一种用于鉴定大豆GmSWEET39基因单倍型的分子标记及应用的制作方法

一种用于鉴定大豆gmsweet39基因单倍型的分子标记及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定大豆gmsweet39基因单倍型的分子标 记及应用。


背景技术：

2.从野生大豆到栽培大豆，大豆籽粒的蛋白质含量减小，油脂含量增大和百粒重增大，研 究表明位于大豆15号染色体上的gmsweet39基因(glyma.15g049200)控制了大豆籽粒蛋 白质含量、油脂含量和百粒重，前人研究表明该基因等位变异丰富，主要分为3种单倍型。 但前人的研究都是基于测序的结果，鉴定出的基因内indel差异在10bp以内，无法有效设计 基于琼脂糖电泳检测的基因内分子标记，本研究通过对南农菜豆5号和南农菜豆5号高蛋白 回交系(导入野生大豆zyd4219部分片段)进行分析，鉴定出glyma.15g049200中的大片段 缺失类型，对该大片段缺失设计基因内分子标记用于育种应用。


技术实现要素：

3.本发明的目的提供一种用于鉴定大豆蛋白质含量、油脂含量和百粒重gmsweet39基因 的单倍型的基因内标记及应用，以在分子标记辅助选择育种中提高选育效率，即本发明的目 的在于提供一种用于鉴定大豆蛋白质含量、油脂含量和百粒重gmsweet39基因的单倍型的 基因标记。
4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5.本发明提供一种大豆gmsweet39基因的分子标记方法，用分子标记indel-chr.15-3875550 引物：seq id no.1/seq id no.2或者用分子标记indel-chr.15-3884603引物：seq idno.3/swq id no.4扩增大豆或育种材料dna，如果用分子标记indel-chr.15-3875550引物能 够扩增出537p的扩增片段，或用分子标记indel-chr.15-3884603引物能够扩增出523bp的扩 增片段，则标志着大豆品种中含有gmsweet39基因野生单倍型，及具有提高籽粒蛋白质含 量、降低油脂含量和百粒重的等位变异的存在。
6.本发明还提供一种鉴定大豆gmsweet39基因单倍型的分子标记indel-chr.15-3875550引 物：
7.正向引物(5
’‑3’
)gcaccatctgaactagcccc(如seq id no.1所示)，其在公共物 理图谱wm82.a2上的位置为chr15：3875209；
8.反向引物(5
’‑3’
)cctatacgctattcgcggcc(如seq id no.2所示)，其在公共物 理图谱wm82.a2上的位置为chr15：3875819。
9.本发明还提供一种鉴定大豆sweet39基因单倍型的分子标记indel-chr.15-3884603引物：
10.正向引物(5
’‑3’
)tctcctgacaagtgacttgaca(如seq id no.3所示)，其在公 共物理图谱wm82.a2上的位置为chr15：3884274；
11.反向引物(5
’‑3’
)aaaggagagtggatatttgcct(如seq id no.4所示)，其在公 共物
理图谱wm82.a2上的位置为chr15：3884823。
12.本发明还提供所述鉴定大豆gmsweet39基因单倍型的分子标记，所述分子标记 indel-chr.15-3875550或indel-chr.15-3884603在鉴定gmsweet39基因单倍型在大豆品种或品 系中的应用。
13.本发明所述的鉴定gmsweet39基因单倍型在大豆品种或品系中的应用，具体为用分子 标记indel-chr.15-3875550引物：seq id no.1/seq id no.2或者用分子标记 indel-chr.15-3884603引物：seq id no.3/seq id no.4扩增大豆材料dna，分子标记 indel-chr.15-3875550引物能够扩增出537p的扩增片段，或用分子标记indel-chr.15-3884603 引物能够扩增出523bp的扩增片段，则标志着大豆品种中含有gmsweet39基因野生单倍型， 及具有提高籽粒蛋白质含量、降低油脂含量和百粒重的等位变异的存在。
14.本发明所提供的鉴定大豆gmsweet39基因单倍型的分子标记及其应用可以适用于所有 大豆种质hpcd5的后代品系。
15.本发明具有如下有益效果：
16.(1)本发明的大豆高蛋白、低油脂和小粒等位变异来自野生大豆，具有提高栽培大豆籽 粒蛋白质含量的效应；
17.(2)本发明的的大豆籽粒蛋白质含量、油脂含量和百粒重gmsweet39基因的单倍型的 基因标记间差异明显，检测要求小，只要分子标记扩增产物采用本发明，经过多轮的基因型 和表型选择后能显著选育高蛋白大豆新种质；
18.(3)采用本发明，选育的高蛋白大豆新种质，籽粒蛋白质含量比轮回亲本蛋白质含量提 高5％以上；
