性腺体细胞的体外衍生的制作方法

本公开文本总体上涉及从多能干细胞产生性腺细胞群诸如卵巢体细胞的方法。还包括性腺细胞群以及其中产生的中间细胞群。

背景技术：

技术实现思路

1、本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素a的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含bmp和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含bmp和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含bmp和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述bmp是bmp4、bmp2、bmp7、bmp15或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基包含bmp4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。

2、本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素a的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、bmp4和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。

3、本文还提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、bmp4和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。

4、本文还提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、bmp4和fgf的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。

5、本文还提供了一种产生第一中间细胞群的方法，所述方法包括：将多能干细胞在包含激活素a和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。本文还提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养一段时间，从而产生所述第二中间细胞群。本文还提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素a和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；以及(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(rapm)、fgf和糖原合酶激酶-3抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述第二中间细胞群。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群和第二中间细胞群是用于产生性腺细胞群的分化多能干细胞的中间群。

6、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中的至少一部分细胞表达brachyury。

7、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中的至少一部分细胞表达osr1、pax2或lhx。

8、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中的至少一部分细胞表达foxl2、nr2f2或runx1。

9、在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞接种在用纤连蛋白包被的培养板中。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞接种在用基质胶包被的培养板中。

10、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含fgf。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含bmp4。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。

11、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约30ng/ml至约70ng/ml。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约50ng/ml。

12、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的fgf是fgf2。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约5ng/ml至约20ng/ml。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约12ng/ml。

13、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中bmp4的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中bmp4的浓度为约30ng/ml。

14、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021。在一些实施方案中，chir99021的浓度为约1μm至约5μm。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中chir99021的浓度为约3μm。

15、在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是y-27632。在一些实施方案中，y-27632的浓度为约5μm至约20μm。在一些实施方案中，y-27632的浓度为约10μm。在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括chroman1、emricasan和反式isrib。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是chroman1并且chroman1的浓度为约30nm至约70nm。在一些实施方案中，chroman1的浓度为约50nm。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是emricasan并且emricasan的浓度为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，emricasan的浓度为约5μm。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式isrib并且反式isrib的浓度为约0.2μm至约2μm。在一些实施方案中，反式isrib的浓度为约0.7μm。

16、在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。

17、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达brachyury。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少80％的细胞表达以下中的一种或多种：mixl1、n-钙粘蛋白、epcam、ncam。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达：brachyury、n-钙粘蛋白、epcam和ncam。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞是中胚层或中胚层样细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群基本上由中胚层或中胚层样细胞组成。

18、在任何实施方案中的一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养之前，将第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上。在一些实施方案中，在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述第一中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。

19、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含fgf。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含激活素a。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。

20、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在具有第一浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养，(ii)随后在具有不高于第二浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养。

21、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的rapm是rar激动剂。在一些实施方案中，所述rapm包括视黄酸(ra)和/或ttnpb。在一些实施方案中，所述rapm是ra。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中ra的浓度为约0.5μm至约2μm。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中ra的浓度为约1μm。在一些实施方案中，所述rapm是ttnpb。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中ttnpb的浓度为约0.2μm至约1μm。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中ttnpb的浓度为约0.5μm。

22、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的fgf是fgf2。在一些实施方案中，所述fgf2的浓度为约10ng/ml至约30ng/ml。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约20ng/ml。

23、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021。在一些实施方案中，chir99021的浓度为约1μm至约5μm。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中chir99021的浓度为约3μm。

24、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约30ng/ml。

25、在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是y-27632。在一些实施方案中，y-27632的浓度为约5μm至约20μm。在一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括chroman1、emricasan和反式isrib。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是chroman1。在一些实施方案中，chroman1的浓度为约30nm至约70nm.。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是emricasan。在一些实施方案中，emricasan的浓度为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式isrib。在一些实施方案中，反式isrib的浓度为约0.2μm至约2μm。

26、在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是y-27632，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μm y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养；以及(ii)随后在具有不高于约2μm y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养。在一些实施方案中，在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μm y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，以及(ii)随后在具有不高于约2μm y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约5-6天。

27、在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4-14天。在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5-9天。

28、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是y-27632，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养期间，y-27632的浓度各自为：(a)在前24小时期间为约10μm；(b)在24小时与72小时之间为不高于约2μm；(c)在72小时与120小时之间为不高于约0.5μm；或者(d)在120小时后为不高于约0.1μm。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述第一中间细胞群在包含细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，并且其中在约24小时之后，首先将所述培养基的一部分用不包含所述细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基替换。在一些实施方案中，所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。在一些实施方案中，所述方法进一步包括随后的培养基替换，其中所述培养基替换包括在培养开始24小时后，每约48小时将所述培养基的一部分替换。在一些实施方案中，在每次随后的培养基替换中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。

