性腺体细胞的体外衍生的制作方法

文档序号:35279252发布日期:2023-08-31 22:51阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

2.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

3.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

4.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

5.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

6.一种产生性腺细胞群的方法,所述方法包括:

7.一种产生第一中间细胞群的方法,所述方法包括:将多能干细胞在包含激活素a和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。

8.一种产生第二中间细胞群的方法,所述方法包括:

9.一种产生第二中间细胞群的方法,所述方法包括:

10.根据权利要求1-4和9中任一项所述的方法,其中所述第一中间细胞群中的至少一部分细胞表达brachyury。

11.根据权利要求1-4、8和9中任一项所述的方法,其中所述第二中间细胞群中的至少一部分细胞表达osr1、pax2或lhx。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群中的至少一部分细胞表达foxl2、nr2f2或runx1。

13.根据权利要求1、2、7和9-11中任一项所述的方法,其中将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。

14.根据权利要求1、2、7和9-13中任一项所述的方法,其中将所述多能干细胞接种在用纤连蛋白包被的培养板中。

15.根据权利要求1、2、7和9-13中任一项所述的方法,其中将所述多能干细胞接种在用基质胶包被的培养板中。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基进一步包含fgf。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基进一步包含bmp4。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约30ng/ml至约70ng/ml。

21.根据权利要求20所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约50ng/ml。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中的fgf是fgf2。

23.根据权利要求22所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约5ng/ml至约20ng/ml,任选地其中所述中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约12ng/ml。

24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中bmp4的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml,任选地其中所述中胚层诱导培养基中bmp4的浓度为约30ng/ml。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021。

26.根据权利要求25所述的方法,其中chir99021的浓度为约1μm至约5μm。

27.根据权利要求26所述的方法,其中所述中胚层诱导培养基中chir99021的浓度为约3μm。

28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法,其中在所述中胚层诱导培养基中:

29.根据权利要求28所述的方法,其中在所述中胚层诱导培养基中:

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法,其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。

31.根据权利要求30所述的方法,其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。

32.根据权利要求31所述的方法,其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法,其中所述第一中间细胞群中至少90%的细胞表达brachyury。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中所述第一中间细胞群中至少80%的细胞表达以下中的一种或多种:mixl1、n-钙粘蛋白、epcam、ncam。

35.根据权利要求1-34所述的方法,其中所述第一中间细胞群中至少90%的细胞表达:brachyury、n-钙粘蛋白、epcam和ncam。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述第一中间细胞群中至少90%的细胞是中胚层或中胚层样细胞。

37.根据权利要求36所述的方法,其中所述第一中间细胞群基本上由中胚层或中胚层样细胞组成。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法,其中在中间中胚层诱导培养基中培养之前,将所述第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上;任选地其中在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。

39.根据权利要求38所述的方法,其中将所述第一中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含fgf。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含激活素a。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。

44.根据权利要求43所述的方法,其中所述方法包括将所述第一中间细胞群

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中的rapm是rar激动剂,任选地其中所述rapm包括视黄酸(ra)和/或ttnpb。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法,其中:

47.根据权利要求46所述的方法,其中

48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中的fgf是fgf2,其中所述fgf2的浓度为约10ng/ml至约30ng/ml。

49.根据权利要求48所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中fgf2的浓度为约20ng/ml。

50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021,其中chir99021的浓度为约1μm至约5μm。

51.根据权利要求50所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中chir99021的浓度为约2μm或约3μm。

52.根据权利要求42-51中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml。

53.根据权利要求52所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素a的浓度为约30ng/ml。

54.根据权利要求43和46-53中任一项所述的方法,其中在所述中胚层诱导培养基中:

55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是y-27632,其中所述方法包括将所述第一中间细胞群:

56.根据权利要求45-55中任一项所述的方法,其中所述方法包括将所述第一中间细胞群:

57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法,其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4-14天。

58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法,其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5-9天。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是y-27632,其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养期间,y-27632的浓度:

60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法,其中将所述第一中间细胞群在包含细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时,并且其中在约24小时之后,首先将所述培养基的一部分用不包含所述细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基替换。

61.根据权利要求60所述的方法,其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80%。

62.根据权利要求60或61所述的方法,其中所述方法进一步包括随后的培养基替换,其中所述培养基替换包括在培养开始24小时后,每约48小时将所述培养基的一部分替换。

63.根据权利要求62所述的方法,其中在每次随后的培养基替换中所述培养基的一部分为所述培养基的约80%。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法,其中所述第二中间细胞群中至少90%的细胞表达以下中的一种或多种:osr1、pax2、lhx1和runx1。

65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法,其中所述第二中间细胞群中至少90%的细胞表达以下中的两种或更多种:osr1、pax2、lhx1和runx1。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法,其中所述第二中间细胞群中至少90%的细胞表达osr1、pax2和lhx1。

67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法,其中所述第二中间细胞群中至少90%的细胞是中间中胚层或中间中胚层样细胞。

