用于改善疫苗接种的组合物和方法与流程

本发明涉及信使核糖核酸(mrna)递送技术，以及在多种治疗、诊断和预防用药指征中使用这些mrna递送技术的方法。

背景技术：

1、经常需要诱导特定基因产物如多肽在特定靶组织或器官中表达的能力。在许多情况下，靶组织或器官包括一种以上的细胞类型，并且在这种情况下，还经常需要在不同细胞类型中以不同程度表达基因产物，即，在靶组织中的不同细胞类型之间提供基因产物的差异表达。例如，在基因治疗中，可以用完整的拷贝在靶细胞中替换突变的和/或无功能的基因，但是最小化相邻细胞、组织和器官中的脱靶蛋白产生也是有用的。同样，疫苗抗原例如covid-19的刺突蛋白的基因产物优选地在免疫系统的树突细胞中或其周围表达，以确保最大应答。

2、基因治疗通常依赖于病毒载体将编码多核苷酸引入靶细胞，但存在其它可以将多核苷酸递送到细胞而不使用病毒的技术。病毒的优点包括相对高的可能转染率，以及通过控制病毒进入靶细胞的结合蛋白将病毒靶向特定细胞类型的能力。相比之下，将编码多核苷酸引入细胞的非病毒方法具有转染率低的问题，以及在特定器官和细胞类型中靶向表达的选择有限。然而，病毒干预的性质带有毒性和炎症的风险，而且在控制引入因子的表达的持续时间和程度上具有限制。

3、基于生物学方法的肿瘤治疗具有优于传统化疗的优点，因为它们可以采用多种不同的机制来更精确地靶向和破坏癌症，例如通过定向细胞裂解、细胞毒性免疫效应机制和血管塌陷等。因此，临床研究数量显著增加了这些方法的潜力。然而，由于治疗的范围不同，临床前和临床研究是复杂的，因为多个参数可能影响其治疗潜力，因此可能难以确定治疗失败的原因或可能难以确定增强疗效的方法。维持靶向活动、肿瘤特异性和减少副作用也是此类实验性和有效治疗的主要挑战。

4、基于病毒的治疗已成为一种有前景的方法来解决疾病治疗的多个方面。基于灭活或减毒病毒的癌症疫苗对难以治疗的癌症具有相当大的潜力。然而，治疗性病毒的有效性通常受到人体自身免疫应答的阻挠，因此限制了其全身施用。因此，提供新的组合物和方法，将有利于改善和增强目前可用的治疗性病毒方法的范围。

5、疫苗通常是预防传染病的有效干预措施。然而，在某些应用和情况下，疫苗效力可能是次优的。例如，针对所递送的抗原的有效应答的产生取决于受试者免疫系统的能力。在所有受试者中，免疫可能随着时间的推移而丧失，和/或针对特定抗原的免疫应答可能并不充分。

6、类似地，由于抗免疫适应、快速突变或自然史，某些类型或类别的病原体可能难以对其进行疫苗接种。例如，细胞内寄生物，如病毒、细胞内细菌或单细胞真核生物(例如,疟疾寄生虫)，往往难以提供对应的疫苗。

7、通常，活的减毒疫苗可以提供更好的应答，但伴有风险，主要是减毒病原体重新激活的风险。现有疫苗技术的其他不足包括“疫苗逃逸”的可能性，其中病原体变体进化，但未被疫苗触发的免疫应答有效对抗(例如，如果靶向的抗原的编码基因中出现突变)；随着时间的推移，免疫丧失；以及不完全抗性。

8、由于所有这些原因，通常将疫苗和佐剂一起提供以增强免疫应答，但这些有自身的风险，如症状诱导和自身免疫攻击风险。因此，需要提供更有效的和更安全的疫苗和/或佐剂，特别是对于难以提供接种疫苗的病原体。

9、wo-2017/132552-a1描述了具有包括微rna结合位点的工程化基因组的重组溶瘤病毒。

10、us-2013/156849-a1涉及在哺乳动物细胞或组织中表达目标多肽的方法，所述方法包括用包含编码目标多肽的修饰的mrna的制剂接触所述哺乳动物细胞或组织。wo-2016/011306-a2描述了包括至少一种包括微rna结合位点的末端修饰的核酸的设计、制备、制造和/或配方。上述现有技术没有解决确保对接受联合施用治疗剂或因子治疗的受试者体内单个或多个器官类型的有效保护的问题。

