专利名称：一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于本发明属于生物技术领域，涉及ー种产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株 fmb_103o
背景技术：
染料エ业是国民经济中的重要行业，其生产的染料被广泛应用于纺织、造纸、食品、皮革、化妆品、涂料、油漆、油墨、电子エ业等各个领域。染料品种数以万计，在生产和使用过程中大约有109^20%的染料会直接随废水进入环境中。大多数染料为有毒难降解有机
物，化学稳定性強，含有重金属，有刺激性、致敏性、急性毒性，具有致癌、致畸、致突变作用，直接危害人类健康；此外，废水中的染料能吸收光线，降低水体的透明度，对水生生物、微生物的生长不利，并且降低了水体的自浄能力，同时导致视觉污染，还会严重破坏水体、土壌及生态环境，影响食品质量与安全，间接危害人体健康。三苯甲烷类染料是ー种多苯环化合物，使用面较广，用量也较大，其产量被列为第三大主要染料。其中某些染料及中间降解产物具有“三致”作用，从生产、运输、使用等环节进入环境，这势必造成污染，为生态环境带来冲击。并且这类染料中的一部分难以降解，常常导致常规的生物处理系统处理效果不够理想，因此，对三苯甲烷类染料生物降解性能进行系统的研究，成为处理这类染料废水重要的一方面。行之有效的染料废水处理方法和技术是改善生态环境、保证食品安全和维护人类健康的重要保证。目前，常用的染料废水处理方法有物理方法、化学方法和生物方法。物理化学处理法虽然对废水色度去除率较高，但COD去除率较低，且存在处理费用高、可能引起二次污染等问题。生物法即通过筛选或构建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料废水的脱色，是ー种经济、有效且适于大規模废水处理的技木。生物方法对染料的脱色主要通过降解和生物吸附两方面发挥作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木质素降解酶系统进行脱色，包括漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等；而吸附主要是通过菌体的自身结构与染料等大分子物质相契合所致。因此，对用于染料的生物脱色方法通常以微生物和酶为载体进行研究。目前研究发现的染料脱色酶主要有漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)，它们对底物的降解具有广谱性，对染料的脱色及降解效果明显，具有很好的应用前景。漆酶是ー类含铜的多酚氧化酶，广泛存在于自然界中，主要包括植物漆酶和真菌漆酶，蛋白质数据库和细菌基因组序列分析的结果证明漆酶也广泛存在于细菌中。漆酶作为ー种生物制剂，具有高效、专一、作用条件温和等特点，在纸浆生物漂白、染料的脱色及其废水净化、污染物质脱毒与降解等方面有着巨大的应用潜力。而且，在还原介质的存在下，可进ー步的扩大漆酶的底物范围。采用漆酶直接对染料进行脱色降解，以及利用漆酶介体系统，漆酶染料中间体和固定化漆酶对染料降解的研究已引起了国内的脱色降解效果。然而，大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌，其中最主要的是担子菌门中的白腐真菌。但是真菌较细菌生长缓慢、发酵周期长、生长温度和PH范围狭窄等特性，必然导致真菌在产酶数量、酶学性质等多方面体现出劣势。细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2+抗性、不需糖基化、热稳定性好及酶活性的最适pH值范围广等。同时，细菌生长的代时短，所需营养成分简单易得，便于大規模培养；大多数细菌生长在碱性环境中，筛选出最适PH在碱性范围内的细菌漆酶，可以直接用于处理工业废水；细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。而目前关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高效脱色能力细菌漆酶还有待于进ー步发掘和研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌。 本发明的另ー目的是提供该死亡谷芽孢杆菌应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCCNo. 6198。所述的保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103在降解三苯甲烷类染料中的应用。优选利用保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷类染料中的应用。其中，所述的三苯甲烷类染料优选孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意ー种或多种。所述的芽孢漆酶优选主要通过如下步骤制备a.将保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于IOOmL BPY种子液培养基，37°C，180rpm，培养12 16小时得种子液；b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37°C，180rpm，发酵48小吋，所述的发酵培养基配方为玉米粉4. 65g/L，黄豆粉5. 88g/L，MgS042 . 53g/L，MnSO4O. lg/L，K2HPO4O. 3g/L, FeSO4O. 5g/L, pH 7. 0 ；c 取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；d.抽滤液10000 12000rpm离心25 30min,弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，1000(Tl2000rpm离心l(Tl5min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。ー种利用保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103降解三苯甲烷类染料的方法，在0. 2mol/LpH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入终浓度为0. lmol/L的介体2，2’-连氮-ニ(3-こ基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或こ酰丁香酮，5. 38U/mL fmb_L820和50mg/L的三苯甲烷类染料，于37°C下静置反应48h ;其中所述的fmb_L820为保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶。所述的保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备a.将保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于IOOmL BPY种子液培养基，37°C，180rpm，培养12 16小时得种子液；b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37°C，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为；c.取出发酵液，滤纸抽滤，弃去菌体；d.抽滤液10000 12000rpm离心25 30min,弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，1000(Tl2000rpm离心l(Tl5min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。所述的三苯甲烷类染料优选自孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝中的任意ー种或多种。有益效果本发明提供了一种产细菌芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株fmb-103(CGMCC No. 6198)，此类菌株是首次被发现具有产生芽孢漆酶的能力。利用该 菌株产生的芽孢漆酶，在介体的作用下，能够高效的催化三苯甲烷类染料(孔雀石绿、亮绿和苯胺蓝)的降解。利用fmb-103，通过简单的发酵和分离手段获得大量芽孢漆酶，应用于染料降解，对于缓解染料エ业带来的环境问题具有重要的现实意义。