19.(4)采用本发明，选育的高蛋白大豆新种质，籽粒蛋白质含量能达到50％以上。
附图说明
20.图1.indel-chr.15-3875550、indel-chr.15-3884603等4个indel在gmsweet39上的位置 及差异序列。
21.图2.indel-chr.15-3875550和indel-chr.15-3884603分子标记引物扩增产物。图中m为 dnamarker i，从左到右材料分别为中黄39、南农99-6、徐豆14、南农菜豆5号(cd5) 和高蛋白南农菜豆5号回交系(hpcd5)
具体实施方式
22.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
23.以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材 料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。
24.实施例1
25.(一)hpcd5/cd5f2群体构建及表型测定
26.大豆种质hpcd5是将野生大豆zyd4219中高蛋白片段导入南农菜豆5号(cd5)创制的高 蛋白大豆新种质，配置hpcd5和cd5的杂交组合，选取218个f2单株种植后获得f
2：3
家系， 利用f
2：3
家系测定大豆籽粒蛋白质含量、油脂含量和百粒重。
27.(二)基因型鉴定
28.hpcd5和cd5利用重测序进行基因型检测，hpcd5/cd5f2群体每个家系利用简化基因组测 序进行测序，共测定出178份家系基因型，每个家系平均获得0.5gb的数据，通过该方法总 共获得1586个有效snp标记。
29.indel标记分析的方法如下所述：
30.pcr反应体系(20ul)：5
×
fastpfu buffer 4ul，dntps(2.5mm)2ul，上游引物(5um) 0.8ul，下游引物(5um)0.8ul，fastpfu polymerase 0.4ul，模板dna10ng，ddh2o 12ul， 共20ul。
31.pcr反应程序：95℃变性5分钟；95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，共循环30次； pcr反应在abi9700型pcr仪中进行。
32.pcr产物检测：扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析，用dna marker i作对比分子产物分 子量大小。
33.(三)结果与分析
34.联合家系群体基因型和表型，在15号染色体2.4mb-5.7mb鉴定到一个同时控制大豆籽粒 蛋白质含量、油脂含量和百粒重位点，表型解释率分别为20.0％、16.7％和16.7％。区间内含 有gmsweet39(glyma.15g049200)基因。前人报道gmsweet39野生单倍型具有提高大豆籽粒 蛋白质含量，降低油脂含量和百粒重的效应，与本研究中hpcd5含有的效应一致。分析cd5 和hpcd5在glyma.15g049200基因上的序列差异，鉴定出indel差异20个，snp差异52个， 图1显示了4个indel差异序列，其中在chr15_3875101和chr15_3876981是已经报道的， 认为是关键差异位点，hpcd5与野生大豆基因型一致，chr15_3875550和chr15_3884603位点 前人未见报道，且其差异序列都在25bp以上，对这两个位点设计基于琼脂糖电泳检测的分子 标记indel-chr.15-3875550和indel-chr.15-3884603，并在育成品种中进行检测利用(图2)。
35.分子标记indel-chr.15-3875550引物：
36.前引物序列gcaccatctgaactagcccc(如seq id no.1所示)
37.后引物序列cctatacgctattcgcggcc(如seq id no.2所示)
38.扩增差异序列
39.atatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatgcatgagaatttg ggatcga(如seq id no.5所示)。
40.分子标记indel-chr.15-3884603引物：
41.前引物序列tctcctgacaagtgacttgaca(如seq id no.3所示)
42.后引物序列aaaggagagtggatatttgcct(如seq id no.4所示)
43.扩增差异序列tatttataacctaataactgtgacatg(如seq id no.6所示)
44.通过本发明鉴定的大豆gmsweet39基因内indel标记，可用来指导高蛋白大豆新品种的 选育工作，可使不同大豆籽粒蛋白基因位点快速聚合在同一植株中，也可以聚合其它大豆油 脂含量和百粒重位点，选育籽粒蛋白含量较高，油脂含量和百粒重不低的大豆新品种。