11、wo 2019/051100 a1和wo 2019/158955 a1描述了用于将表达一个或多个多肽的mrna序列递送至一个或多个靶器官内的组合物和方法，包括mirna结合位点序列，所述mirna结合位点序列允许编码序列在靶器官或器官内至少第一和第二细胞类型间差异表达。

12、需要进一步开发用于调节多核苷酸序列(如mrna)在特定器官和/或组织中表达的进一步改进和优化的方法和组合物。

技术实现思路

1、在多个实施方案中，本发明提供了适用于递送核苷酸编码产物(如mrna构建体)的组合物和方法，例如用作疫苗和/或佐剂组合物。在一些实施方案中，通过包含mirna结合位点序列，特别是通过提供器官保护序列，一种或多种递送的组合物适合于控制表达。在本文所描述的所有方面中，我们设想“mrna构建体”包括可以被翻译成产生蛋白产物的环状或环状rna构建体。

2、在第一个方面，提供了组合物，包括：包含第一开放阅读框(orf)的第一mrna构建体，其中所述第一orf编码抗原。所述第一orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)相连，其中所述utr包括至少第一器官保护序列(ops)，并且其中所述第一ops包括至少两个微rna(mirna)靶序列，其中至少两个mirna靶序列中的每一个都被优化以与相应的mirna序列杂交。

3、所述第一mrna构建体可以包含在体内递送组合物中或吸附到体内递送组合物上。所述抗原可选自：病原微生物蛋白和肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。所述病原微生物蛋白可选自：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和朊病毒。

4、所述抗原可以包括病毒蛋白或含有其片段的表位。所述抗原可以包括冠状病毒刺突蛋白、冠状病毒刺突蛋白变体、合适的sars-cov-2刺突蛋白。所述抗原可包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位；适用地，其中所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。所述流感蛋白可选自甲型流感、乙型流感或甲型流感的h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16亚型。所述抗原可包括呼吸合胞病毒(rsv)蛋白、其变体或含有其片段的表位；适用地，其中所述呼吸合胞病毒蛋白为f糖蛋白或g糖蛋白。所述抗原可包括人类免疫缺陷病毒(hiv)蛋白或含有其片段的表位；适用地，所述hiv蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。

5、所述抗原可包括来自结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)的蛋白质或含有其片段的表位；适用地，所述来自结核分枝杆菌的蛋白质选自esat-6、ag85b、tb10.4、rv2626和/或rpfd-b。

6、所述抗原可以是肿瘤相关抗原。所述肿瘤相关抗原可以包括结直肠肿瘤抗原；muc1；和/或肿瘤新抗原(neoantigen)。

7、所述第一mrna构建体还可包括另一开放阅读框(orf)，其中所述另一orf编码与所述第一orf编码的抗原不同的抗原。

8、所述另一orf可以选自：细菌蛋白、病毒蛋白或肿瘤相关抗原，或包含其片段的表位。所述另一抗原可能类似于第一orf编码的任何抗原；独立于所述第一orf编码的抗原的身份(identity)。

9、在一些实施方案中，所述第一mrna构建体还包括另一开放阅读框(orf)，其中所述另一orf编码促炎细胞因子。所述促炎细胞因子选自：ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-12、il-2、il-6、il-8和gm-csf。

10、所述第一ops包括至少3个、至少4个或至少5个mirna靶序列。所述第一ops包括至少3个互不相同的mirna靶序列。所述第一ops的任何mirna序列都可以重复。在一些实施方案中，所述第一ops包括所选的保护一个或多个器官或组织的mirna序列，所述器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道，更具体地，选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道。