图I菌株fmb-103的菌落生长形态图2菌株fmb-103革兰氏染色图3基于16S rRNA基因序列的fmb-103菌株的系统发育树
图4芽孢漆酶对染料的脱色效应其中，CK.染料；A.漆酶+染料；B. ABTS+染料；C. 丁香醛+染料；D.こ酰丁香酮+染料；E.漆酶+ABTS+染料；F.漆酶+ 丁香醛+染料；G.漆酶+こ酰丁香酮+染料。图5芽孢漆酶对染料的脱色效率其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS ；c.漆酶+ 丁香醛；d.漆酶+こ酰丁香酮图6pH对芽孢漆酶染料脱色影响(A)pH对芽孢漆酶对孔雀石绿脱色影响；(B)pH对芽孢漆酶对亮绿脱色影响；(C)pH对芽孢漆酶对苯胺蓝脱色影响；其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS ；c.漆酶+ 丁香醛；d.漆酶+こ酰丁香酮图7孔雀石绿降解的全波长扫描生物材料保藏信息本发明提供的该菌株为死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，縮写CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 6198，保藏日期为2012年06月08日。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进ー步的阐述。实施例I产芽孢漆酶死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103的获得将来源于印染エ厂污染的土壤样品IOg在无菌条件下，加入到250mL带有玻璃珠并已灭菌的富集培养基内(富集培养基组分1% (W/V)胰蛋白胨；0. 5% (W/V)酵母粉；1%(W/V) NaCl ;终浓度 0.2mmol/L CuSO4X 37°C，200rpm 震荡 24_48h，进行富集培养基。培养结束后，10000rpm、4°C条件下离心lOmin，获得上清液进行梯度稀释，得到10'10_2、10'10_4、10_5、10_6、10' 10_8、10_9的稀释倍数。每ー梯度100 u L菌液滴加于营养琼脂平板(营养琼脂平板组分10. Og/L蛋白胨；3. Og/L牛肉粉；5. Og/L氯化钠；15. Og/L琼脂；IOOOrnl蒸馏水；pH值7. 3±0. I)后涂布，37°C培养2-4天。取含有单菌落平板，在菌落及其周围滴加lmm/L的ABTS，若在滴定区域显现绿色表示有漆酶存在。挑取使ABTS溶液发生颜色变化的单菌落，进行多次重复验证，获得具有漆酶活性的菌株，命名为fmb-103，送交CGMCC保藏，保藏号为 CGMCCNo. 6198。实施例2产芽孢漆酶死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103菌株的
鉴定(I)菌株形态学鉴定死亡谷芽孢杆菌fmb-103 (CGMCC No. 6198)菌株接种于营养琼脂培养基上，30°C培养24h，特征观察结果如表1，菌落形态见图1，革兰氏染色结果见图2。表I菌株fmb-103的培养特征观察结果
权利要求
1.一株产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No. 6198。
2.权利要求I所述的保藏号为CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103在降解三苯甲烷类染料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用保藏号为CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷类染料中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的三苯甲烷类染料选自孔雀石緑、亮绿、苯胺蓝中的任意ー种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备 a.将保藏号为CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于IOOmL BPY种子液培养基，37°C，180rpm，培养12 16小时得种子液； b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，370C，180rpm,发酵48小时，所述的发酵培养基配方为玉米粉 4. 65g/L，黄豆粉 5. 88g/L，MgSO4 2. 53g/L，MnSO4 0. lg/L，K2HPO40. 3g/L, FeSO4 0. 5g/L, pH 7. 0 ； c.取出发酵液,滤纸抽滤,弃去菌体； d.抽滤液10000 12000rpm离心25 30min,弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000 12000rpm离心10 15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。
6.ー种利用权利要求I所述的保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103降解三苯甲烷类染料的方法，其特征在于在0. 2mol/LpH6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入终浓度为0. lmol/L的介体，5. 38U/mL fmb_L820和50mg/L的三苯甲烷类染料，于37°C下静置反应48h，所述的介体选自2，2’ -连氮-ニ(3-こ基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或こ酰丁香酮中的任意ー种；其中所述的fmb-L820为保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的保藏号为CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103产生的芽孢漆酶主要通过如下步骤制备 a.将保藏号为CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103接种于IOOmL BPY种子液培养基，37°C，180rpm，培养12 16小时得种子液； b.按3%的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37°C，180rpm，发酵48小时，所述的发酵培养基配方为玉米粉 4. 65g/L，黄豆粉 5. 88g/L，MgSO4 2. 53g/L，MnSO4 0. lg/L, K2HPO40. 3g/L, FeSO4 0. 5g/L, pH 7. 0 ； c.取出发酵液,滤纸抽滤,弃去菌体； d.抽滤液10000 12000rpm离心25 30min,弃去上清，沉淀物用去离子水重悬，10000 12000rpm离心10 15min，重复两次，所得沉淀物即为所述的芽孢漆酶。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的三苯甲烷类染料选自孔雀石緑、亮绿、苯胺蓝中的任意ー种或多种。
全文摘要
本发明属于本发明属于生物技术领域，涉及一种产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株fmb-103。产芽孢漆酶的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No.6198。所述的保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103能够产芽孢漆酶可在降解三苯甲烷类染料中的应用。
文档编号C02F3/34GK102757909SQ201210204548
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者刁含文, 别小妹, 吕凤霞, 张充, 王昱沣, 赵海珍, 陆兆新 申请人:南京农业大学