本发明属于医学检测领域，具体涉及用于检测b族链球菌的特异性引物、探针和应用。
背景技术：
b族链球菌（简称gbs）是一种条件致病菌，正常寄居于阴道和直肠，一般正常健康人群感染gbs并不致病。但b族链球菌可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。同时，b族链球菌还可引起孕妇感染、引起早产、胎儿发育不良（低体重儿）、胎膜早破及晚期流产。据统计约10%～30%的孕妇有感染gbs，其中40%～70%在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带了这种菌，大约有1%～3%会出现早期侵入性感染，其中有5%会导致死亡。
b族链球菌感染的临床检测主要有培养法、免疫法和病原体核酸检测等方法。其中，培养法由于培养时间较长，灵敏度较低，而免疫法则由于需要培养后进行且检测时间长等原因限制了其在临床上的应用。因此，研制出灵敏、方便和快速的核酸检测试剂，有利于孕妇产前b族链球感染的辅助诊断和对症治疗。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供检测b族链球菌的特异性引物、探针。
本发明的再一目的在于提供上述特异性引物和探针的应用。
本发明的再一目的在于提供检测检测b族链球菌的方法。
根据本发明具体实施方式的用于检测b族链球菌的特异性引物、探针，所述引物的核苷酸序列为：
gbs-f：seqidno.1：5'-tttcaccagctgtattagaagta-3'，
gbs-r：seqidno.2：5'-gttccctgaacattatctttga-3'；
所述探针的核苷酸序列为：
gbs-p：seqidno.3：5'-caagtgacaactccacaagt-3'。
根据本发明具体实施方式的用于检测b族链球菌的特异性引物、探针，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，其中，荧光基团可选fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas等，本发明的优选方案为fam；淬灭基团可选tamra、bhq（bhq1、bhq2、bhq3）、mgb等，本发明的优选方案为mgb。
本发明的用于检测b族链球菌的特异性引物、探针的应用，尤其是在制备b族链球菌的试剂盒、试剂方面，以及在检测b族链球菌的方法中的应用，尤其是应用于孕妇35-37周时gbs的临床筛查。
本发明的用于检测b族链球菌的特异性引物、探针可用于检测临床样本dna为生殖道分泌物、直肠拭子、或两种混合样本、或含有gbs的其他临床样品。
本发明提供了一种检测gbs试剂，包括样本处理液、gbs特异性引物和探针、内参基因异性引物和探针、10×pcr反应缓冲液、mgcl2、rtaq酶、dntp/dutpmix、gbs阳性对照、gbs阴性对照。
样本处理液组成成份
gbs阳性对照：gbs靶基因和内参靶基因片段混合液，浓度均为104拷贝/ul，溶液为样本处理液。
gbs阴性对照：样本处理液。
根据本发明具体实施方式的检测b族链球菌的试剂盒，所述试剂盒中包含上述的特异性引物、探针。
根据本发明具体实施方式的检测b族链球菌的试剂盒，所述试剂盒中包括如下组分：
其中，humanic-f：seqidno.4：5'-atggacacgctcccctgac-3'；
humanic-r：seqidno.5：5'-tgagtccttccacgataccaaa-3'；
humanic-p：seqidno.6：
5'-cy5-gcaatgcctcctgcaccaccaa-bhq1-3'。
根据本发明具体实施方式的检测b族链球菌的方法，所述方法包括利用上述的特异性引物、探针对待测样品dna进行实时荧光定量pcr检测的步骤。
根据本发明具体实施方式的检测检测b族链球菌的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）提取待测样品中的dna；
（2）用特异性引物、探针对步骤（1）提取的dna进行pcr扩增；
（3）判断样本中受否存在b族链球菌：
当cy5荧光ct≤40.0或无ct值，fam荧光扩增曲线呈现典型的“s”型且ct≤37.0，判断b族链球菌阳性；
如fam荧光37.0＜ct值＜40.0之间，则重做样本，若重新检测fam荧光ct值＜40.0则判断为b族链球菌阳性，否则判断为b族链球菌阴性；
cy5荧光ct<40.0，fam荧光gbs基因ct=40.0或无ct值，判断b族链球菌阴性；
cy5荧光ct=40.0或无ct值，且fam荧光ct=40.0或无ct值，判断反应无效，应重新检测或取样。
根据本发明具体实施方式的检测检测b族链球菌的方法，所述所述pcr扩增程序为50℃2min；95℃.3min；95℃10sec、64℃30sec，40个循环。
本发明可使用的荧光定量pcr仪包括罗氏lightcycler480、abi7500、上海宏石slan-96p、西安天隆tl988、96e、48e、伯乐cfx96等。
本发明的有益效果：
本发明设计筛选得到检测b族链球菌引物和探针，检测时间短、灵敏度更高。通过对不同拷贝的gbs参考品进行检测，本发明的引物和探针对能检测出的最低拷贝数为10copies/μl，具有良好的灵敏性；以浓度104copies/μl质粒为模板进行精密性检测，重复10次反应，连续三批试剂批内、批间变异系数均小于5％；本发明的反应体系具有很强的抗干扰性，能抵抗常见干扰物质的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