11、在一些实施方案中，所述第一ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自一个或多个与mirna-122、mirna-125、mirna-199、mirna-124a、mirna-126、mirna-98、let7 mirna家族、mirna-375、mirna-141、mirna-142、mirna-148a/b、mirna-143、mirna-145、mirna-194、mirna-200c、mirna-203a、mirna-205、mirna-1、mirna-133a、mirna-206、mirna-34a、mirna-192、mirna-194、mirna-204、mirna-215、mirna-30家族(例如mirna-30a、b或c)、mirna-877、mirna-4300、mirna-4720和/或mirna-6761结合的序列。在一些实施方案中，所述第一ops包括至少两个mirna靶序列,所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mirna-30a、mirna-203a、iet7b、mirna-126和/或mirna-192结合的序列。所述第一ops包括一个或多个选自seq id no:44-57的序列。所述第一ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna133a、mirna206、mirna122、mirna203a、mirna205、mirna200c、mirna30a和/或iet7a/b结合的序列。所述第一ops包括至少两个mirna靶序列,所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mir-30a和/或mir-203a；与mirna-1、mirna-122、mirna-30a和mirna-203a；与mirna-122、mirna-1、mirna-203a和mirna-30a；与iet7b、mirna-126和mirna-30a；与mirna-122、mirna-192和mirna-30a结合的序列。在一些实施方案中，所述第一ops包括能够与mirna-192、mirna-30a和mirna-124结合的mirna靶序列，以及能够与mirna 122结合的两个mirna靶序列。

12、在一些实施方案中，所述组合物还包括包含第二开放阅读框(orf)的第二mrna构建体，其中所述第二orf编码促炎细胞因子。所述促炎细胞因子选自：il-12、il-2、il-6、il-8、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα和gm-csf。所述第二mrna构建体可以包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上，所述组合物与第一mrna构建体相同或不同。所述递送组合物选自递送载体：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒和病毒载体。

13、所述第二orf编码il-12蛋白、或其亚基、衍生物、片段、激动剂或同源物。特别地，所述第二orf包括与seq id no:59至少90％相同的序列。

14、在一些实施方案中，所述第二orf可操作地与第二非翻译区(utr)结合，其中所述utr包括第二器官保护序列(ops)，并且其中所述第二ops包括至少两个微rna(mirna)靶序列。所述至少两个mirna靶序列可以被优化以与相应的mirna序列杂交。所述第二ops被定义为类似于上述第一ops的任何变体，并且独立于第一ops的身份而变化。

15、在一些实施方案中，所述第二ops包括至少3个、至少4个或至少5个mirna靶序列。所述第二ops包括至少3个互不相同的mirna靶序列。所述第二ops包括所选的保护一个或多个器官或组织的mirna序列，所述器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤，更具体地，选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道。

16、在一些实施方案中，所述第二ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自一个或多个与mirna-122、mirna-125、mirna-199、mirna-124a、mirna-126、mirna-98、let7 mirna家族、mirna-375、mirna-141、mirna-142、mirna-148a/b、mirna-143、mirna-145、mirna-194、mirna-200c、mirna-203a、mirna-205、mirna-1、mirna-133a、mirna-206、mirna-34a、mirna-192、mirna-194、mirna-204、mirna-215、mirna-30家族(例如，mirna-30a、b或c)家族(例如，mirna-30a、b或c)、mirna-877、mirna-4300、mirna-4720和/或mirna-6761结合的序列。在一些实施方案中，所述第二ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mirna-30a、mirna-203a、iet7b、mirna-126和/或mirna-192结合的序列。所述第二ops包括一个或多个选自seq id no:44-57的序列。所述第二ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna133a、mirna206、mirna122、mirna203a、mirna205、mirna200c、mirna30a和/或iet7a/b结合的序列。所述第二ops包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mir-30a和/或mir-203a；与mirna-1、mirna-122、mirna-30a和mirna-203a；与mirna-122、mirna-1、mirna-203a和mirna-30a；与iet7b、mirna-126和mirna-30a；和/或与mirna-122、mirna-192和mirna-30a结合的序列。在一些实施方案中，所述第二ops包括能够与mirna-192、mirna-30a和mirna-124结合的mirna靶序列，以及能够与mirna 122结合的两个mirna靶序列。

17、所述第一ops包括至少一个与第二ops不同的mirna靶序列。所述第一ops和所述第二ops包括相同的mirna靶序列。在一个实施方案中，所述第一ops包括能够与mirna-1、mirna-122、mir-30a和mir-203a结合的mirna靶序列；所述第二ops包括能够与mirna-122、mirna-192和/或mirna 30a结合的mirna靶序列。