29、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的一种或多种：osr1、pax2、lhx1和runx1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的两种或更多种：osr1、pax2、lhx1和runx1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达osr1、pax2和lhx1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞是中间中胚层或中间中胚层样细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群基本上由中间中胚层或中间中胚层样细胞组成。

30、在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养之前，将第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上。在一些实施方案中，在重新铺板之前将第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在一些实施方案中，将所述第二中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。

31、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含rapm。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的rapm是rar激动剂。在一些实施方案中，所述rapm包括视黄酸(ra)和/或ttnpb。在一些实施方案中，所述rapm是ra。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中ra的浓度为约0.5μm至约2μm。在一些实施方案中，所述rapm是ttnpb。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中ttnpb的浓度为约0.2μm至约1μm。

32、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。在一些实施方案中，在所述性腺细胞诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是y-27632。在一些实施方案中，y-27632的浓度为约5μm至约20μm。在一些实施方案中，y-27632的浓度为约10μm。在一些实施方案中，在所述性腺细胞诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括chroman1、emricasan和反式isrib。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是chroman1并且chroman1的浓度为约30nm至约70nm。在一些实施方案中，chroman1的浓度为约50nm。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是emricasan并且emricasan的浓度为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，emricasan的浓度为约5μm。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式isrib并且反式isrib的浓度为约0.2μm至约2μm。在一些实施方案中，反式isrib的浓度为约0.7μm。

33、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。

34、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/ml。

35、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的bmp包括bmp4、bmp2、bmp7、bmp15或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基至少包含单独的或与另一种bmp组合的bmp4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中包含的唯一bmp是bmp4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中bmp的总浓度为约5ng/ml至约20ng/ml或约20ng/ml至约70ng/ml。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中bmp的总浓度为约10ng/ml或约50ng/ml。

36、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中bmp4的浓度为约5ng/ml至约20ng/ml。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中bmp4的浓度或约20ng/ml至约70ng/ml。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中bmp4的浓度为约10ng/ml或约50ng/ml。

37、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的fgf包括fgf2、fgf9、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基至少包含单独的或与另一种fgf组合的fgf2。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中包含的唯一fgf是fgf2。在一些实施方案中，fgf的浓度为约1ng/ml至约10ng/ml或约5ng/ml至约25ng/ml。在一些实施方案中，fgf的浓度为约5ng/ml或约10ng/ml。

38、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的fgf是fgf2。在一些实施方案中，所述fgf2的浓度为约1ng/ml至约10ng/ml。在一些实施方案中，所述fgf2的浓度为约5ng/ml至约25ng/ml。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中fgf2的浓度为约5ng/ml或约10ng/ml。

39、在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。

40、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群包含卵巢体细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群由卵巢体细胞组成。

41、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是foxl2阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是nr2f2阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是krt19阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群的至少90％是foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞、和/或krt-19阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群基本上由foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞、和/或krt-19阳性细胞组成。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述foxl2阳性细胞包括颗粒细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述nr2f2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述krt-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。

42、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下的一项或多项：(i)所述性腺细胞群中表达nr2f2的细胞的量增加；和/或(ii)所述性腺细胞群中表达foxl2的细胞的量增加；和/或(iii)所述性腺细胞群中表达runx1的细胞的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中表达wnt6的细胞的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中表达nr5a1的细胞的量增加；和/或(vi)所述性腺细胞群中表达osr1的细胞的量增加；和/或(vii)所述性腺细胞群中表达lhx9的细胞的量增加；和/或(viii)所述性腺细胞群中表达emx2的细胞的量增加。

43、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述性腺细胞群中表达nr2f2的细胞的量增加；和/或(ii)所述性腺细胞群中表达foxl2的细胞的量增加；和/或(iii)所述性腺细胞群中表达runx1的细胞的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中表达wnt6的细胞的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中表达nr5a1的细胞的量增加；和/或(vi)所述性腺细胞群中表达osr1的细胞的量增加。

44、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述性腺细胞群中表达nr2f2的细胞的量增加；和/或(ii)所述性腺细胞群中表达foxl2的细胞的量增加；和/或(iii)所述性腺细胞群中表达runx1的细胞的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中表达wnt6的细胞的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中表达nr5a1的细胞的量增加；和/或(vi)所述性腺细胞群中表达osr1的细胞的量增加；和/或(vii)所述性腺细胞群中表达lhx9的细胞的量增加；和/或(viii)所述性腺细胞群中表达emx2的细胞的量增加。

