o38，mncl2·4h2o50，cocl2·6h2o50，nicl2·6h2o92，na2seo3·5h2o26，na2wo4·2h2o33，na2moo4·2h2o24。

维生素液配方(mg/l)：生物素4，烟酸40，维生素b610，维生素b220，维生素b140，维生素b1220，叶酸20，硫辛酸40，对氨基苯甲酸20。

基础厌氧培养基配制方法如下(1l)：按照培养基成分将药品称量后加入至锥形瓶中。取去离子水加入到电热锅中，待加热煮沸后继续加热并用高纯氮气通入锅中，用来吹脱水中的溶解氧。待水中溶解氧含量降低后，将沸水注入到锥形瓶内，继续通入高纯氮气，待培养基温度降低至40℃时，用1mol/l的naoh和hcl调节ph为7。

取上述配制完成的培养基5份进行单因素对照实验：

实验组：加入c6-hsl；

对照组1：加入n-丁酰基高丝氨酸内酯(c4-hsl)；

对照组2：加入n-十二酰基高丝氨酸内酯(c12-hsl)；

对照组3：加入n-十四酰基高丝氨酸内酯(c14-hsl)；

空白对照组：加入与实验组同体积煮沸后的去离子水。

分别用装有兽用长针头的注射器将100ml培养基转移到250ml血清瓶内，血清瓶事先用高纯氮气吹脱排除空气，装入培养基后继续用高纯氮气吹脱4min，接种9ml厌氧活性污泥，用丁基橡胶塞密封后，分别用注射器向各组中加入c4-hsl、c6-hsl、c12-hsl、c14-hsl和去离子水，使其终浓度为5μg/l。发酵体系构建完成后，放置在36℃的空气浴恒温摇床中培养。每两天检测一次产气量、气体组分和甲醇含量。

以上5组实验分别进行3次平行实验，取三次平行实验的平均值绘制甲醇含量历时曲线(详见图1)和累积产甲烷量历时曲线(详见图2)。

由图1可知，随着时间增加，发酵体系中的甲醇含量逐渐降低，与空白对照组相比，实验组甲醇厌氧降解速率提高了9.4％，对照组1～3甲醇厌氧降解速率分别降低了2.6％、2.3％和9.0％。表明，c6-hsl能够提高厌氧活性污泥的甲醇降解速率，同为微生物qs信号分子的c4-hsl、c12-hsl和c14-hsl则抑制厌氧活性污泥的甲醇降解速率。

由图2可知，随着时间增加，发酵体系中的甲烷含量逐渐增加，与空白对照组相比，实验组甲烷发酵速率提高了9.4％，对照组1～3甲烷发酵速率分别降低了1.4％、1.1％和7.9％。表明，c6-hsl能够提高厌氧活性污泥的产甲烷速率，同为微生物qs信号分子的c4-hsl、c12-hsl、c14-hsl则降低了厌氧活性污泥的产甲烷速率。

实施例2

本实施例将c6-hsl直接添加到甲烷发酵反应器进水中进行单因素对照实验。

选择两个有效容积为4l的升流式厌氧污泥床反应器，其进水均由甲醇稀释至cod为6000mg/l而成，并添加小苏打调节碱度至3000mg/l(以caco3计)，接种污泥为成熟的厌氧颗粒污泥，接种量均为1l。

在反应器r1的进水中加入终浓度为5μg/l的c6-hsl，反应器r2为对照，进水中不添加c6-hsl。两个升流式厌氧污泥床反应器均在水力停留时间为24h，温度为35℃的条件下运行，分别对两反应器出水的cod值进行测定。

结果：r1出水的cod平均值为259.61mg/l，r2出水的cod平均值为826.37mg/l。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。