小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及微生物培养和检验技术领域，尤其涉及一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基及其制备方法。


背景技术：

2.小肠结肠炎耶尔森氏菌，简称耶氏菌，属于肠杆菌科耶尔森氏菌属，菌体小，约1.0～3.5
×
0.5～1.3μm，不形成芽胞，无荚膜，为革兰氏阴性杆菌或球杆菌。它可在温度0℃～30℃，ph 4.0～10.0条件下生长，但在20℃～30℃，ph为7.2～7.4时生长情况达到最佳。根据菌体o抗原因子的不同可将小肠结肠炎耶尔森氏菌分成50个以上血清型，其中分布范围最广的是生物4型中的血清3型，生物血清型2/o:9型，它们主要分布在欧洲、日本、南非和中国。
3.小肠结肠炎耶尔森氏菌是一类人畜共患病病原菌，广泛存在于动物体内，为动物肠道寄生菌，其中猪携带量最高，其次为犬、鸡、牛和羊等。同时，该菌还是一种常见的引起人体肠道感染的食源性致病菌，感染人体后常引起胃肠炎或小肠结肠炎，一定情况下还能引起呼吸道、心脑血管系统、骨骼、结蹄组织和全身疾病，甚至引起急性阑尾炎、败血症。
4.小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的疾病又称为小肠结肠炎耶尔森氏菌病，是80年代才受到重视的一种新的肠道传染病，世界各大洲均有发现，是欧洲某些国家腹泻的主要病种。在过去20年间，欧、美等国家发生的多起食源性中毒事件均与该病有关。我国自1981年发现此病以来，已发生过两次大的爆发流行，造成500多人感染。近年来国内不断有文献报道约10％腹泻病人粪便中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(13/132，18/182)，比八九十年代(0.64％)大为提高。小肠结肠炎耶尔森氏菌病可出现在各个年龄层，以1～4岁的儿童发病率最高，其中腹泻型病例占15.5％。因此，寻找一种准确、有效、特异地检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，对于诊断和治疗小肠结肠炎耶尔森氏菌病显得尤为迫切。
5.目前，常用的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法有传统培养法和分子生物学检测法两类。分子生物学方法如pcr法、环介导温扩增法等，检测时间短、特异性好、灵敏度高，但需要专业人员操作并需配套使用相关试剂及检测设备，检测费用较为昂贵，目前使用范围受到一定限制。传统培养法，即gb 4789.8
‑
2016中的方法，是检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的经典方法，其中小肠结肠炎耶尔森氏菌增菌富集所用的培养基组分简单，配制方便，但整个检测过程需要多个步骤，用到多种培养基，培养时间至少3～7天，不能达到快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的要求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服上述现有技术的缺点，提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基及其制备方法，该培养基用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的选择性增菌培养。
7.本发明提供的小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基的技术方案具体为，包括组合营养剂和组合抑菌剂，所述组合营养剂包括胰酪胨、山梨醇、蔗糖、鸟氨酸、氯化钠，所
述的组合抑菌剂包括牛胆盐、十二烷基磺酸钠、头孢菌素和新生霉素。
8.所述培养基每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨1.0～10.0g，山梨醇3.0～20.0g，蔗糖1.0
‑
10.0g，鸟氨酸0.5
‑
5g，氯化钠1.0～10.0g，牛胆盐1.0～10.0g，十二烷基磺酸钠0.5～5.0g，头孢菌素5.0～25.0mg，新生霉素0.1～10.0mg。
9.所述培养基每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨1.0～10.0g，山梨醇3.0～20.0g，蔗糖1.0
‑
10.0g，鸟氨酸0.5
‑
5g，氯化钠1.0～10.0g，磷酸氢二钠7.0～10.0g，磷酸二氢钠0.5～2.0g，牛胆盐1.0～10.0g，十二烷基磺酸钠0.5～5.0g，头孢菌素5.0～25.0mg，新生霉素0.1～10.0mg，纯化水1000ml。
10.所述的培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
11.较佳地，每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨5.0g，山梨醇9.7g，蔗糖3.0g，鸟氨酸0.5g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠8.0g，磷酸二氢钠0.6g，牛胆盐2g，十二烷基磺酸钠1g，头孢菌素15.0mg，新生霉素2.5mg，纯化水1000ml。