45、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述性腺细胞群中表达nr2f2的细胞的量增加；和/或(ii)所述性腺细胞群中表达foxl2的细胞的量增加；和/或(iii)所述性腺细胞群中表达runx1的细胞的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中表达wnt6的细胞的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中表达nr5a1的细胞的量增加；和/或(vi)所述性腺细胞群中表达osr1的细胞的量增加；和/或(vii)所述性腺细胞群中表达lhx9的细胞的量增加；和/或(viii)所述性腺细胞群中表达emx2的细胞的量增加。

46、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群中lhx1表达的量增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群中pax2表达的量增加；和/或(iii)所述第二中间群中wt1表达的量增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群中runx1表达的量增加；和/或(v)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。

47、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群中lhx1表达的量增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群中pax2表达的量增加；和/或(iii)所述第二中间群中wt1表达的量增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群中runx1表达的量增加；和/或(v)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。

48、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群中lhx1表达的量增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群中pax2表达的量增加；和/或(iii)所述第二中间群中wt1表达的量增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群中runx1表达的量增加；和/或(v)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。

49、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(i)所述第二中间细胞群中lhx1表达的量增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群中pax2表达的量增加；和/或(iii)所述第二中间群中wt1表达的量增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群中runx1表达的量增加；和/或(v)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。

50、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群分化为表达nr2f2的性腺细胞的潜力增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群分化为表达foxl2的性腺细胞的潜力增加；和/或(iii)所述第二中间细胞群分化为表达runx1的性腺细胞的潜力增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群分化为表达wnt6的性腺细胞的潜力增加；和/或(v)所述第二中间细胞群分化为表达nr5a1的性腺细胞的潜力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群分化为表达osr1的性腺细胞的潜力增加。

51、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(i)所述第二中间细胞群分化为表达nr2f2的性腺细胞的潜力增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群分化为表达foxl2的性腺细胞的潜力增加；和/或(iii)所述第二中间细胞群分化为表达runx1的性腺细胞的潜力增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群分化为表达wnt6的性腺细胞的潜力增加；和/或(v)所述第二中间细胞群分化为表达nr5a1的性腺细胞的潜力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群分化为表达osr1的性腺细胞的潜力增加。

52、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群分化为表达nr2f2的性腺细胞的潜力增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群分化为表达foxl2的性腺细胞的潜力增加；和/或(iii)所述第二中间细胞群分化为表达runx1的性腺细胞的潜力增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群分化为表达wnt6的性腺细胞的潜力增加；和/或(v)所述第二中间细胞群分化为表达nr5a1的性腺细胞的潜力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群分化为表达osr1的性腺细胞的潜力增加。

53、在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(i)所述第二中间细胞群分化为表达nr2f2的性腺细胞的潜力增加；和/或(ii)所述第二中间细胞群分化为表达foxl2的性腺细胞的潜力增加；和/或(iii)所述第二中间细胞群分化为表达runx1的性腺细胞的潜力增加；和/或(iv)所述第二中间细胞群分化为表达wnt6的性腺细胞的潜力增加；和/或(v)所述第二中间细胞群分化为表达nr5a1的性腺细胞的潜力增加；和/或(vi)所述第二中间细胞群分化为表达osr1的性腺细胞的潜力增加。

54、在任何实施方案中的一些实施方案中，通过所述方法产生的性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比，(i)所述性腺细胞群中foxl2表达的量减少；和/或(ii)所述性腺细胞群中nr1h4和/或kitlg表达的量减少；和/或(iii)所述性腺细胞群中krt-19表达的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中胞质krt-19表达的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中msln、lrrn4和/或tmem151a表达的量增加。

55、在任何实施方案中的一些实施方案中，通过所述方法产生的性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比，(i)所述性腺细胞群中foxl2表达的量减少；和/或(ii)所述性腺细胞群中nr1h4和/或kitlg表达的量减少；和/或(iii)所述性腺细胞群中krt-19表达的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中胞质krt-19表达的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中msln、lrrn4和/或tmem151a表达的量增加。

56、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过包括与rapm接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比，(i)所述性腺细胞群中foxl2表达的量减少；和/或(ii)所述性腺细胞群中nr1h4和/或kitlg表达的量减少；和/或(iii)所述性腺细胞群中krt-19表达的量增加；和/或(iv)所述性腺细胞群中胞质krt-19表达的量增加；和/或(v)所述性腺细胞群中msln、lrrn4和/或tmem151a表达的量增加。