18、所述组合物还包括包含至少第三开放阅读框(orf)的至少第三mrna构建体(除第二mrna构建体外或代替第二mrna构建体)，其中所述第三orf编码与第一orf编码的抗原不同的抗原，选自：细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤相关抗原或含有其片段的表位。所述第三orf可操作地与至少与第三非翻译区(utr)连接，其中所述utr包括至少第三器官保护序列(ops)，其中所述第三ops保护多个器官，并且其中所述第三ops包括至少两个微rna(mirna)靶序列，并且其中所述至少两个mirna靶序列中的每一个都被优化以与相应的mirna序列杂交。所述第三ops被定义为类似于上述的第一或第二ops的任何变体，并且独立于第一或二ops的身份而变化。

19、在实施方案中，第一orf编码冠状病毒刺突蛋白或含有其片段的表位，第三orf编码病毒蛋白或含有其片段的表位，包括流感蛋白或其变体的全部或部分。

20、所述组合物可适用于静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或吸入施用。

21、在第二方面，提供了至少包括包含至少第一开放阅读框架(orf)第一mrna构建体的组合物；以及包括至少一个开放阅读框(orf)的至少第二mrna构建体的第二构建体，其中所述orf编码促炎细胞因子，并且其中所述第二orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，并且其中所述utr包括至少一个保护多个器官的ops，其中所述至少两个mirna靶序列中的每一个被优化以与相应的mirna序列杂交。

22、第二方面的组合物的组分可以被定义为类似于上述第一方面的相应因素的任何变体，其他组分，例如另一orf和另一mrna构建体，也可以如上所述包括在内。例如，所述第一mrna构建体的所述orf可以编码抗原，选自：细菌蛋白、和/或病毒蛋白、和/或如上述第一方面所定义的抗原。所述组合物可以包括体内递送组合物，并且所述第一和/或第二构建体可以包括在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。

23、所述第二mrna构建体的orf可编码促炎细胞因子，选自：ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-12、il-2、il-6、il-8和gm-csf，可编码il-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。

24、所述第二构建体的ops可以被定义为上述第一方面所述的任何ops。在一些实施方案中，所述ops包括保护选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤的一个或多个器官的mirna序列。所述ops可包括一个或多个选自seq id no:44-57的序列。所述ops可包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mirna-30a、mirna-203a、iet7b、mirna-126和/或mirna-192；与mirna-1、mirna133a、mirna206、mirna122、mirna203a、mirna205、mirna200c、mirna30a和/或iet7a/b；与mirna-1、mirna-122、mir-30a和/或mir-203a；与mirna-1、mirna-122、mirna-30a和mirna-203a；与mirna-122、mirna-1、mirna-203a和mirna-30a；与iet7b、mirna-126和mirna-30a；和/或与mirna-122、mirna-192和mirna-30a结合的序列。在实施方案中，所述ops包括能够与mirna-192、mirna-30a和mirna-124结合的mirna靶序列，以及能够与mirna-122结合的两个mirna靶序列。

25、由所述第一mrna构建体编码的抗原可选自：病原微生物蛋白和肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。所述病原微生物蛋白可选自：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和朊病毒。

26、所述抗原可以包括病毒蛋白或含有其片段的表位。所述抗原可以包括冠状病毒刺突蛋白、冠状病毒刺突蛋白变体、合适的sars-cov-2刺突蛋白。所述抗原可包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位；适用地，所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。所述流感蛋白可选自甲型流感、乙型流感或甲型流感的h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16亚型。所述抗原可包括呼吸合胞病毒(rsv)蛋白、其变体或含有其片段的表位；适用地，其中所述呼吸合胞病毒蛋白为f糖蛋白或g糖蛋白。所述抗原可包括人类免疫缺陷病毒(hiv)蛋白或含有其片段的表位；适用地，其中所述hiv蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。

27、所述抗原可包括来自结核分枝杆菌的蛋白或含有其片段的表位；适用地，所述来自结核分枝杆菌的蛋白选自esat-6、ag85b、tb10.4、rv2626和/或rpfd-b。