12.本发明还提供了一种所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
13.(1)基础粉剂称量：称取胰酪胨1.0～10.0g，山梨醇3.0～20.0g，蔗糖1.0
‑
10.0g，鸟氨酸0.5
‑
5g，氯化钠1.0～10.0g，磷酸氢二钠7.0～10.0g，磷酸二氢钠0.5～2.0g，牛胆盐1.0～10.0g，十二烷基磺酸钠0.5～5.0g，放置于洁净干燥的容器中；
14.(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，搅拌，加热均匀，调节ph；
15.(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
16.(4)补充添加剂：将头孢菌素5.0～25.0mg，新生霉素0.1～10.0mg加入步骤(3)中的混合溶液中，注意无菌操作；
17.(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
18.本发明的小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基及其制备方法，含有组合抑菌剂：牛胆盐、十二烷基磺酸钠、头孢菌素、新生霉素，能有效抑制革兰氏阳性菌的生长，抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长，同时对小肠结肠炎耶尔森氏菌的生长无影响。本发明的培养基可实现对样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的选择性富集增菌培养，优化传统培养法的检测步骤，缩短检测时间，提高检出率，使样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌更易检测和鉴别。本发明培养基以创新性的技术改进实现突出的技术效果，且成本较低，具有显著的推广价值。
附图说明
19.图1为本发明的小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基的制备方法的流程图。
具体实施方式
20.为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，验证小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基在细菌增菌及检测中的作用，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
21.实施例1
22.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨5.0g，山梨醇9.7g，蔗糖3.0g，鸟氨酸0.5g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠8.0g，磷酸
二氢钠0.6g，牛胆盐2g，十二烷基磺酸钠1g，头孢菌素15.0mg，新生霉素2.5mg，纯化水1000ml，培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
23.如图1所示，上述小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基的制备方法流程示意图，其中，图中的灰色块代表百级洁净环境，具体包括以下步骤：
24.(1)基础粉剂称量：称取胰酪胨5.0g，山梨醇9.7g，蔗糖3.0g，鸟氨酸0.5g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠8.0g，磷酸二氢钠0.6g，牛胆盐2g，十二烷基磺酸钠1g，放置于洁净干燥的容器中；
25.(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，用玻璃棒搅拌容器中的混合物，加热均匀，调节ph；
26.(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
27.(4)补充添加剂：将头孢菌素15.0mg；新生霉素2.5mg加入步骤(3)中的混合溶液中，此过程注意无菌操作，即图1中的灰色块代表百级洁净环境。
28.(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
29.本实施实例中，步骤(2)中所述的培养基的ph值为7.6
±
0.2；步骤(4)中所述的高压灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟。
30.将小肠结肠炎耶尔森氏菌cmcc(b)52204、小肠结肠炎耶尔森氏菌atcc 8739、大肠埃希氏菌atcc 25922、金黄色葡萄球菌atcc 25923、粪肠球菌atcc 29212、肠炎沙门氏菌cmcc(b)50041用0.9％无菌氯化钠溶液稀释菌液至每1ml含菌落数约100cfu～1000cfu，制备成悬液，接种于上述培养基中，小肠结肠炎耶尔森氏菌置于25
±