57、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述多能干细胞是哺乳动物干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是牛干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是鼠多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

58、在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺群包括选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。

59、本文提供了通过所提供的任何方法产生的性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺群包括选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。在一些实施方案中，所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。

60、本文提供了通过所提供的任何方法产生的第一中间细胞群。

61、本文提供了通过任何所提供的实施方案产生的第二中间细胞群。

62、所提供的实施方案为：

63、1.一种产生颗粒细胞的方法，所述方法包括：

64、将多能干细胞在存在激活素a、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的情况下培养以产生初期中胚层样细胞(imelc)，

65、将所述imelc在存在fgf2、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的情况下培养第一时间段，

66、降低所述imelc培养中的rock抑制剂的量并且然后将所述imelc培养第二时间段以产生中间中胚层细胞，以及

67、将所述中间中胚层细胞在存在卵泡抑素、bmp4、fgf2和rock抑制剂的情况下培养以产生所述颗粒细胞。

68、2.根据实施方案1所述的方法，其中所述糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021。

69、3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述rock抑制剂是y-27632或cet。

70、4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约56至72小时。

71、5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约65小时。

72、6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中将多能干细胞在包含激活素a、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24小时将所述培养基用新鲜培养基替换。

73、7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约24小时。

74、8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约5或6天。

75、9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中将所述imelc在包含所述fgf2、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的培养基中培养第一时间段，并且其中在所述第一时间段后，将所述培养基的一部分用包含fgf2和糖原合酶激酶-3抑制剂但不包含rock抑制剂的培养基替换。

76、10.根据实施方案9所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。

77、11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述第二时间段期间，每约48小时替换所述培养基的第二部分。

78、12.根据实施方案11所述的方法，其中所述培养基的第二部分为所述培养基的约80％。

79、13.根据实施方案11-12中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞培养约5-7天的时间段。

80、14.根据实施方案11-13中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞在包含卵泡抑素、bmp4、fgf2和rock抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24至48小时将所述培养基的一部分用新鲜培养基替换。

81、15.根据实施方案11-14中任一项所述的方法，其中所述imelc表达brachyury。

82、16.根据实施方案11-13中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层细胞表达osr1、pax2和lhx1。

83、17.根据实施方案11-16中任一项所述的方法，其中所述颗粒细胞表达foxl2和连接蛋白43。

84、18.根据实施方案11-17中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。

85、19.一种群，所述群包含通过根据实施方案11-18中任一项所述的方法产生的颗粒细胞。

86、在任何所提供的实施方案中，包括所提供的任何方法或群的实施方案，(a)所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养；和/或(b)所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。在一些实施方案中，所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养。在一些实施方案中，所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。

87、在所提供的任何实施方案中的一些中，在体外进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法产生体外干细胞衍生的性腺细胞群。在特定实施方案中，所述细胞是体外干细胞衍生的性腺体细胞群，诸如卵巢体细胞群(osc)。

88、本文还提供了一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达foxl2的细胞、表达nr2f2的细胞和/或表达krt-19的细胞。在一些实施方案中，所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。在一些实施方案中，所述群至少包含表达foxl2的第一细胞类型、表达nr2f2的第二细胞类型和表达krt-19的第三细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是foxl2阳性细胞。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是nr2f2阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是krt19阳性细胞。在一些实施方案中，(a)所述细胞群中至少20％的细胞是foxl2阳性细胞；和/或(b)所述细胞群中至少20％的细胞是nr2f2阳性细胞；和/或(c)所述性腺细胞群中至少20％的细胞是krt19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中的至少90％是foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞和/或krt-19阳性细胞；任选地其中：所述性腺体细胞群基本上由foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞和/或krt-19阳性细胞组成。在一些实施方案中，所述foxl2阳性细胞包括颗粒细胞；所述nr2f2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞；并且所述krt-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。

89、在任何所提供的性腺体细胞群的实施方案的一些中，所述细胞群是从多能干细胞分化的。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺体细胞群是在包括以下的方法中衍生的：(a)将多能干细胞在包含激活素a的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(rapm)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含bmp和fgf以及任选地卵泡抑素的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。

90、在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述性腺体细胞群被冷冻保存或者已经被冷冻保存。在一些实施方案中，提供了包含性腺体细胞群的组合物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含冷冻保护剂。