材料：gbs企业参考品(公司自制)，gbs特异性引物探针、内参引物探针(通用生物系统（安徽)有限公司）。
试剂：rtaq酶全称为taqdna聚合酶：宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为r500a。10×pcrbuffer全称为10×pcrbuffer(mg2+free)：宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为9151am，25mmmgcl2水溶液为10×pcrbuffer配套产品。dntp/dutpmix：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为b602236。udg酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a640016-0200。小牛血清（bsa）：北京元亨圣马生物科技有限公司，批号20180928。
实施例1设计筛选引物
本发明以b族链球菌scpb基因参照序列（genbank:u56908.1），选择表面蛋白c5a肽酶（scpb）靶基因序列（158bp）：
seqidno.7：
aagaaccttaccgcctagaaggtgcgatgcctgaggctcaattgcttttgatgcgtgtcgaaattgtaaatggactagcagactatgctcgtaactacgctcaagctatcagagatgctatcaacttgggagctaaggtgattaatatgagctttggtaatgctgcactagcttacgccaaccttccagacgaaaccaaaaaagcctttgactatgccaaatcaaaaggtgttagcattgtgacctcagctggtaatgatagtagctttgggggcaag。
根据靶序列，本发明自行设计得到三组引物：
为了考察上述3组引物探针的扩增效果，将一定浓度的b族链球菌培养液加入口腔咽拭子样本中模拟临床样本进行核酸提取，具体方法如下；混匀样本后吸取1ml液体至1.5ml灭菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀，向沉淀中加入50µl样本处理液，振荡混匀。100℃干浴或沸水浴10min，12000rpm离心10min备用。
使用上述3组引物探针在各自最适反应条件下进行检测，结果如表1所示：
表1三组引物探针的ct值比较结果
结果如表1所述，三组引物探针组中，引物探针组1的ct值最小，说明其扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数少，从而表明该引物对的扩增效率高于其他引物。
将引物探针组1的引物探针与现有公开的引物探针比较，其中，对比引物探针2（一种b族链球菌荧光pcr检测试剂盒，cn201310275655.5）、对比引物探针3（用于检测b族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法，cn201910636659.9）。
对比引物探针2：gbs-fp：5'-tcgacaatggcagcttcgct-3'；
gbs-rp：5'-ttaatttttgctaagacatt-3'；
gbs-p：5'-tcatcatatactgtgaaata-3'；
对比引物探针3：gbs-f：5'-ctctcaatacaatttcggaagg-3'；
gbs-r：5'-gcttgcycttgtgctaatac-3'；
gbs-p：5'-atgacaccagaagcagcaacaacgatt-3'。
利用b族链球菌模拟临床样本，使用生理盐水10倍依次稀释，各浓度稀释物取1ml按上述方法进行核酸提取，采用上述引物探针进行检测，结果如表2所示：
由专利信息可知，上述3组引物探针检测的靶序列各不相同，甚至为b族链球菌的不同靶基因。本申请以相同浓度的真实菌液为样本，分别按照各自专利适用的方法处理样本并检测，从靶基因差异、样本处理、反应体系、反应条件等多角度出发，整体评价3组引物探针的检测效果。结果显示本发明引物探针ct值小于对比引物探针，具体而言，本发明引物探针检测灵敏度优于对比引物探针。同时，上述结果表明，同一病原体，针对不同的靶基因或靶序列设计引物探针，检测体系的灵敏度会有差异。
实施例2考察引物探针的特异性
1、模板dna准备：用te缓冲液调整浓度，得到dna浓度为10copies/μl的dna溶液。
2、体系配制
3、荧光pcr扩增
3.1反应体系（30μl）：pcr扩增反应液20μl+模板dna溶液10μl。
3.2反应程序：50℃2min；95℃.3min；95℃10sec、64℃30sec，40个循环（64℃时采集荧光信号）。
4、结果判断
4.1gbs阳性：cy5荧光ct≤40.0或无ct值，fam荧光扩增曲线呈现典型的“s”型且ct≤37.0；
4.2gbs阴性（低于检测限）：cy5荧光ct<40.0，fam荧光gbs基因ct=40.0或无ct值；
4.3样本检测灰区：如fam荧光37.0＜ct值＜40.0之间，建议此样本重做，若重新检测fam荧光ct值＜40.0则判断为gbs阳性，否则判断为gbs阴性；
4.4反应无效，应重新检测或取样：cy5荧光ct=40.0或无ct值，且fam荧光ct=40.0或无ct值。