1℃恒温培养箱中培养48h，其他细菌置于36
±
1℃恒温培养箱中培养48h；
31.菌体生长情况结果见下表1。
32.表1：质控菌株接种至小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，菌体生长情况表。
[0033][0034]
从表1可以看出，目标菌小肠结肠炎耶尔森氏菌在本培养基上生长良好，肉汤混浊，而其他细菌，包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌，革兰氏阴性菌大肠埃希菌及肠炎沙门氏菌在本培养基上生长受抑制，肉汤澄清，具有良好的选择性增菌效果，可以达到富集目标菌、抑制非目标菌生长的作用，对小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测具有良好的选择性增菌作用。
[0035]
实施例2
[0036]
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，每1l培养基中包括以下含量的各
组份：胰酪胨3.0g，山梨醇12.0g，甘露醇1.0g，鸟氨酸5.0g，氯化钠8.0g，磷酸氢二钠8.5g，磷酸二氢钠1.0g，牛胆盐5g，十二烷基磺酸钠0.5g，头孢菌素10.0mg，新生霉素5mg，纯化水1000ml，培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
[0037]
其制备方法包括以下步骤：
[0038]
(1)基础粉剂称量：称取胰酪胨3.0g，山梨醇12.0g，甘露醇1.0g，鸟氨酸5.0g，氯化钠8.0g，磷酸氢二钠8.5g，磷酸二氢钠1.0g，牛胆盐5g，十二烷基磺酸钠0.5g，放置于洁净干燥的容器中；
[0039]
(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，用玻璃棒搅拌容器中的混合物，加热均匀，调节ph；
[0040]
(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
[0041]
(4)补充添加剂：将头孢菌素10.0mg，新生霉素5mg加入步骤(3)中的混合溶液中，此过程注意无菌操作。
[0042]
(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
[0043]
本实施实例中，步骤(2)中所述的培养基的ph值为7.6
±
0.2；步骤(4)中所述的高压灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟。
[0044]
小肠结肠炎耶尔森氏菌cmcc(b)52204、小肠结肠炎耶尔森氏菌atcc 8739、大肠埃希氏菌atcc 25922、金黄色葡萄球菌atcc 25923、粪肠球菌atcc 29212、肠炎沙门氏菌cmcc(b)50041、铜绿假单胞菌atcc27853、阪崎肠杆菌atcc51329、肺炎链球菌cmcc(b)31436用0.9％无菌氯化钠溶液稀释菌液至每1ml含菌落数约100cfu～1000cfu，制备成悬液，分别接种于上述培养基与gb 4789.8
‑
2016检测方法中推荐的培养基中，小肠结肠炎耶尔森氏菌置于25
±
1℃恒温培养箱中培养48h，其他细菌置于36
±
1℃恒温培养箱中培养48h；
[0045]
菌体生长情况结果见下表2。
[0046]
表2：质控菌株在两种培养基上的生长情况表。
[0047][0048][0049]
从表2可以看出，在本培养基及gb 4789.8
‑
2016推荐培养基上，目标菌小肠结肠炎耶尔森氏菌在均可以生长，但其中的小肠结肠炎耶尔森氏菌cmcc(b)52204在gb4789.8
‑
2016推荐培养基上生长不良，肉汤相对澄清，增菌效果不佳，这可能和该培养基营养成分较少目标菌生长不良有关，而由于本培养基添加组合营养剂胰酪胨、山梨醇、蔗糖、鸟氨酸、氯
化钠，小肠结肠炎耶尔森氏菌cmcc(b)52204在本培养基上生长良好，肉汤浑浊，达到良好的增菌富集目标菌效果。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌在本培养基及gb 4789.8
‑
2016推荐培养基上均生长受抑制，表明两种培养基均具有良好的抑制革兰氏阳性菌效果；革兰氏阴性菌大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌在本培养基上生长受抑制，肉汤澄清，具有良好的选择性增菌效果，但是在gb4789.8
‑
2016推荐培养基上亦生长，肉汤浑浊，不能达到富集目标菌、抑制非目标菌生长的作用，影响对小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测，可能导致假阳性结果出现。
[0050]
实施例3
[0051]
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨10.0g，山梨醇3.0g，甘露醇8.0g，鸟氨酸2.0g，氯化钠3.0g，磷酸氢二钠9.5g，磷酸二氢钠1.63g，牛胆盐3.0g，十二烷基磺酸钠5.0g，头孢菌素5.0mg，新生霉素8.0mg，纯化水1000ml，培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