28、在进一步的实施方案中，上述任何方面或变体中描述的组合物用于预防或治疗致病性疾病的方法，其中包括将组合物施用于需要的受试者；和/或与所述的各种构建体共同施用于需要的受试者。所述致病性疾病可能由冠状病毒引起，冠状病毒可能是sars-cov-2病毒。

29、在进一步的实施方案中，提供了一种增加th1免疫应答的方法，包括施用上述定义的组合物，特别地，其中包括编码il-12蛋白或其亚基、衍生物、片段、激动剂或同源物的orf。

30、在第三方面，提供了一种包括至少一个mrna构建体的组合物，所述mrna构建体包括至少一个开放阅读框(orf)，其中所述至少一个orf编码促炎细胞因子，并且其中所述orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，其中所述utr包括至少一个保护多个器官的ops，并且其中所述ops包括至少两个mirna靶序列，并且其中所述至少两个mirna靶序列中的每一个被优化以与相应的mirna序列杂交。

31、同样，第三方面的组合物的组分被定义为类似于上述第一或第二方面的相应因素的任何变体，特别是如此定义的第二mrna构建体。所述组合物还包括体内递送组合物，其中所述mrna构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。所述促炎细胞因子可选自：il-12、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-2、il-6、il-8和gm-csf；可能是il-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。

32、所述ops可被定义为上述任何方面所述的ops。在一些实施方案中，所述ops包括保护一个或多个器官的mirna序列，所述一个或多个器官选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤。所述ops可包括一个或多个选自seq id no:44-57的序列。

33、所述ops可包括至少两个mirna靶序列，所述至少两个mirna靶序列选自能够与mirna-1、mirna-122、mirna-30a、mirna-203a、iet7b、mirna-126和/或mirna-192；与mirna-1、mirna133a、mirna206、mirna122、mirna203a、mirna205、mirna200c、mirna30a和/或iet7a/b；与mirna-1、mirna-122、mir-30a和/或mir-203a；与mirna-1、mirna-122、mirna-30a和mirna-203a；与mirna-122、mirna-1、mirna-203a和mirna-30a；与iet7b、mirna-126和mirna-30a；与mirna-122、mirna-192和mirna-30a；与mirna-192、mirna-30a和mirna-124结合的序列，以及能够与mirna-122结合的两个mirna靶序列。

34、在实施方案中，所述组合物用于预防致病性疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用所述组合物；并与疫苗组合物共同施用于所述受试者。

35、在另一实施方案中，所述组合物还包括疫苗，选自：类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于rna的疫苗、基于dna的疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、重组载体疫苗及其组合。

36、在第四方面，提供了一种治疗或预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括向需要的受试者施用组合物，所述组合物包括至少第一mrna构建体，所述第一mrna构建体包括至少第一开放阅读框(orf)，其中所述第一orf编码选自细菌蛋白、病毒蛋白或含有其片段的表位的抗原。所述第一orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，其中所述utr包含至少第一器官保护序列(ops)，其中所述ops保护多个器官，并且其中所述第一ops包含至少两个微rna(mirna)靶序列，并且其中所述至少两个mirna靶序列中的每一个都被优化以与相应的mirna序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mrna构建体包含在递送组合物中或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。

37、第四方面中使用的组合物的组分被定义为类似于上述方面的相应因素的任何变体，并且可以包括上述方面，特别是第一方面中描述的其他组分。

38、在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共同施用包括至少一个mrna构建体的组合物，所述mrna构建体包括至少第二开放阅读框(orf)，其中所述第二orf编码促炎细胞因子，所述促炎细胞因子选自：il-12、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-2、il-6、il-8和gm-csf。所述第二orf可编码il-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。所述第二orf可包括与seq id no:59至少90％相同的序列。

39、所述第一ops可包括与所述第二ops不同的一组mirna靶序列。所述第一ops与所述第二ops可包括相同的mirna靶序列。

40、所述第一和/或第二ops可以以类似于上述方面描述的形式被独立地定义。

41、在一些实施方案中，所述致病性疾病由冠状病毒引起，可以是sars-cov-2病毒。所述抗原可包括病毒蛋白或含有其片段的表位，其包括冠状病毒刺突蛋白或冠状病毒刺突蛋白变体的全部或部分。所述冠状病毒刺突蛋白可以是sars-cov-2刺突蛋白。