采用上述临床样本处理方法提取下列特异性微生物核酸，使用本发明的引物探针（gbs-f/gbs-r/gbs-p）进行特异性检测实验，对照样本为hpv阳性临床样本、采购的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、第二代人脲原体国家参考品（批号370046-201901）和第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品（批号370060-201901），结果见表3：
表3特异性检查结果
结果如表3所示，本发明的引物探针以b族链球菌的dna为模板进行pcr扩增，产生检测值，而以其他微生物的dna为模板进行，不产生检测值，说明本发明引物探针的特异性良好。
实施例3灵敏度实验
3.1检测灵敏度的确定
按照上述反应体系组份及浓度参数，配制三批反应体系，批号分别为190110、190111和190112，规格均为32人份/盒。
1.试剂盒灵敏度的确定
将gbs质粒稀释成100copies/µl和10copies/µl两个浓度，作为灵敏度确定的模板，按照实施例2的反应程序，进行扩增检测，各重复10个反应，选择能稳定检出的质粒浓度作为本试剂的最低检出浓度。反应结果如下：
表4检测灵敏度实验
结果如表4所示，在10次重复实验中，gbs质粒浓度为10copies/µl时全部能检出，表明10copies/µl浓度为稳定检出浓度，本发明引物探针的灵敏度为10copies/µl。
3.2检测灵敏度的确认
以gbs灵敏度质粒（10copies/µl）为模板，使用本试剂盒按照说明书内容进行反应，重复10个反应，确认本试剂盒的灵敏度。结果如下：
表5试剂盒灵敏度确认结果
实施例4精密性实验
使用190110、190111和190112三批试剂，以浓度104copies/μl质粒为模板，重复检测10次，对试剂批内精密性和批间精密性进行评估。
4.1批内精密性
4.2批间精密性
根据上述三批实验的ct值均值，计算连续三批的批间不精密性，结果见下表：
表9190110/190111/190112批间不精密性
通过上述三批试剂精密性实验，结果表明本试剂均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5%，连续三批试剂批间变异系数小于5%。
实施例5抗干扰性
本发明主要用于检测生殖道分泌物样本中b族链球菌dna，临床使用的样本为生殖道分泌物，而样本中潜在的一些物质可能会对检测结果产生影响，需要对其进行评估，有关干扰物质主要包括：血红蛋白、粘液及常用药物（青霉素、红霉素）等。
使用gbs培养物细胞模拟临床阳性样本，在培养液中加入干扰物质，设置不加干扰物质的gbs培养物作为对照同时检测分析，所用试剂为190111批次，使用煮沸法提取样本核酸dna，评价干扰物质对产品检测效果的影响，具体结果如下表：
表10干扰物质对产品检测效果的影响结果
通过上述样本模拟实验，样本中含有的干扰物质血红蛋白或粘液，及常用药物（青霉素、红霉素）在样本的处理过程中即可被去除，结果表明试剂检测具有很好的重复性和稳定性，即临床样本中带有的干扰物质血红蛋白或粘液，及常用药物（青霉素、红霉素）对本发明试剂检测效果无干扰影响。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110>北京康美天鸿生物科技有限公司
深圳康美生物科技股份有限公司
<120>用于检测b族链球菌的特异性引物、探针和应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttcaccagctgtattagaagta23
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gttccctgaacattatctttga22
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
caagtgacaactccacaagt20
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
atggacacgctcccctgac19
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tgagtccttccacgataccaaa22
<210>6
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gcaatgcctcctgcaccaccaa22
<210>7
<211>278
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
aagaaccttaccgcctagaaggtgcgatgcctgaggctcaattgcttttgatgcgtgtcg60
aaattgtaaatggactagcagactatgctcgtaactacgctcaagctatcagagatgcta120
tcaacttgggagctaaggtgattaatatgagctttggtaatgctgcactagcttacgcca180
accttccagacgaaaccaaaaaagcctttgactatgccaaatcaaaaggtgttagcattg240
tgacctcagctggtaatgatagtagctttgggggcaag278