[0052]
其制备方法包括以下步骤：
[0053]
(1)基础粉剂称量：胰酪胨10.0g，山梨醇3.0g，甘露醇8.0g，鸟氨酸2.0g，氯化钠3.0g，磷酸氢二钠9.5g，磷酸二氢钠1.63g，牛胆盐3.0g，十二烷基磺酸钠5.0g，放置于洁净干燥的容器中；
[0054]
(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，用玻璃棒搅拌容器中的混合物，加热均匀，调节ph；
[0055]
(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
[0056]
(4)补充添加剂：将头孢菌素5.0mg，新生霉素8.0mg加入步骤(3)中的混合溶液中，此过程注意无菌操作。
[0057]
(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
[0058]
实施例4
[0059]
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，每1l培养基中包括以下含量的各组份：胰酪胨5.0g，山梨醇10.0g，甘露醇2.0g，鸟氨酸3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠7.0g，磷酸二氢钠0.2g，牛胆盐1.0g，十二烷基磺酸钠4.0g，头孢菌素5.0mg，新生霉素10.0mg，纯化水1000ml，培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
[0060]
其制备方法包括以下步骤：
[0061]
(1)基础粉剂称量：称取胰酪胨5.0g，山梨醇10.0g，甘露醇2.0g，鸟氨酸3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠7.0g，磷酸二氢钠0.2g，牛胆盐1.0，十二烷基磺酸钠4.0g，放置于洁净干燥的容器中；
[0062]
(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，用玻璃棒搅拌容器中的混合物，加热均匀，调节ph；
[0063]
(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
[0064]
(4)补充添加剂：将头孢菌素5.0mg，新生霉素10.0mg加入步骤(3)中的混合溶液中，此过程注意无菌操作。
[0065]
(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
[0066]
实施例5
[0067]
一种小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基，每1l培养基中包括以下含量的各
组份：胰酪胨5.0g，山梨醇15.0g，甘露醇10.0g，鸟氨酸8.0g，氯化钠3.0g，磷酸氢二钠10.0g，磷酸二氢钠2.0g，牛胆盐1.5g，十二烷基磺酸钠0.5g，头孢菌素25.0mg，新生霉素0.1mg，纯化水1000ml，培养基的ph值为：7.6
±
0.2。
[0068]
其制备方法包括以下步骤：
[0069]
(1)基础粉剂称量：称取胰酪胨5.0g，山梨醇15.0g，甘露醇10.0g，鸟氨酸8.0g，氯化钠3.0g，磷酸氢二钠10.0g，磷酸二氢钠2.0g，牛胆盐1.5g，十二烷基磺酸钠0.5g，放置于洁净干燥的容器中；
[0070]
(2)原料混合：向步骤(1)中的容器中加入1000ml纯化水，用玻璃棒搅拌容器中的混合物，加热均匀，调节ph；
[0071]
(3)高压灭菌：将步骤(2)中的混合物进行高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至50℃；
[0072]
(4)补充添加剂：将头孢菌素25.0mg，新生霉素0.1mg加入步骤(3)中的混合溶液中，此过程注意无菌操作。
[0073]
(5)分装试管：于无菌条件下，分装试管。
[0074]
本发明的小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性增菌培养基及其制备方法，含有组合营养剂：胰酪胨、山梨醇、蔗糖、鸟氨酸、氯化钠，能有效促进小肠结肠炎耶尔森氏菌的生长。含有组合抑菌剂：牛胆盐、十二烷基磺酸钠、头孢菌素、新生霉素，能有效抑制革兰氏阳性菌的生长，抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长，同时对小肠结肠炎耶尔森氏菌的生长无影响。本发明的培养基可实现对样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的选择性富集增菌培养，优化传统培养法的检测步骤，缩短检测时间，提高检出率，使样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌更易检测和鉴别。本发明培养基以创新性的技术改进实现突出的技术效果，且成本较低，具有显著的推广价值。
[0075]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书被认为是说明性的而非限制性的。