42、在一些实施方案中，所述第一mrna构建体还包括另一开放阅读框(orf)，其中所述另一orf编码与第一orf编码的抗原不同的抗原。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共同施用第三mrna构建体，所述第三mrna构建体包括至少第三开放阅读框(orf)，其中所述第三orf编码与第一orf编码的抗原不同的抗原。

43、在第五方面，提供了一种预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用疫苗组合物；并向所述受试者共同施用佐剂组合物，所述佐剂组合物包括至少一个mrna构建体，所述至少一个mrna构建体包括至少一个开放阅读框(orf)，其中所述至少一个orf编码促炎细胞因子，并且其中所述orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，其中所述utr包括至少一个保护多个器官的ops，其中所述ops包括至少两个mirna靶序列，并且其中所述至少两个mirna靶序列中的每一个被优化以与相应的mirna序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mrna构建体包含在递送组合物中或吸附在递送组合物上。

44、同样，第四方面中使用的组合物的组分被定义为类似于上述方面相应因素的任何变体，并可以包括上述方面所述的其他组分。

45、所述促炎细胞因子可选自：il-12、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-2、il-6、il-8和gm-csf。

46、在一些实施方案中，所述疫苗组合物选自类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于rna的疫苗、基于dna的疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、重组载体疫苗及其组合。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包括至少第一mrna构建体，所述至少第一mrna构建体包括至少第一开放阅读框(orf)，其中所述第一orf编码抗原；以及体内递送组合物，其中所述mrna构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述抗原可如任何先前方面被定义。

47、共同施用包括同时或按任何顺序连续地施用疫苗组合物和佐剂组合物。所述疫苗组合物和/或所述佐剂组合物可静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或吸入施用。

48、在第四或第五方面的一些实施方案中，所述致病性疾病是由细胞内病原体引起的。所述致病性疾病可能是潜伏感染或活动性感染。所述致病性疾病可由流感病毒、冠状病毒、sars-cov-2病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)或结核分枝杆菌引起。

49、在第六方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括对需要的受试者施用至少包括第一mrna构建体的第一组合物，所述第一mrna构建体至少包括第一开放阅读框(orf)，其中所述第一orf编码肿瘤相关抗原、或含有其片段的表位。所述第一orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，其中所述utr包括至少第一器官保护序列(ops)，其中所述ops保护多个器官，并且其中所述第一ops包括至少两个微rna(mirna)靶序列，并且其中至少两个mirna靶序列中的每一个都被优化以与相应的mirna序列杂交；以及体内递送组合物，其中所述mrna构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。

50、在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共施用包括至少一个mrna构建体的第二组合物，所述至少一个mrna构建体包括至少第二开放阅读框(orf)，其中所述第二orf编码促炎细胞因子，选自：il-12、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-2、il-6、il-8和gm-csf。所述第二mrna构建体可包括任何前述方面中定义的ops。共同施用可包括同时或以任何顺序连续施用所述第一组合物和所述第二组合物。

51、在第七方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用癌症治疗性疫苗组合物；并向受试者共同施用包括至少一个mrna构建体的组合物，所述至少一个mrna构建体包括至少一个开放阅读框(orf)，其中所述至少一个orf编码促炎细胞因子，选自il-12、ifnγ、ifnα、ifnβ、tnfα、il-2、il-6、il-8和gm-csf。所述orf可操作地与至少一个非翻译区(utr)连接，其中所述utr包括至少一个保护多个器官的ops，其中所述ops包括至少两个mirna靶序列，并且其中所述至少两个mirna靶序列的每一个被优化以与相应的mirna序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mrna构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。

52、在一些实施方案中，所述癌症治疗性疫苗组合物向受试者递送肿瘤相关抗原。所述肿瘤相关抗原使用病毒载体递送至受试者，所述病毒载体可能是腺病毒载体，在一些实施方案中为chadox1或chadox2。

53、在第六或第七方面的一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原包括结直肠肿瘤抗原和/或muc1。所述肿瘤相关抗原可以是一种根据受试者个性化的新抗原。

54、在本文描述的各种实施方案和实施例中进一步举例说明本发明，如本领域技术人员所理解的，其特征可以被进一步组合以形成另外的实例方案。