68.根据权利要求67所述的方法,其中所述第二中间细胞群基本上由中间中胚层或中间中胚层样细胞组成。

69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法,其中在性腺细胞诱导培养基中培养之前,将所述第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上;任选地其中在重新铺板之前将所述第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。

70.根据权利要求69所述的方法,其中将所述第二中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。

71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含rapm。

72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。

73.根据权利要求1、3、5和10-72中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。

74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/ml至约50ng/ml。

75.根据权利要求74所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/ml。

76.根据权利要求1、3、5和10-75中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中的bmp包括bmp4、bmp2、bmp7、bmp15或其任何组合。

77.根据权利要求1、3、5和10-76中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中bmp的总浓度为约5ng/ml至约20ng/ml、或约20ng/ml至约70ng/ml。

78.根据权利要求77所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中bmp的总浓度为约10ng/ml或约50ng/ml。

79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中bmp4的浓度为约5ng/ml至约20ng/ml或约20ng/ml至约70ng/ml。

80.根据权利要求79所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中bmp4的浓度为约10ng/ml或约50ng/ml。

81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中的fgf包括fgf2、fgf9、fgf10、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19或其任何组合。

82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法,其中fgf的浓度为约1ng/ml至约10ng/ml或约5ng/ml至约25ng/ml。

83.根据权利要求82所述的方法,其中fgf的浓度为约5ng/ml或约10ng/ml。

84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中的fgf是fgf2,其中所述fgf2的浓度为约1ng/ml至约10ng/ml或约5ng/ml至约25ng/ml。

85.根据权利要求84所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中fgf2的浓度为约5ng/ml或约10ng/ml。

86.根据权利要求71-85中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞诱导培养基中的rapm是rar激动剂,任选地其中所述rapm包括视黄酸(ra)和/或ttnpb。

87.根据权利要求86所述的方法,其中

88.根据权利要求72-87中任一项所述的方法,其中在所述性腺细胞诱导培养基中:

89.根据权利要求88所述的方法,其中在所述性腺细胞诱导培养基中:

90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法,其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。

91.根据权利要求90所述的方法,其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。

92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群包含卵巢体细胞。

93.根据权利要求1-92中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群由卵巢体细胞组成。

94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群中至少20%的细胞是foxl2阳性细胞。

95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群中至少20%的细胞是nr2f2阳性细胞。

96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群中至少20%的细胞是krt19阳性细胞。

97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法,其中所述性腺细胞群的至少90%是foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞、和/或krt-19阳性细胞。

98.根据权利要求97所述的方法,其中所述性腺细胞群基本上由foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞、和/或krt-19阳性细胞组成。

99.根据权利要求97或98所述的方法,其中所述foxl2阳性细胞包括颗粒细胞;其中所述nr2f2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞;并且其中所述krt-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。

100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比,

101.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应的性腺细胞群相比,

102.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应的性腺细胞群相比,

103.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比,

104.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

105.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

106.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

107.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比,(i)所述第二中间细胞群中lhx1表达的量增加;和/或

108.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

109.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

110.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比,

111.根据权利要求1-99中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比,(i)所述第二中间细胞群分化为表达nr2f2的性腺细胞的潜力增加;和/或

112.根据权利要求1-111中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比,

113.根据权利要求1-111中任一项所述的方法,其中:与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含rapm的方法产生的相应性腺细胞群相比,

114.根据权利要求1-111中任一项所述的方法,其中:与通过包括与rapm接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比,

115.根据权利要求1-114中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是哺乳动物干细胞。

116.根据权利要求1-115中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是人多能干细胞。

117.根据权利要求1-115中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是牛干细胞。

118.根据权利要求1-115中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是鼠多能干细胞。

119.根据权利要求115-118中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

120.根据权利要求1-6和10-119中任一项所述的方法,其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群:颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。

121.根据权利要求1-6和10-120中任一项所述的方法,其中所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。

122.一种性腺细胞群,所述性腺细胞群通过根据权利要求1-6和10-121中任一项所述的方法产生。

123.根据权利要求122所述的性腺细胞群,其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群:颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。

124.根据权利要求122或权利要求123所述的性腺细胞群,其中所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。

125.一种第一中间细胞群,所述第一中间细胞群通过根据权利要求7和13-119中任一项所述的方法产生。

126.一种第二中间细胞群,所述第二中间细胞群通过根据权利要求6-11和13-119中任一项所述的方法产生。

127.一种产生颗粒细胞的方法,所述方法包括:

128.根据权利要求127所述的方法,其中所述糖原合酶激酶-3抑制剂是chir99021。

129.根据权利要求127或128所述的方法,其中所述rock抑制剂是y-27632或cet。

130.根据权利要求127-129中任一项所述的方法,其中将所述多能干细胞培养约56至72小时。

131.根据权利要求127-130中任一项所述的方法,其中将所述多能干细胞培养约65小时。

132.根据权利要求127-131中任一项所述的方法,其中将多能干细胞在包含激活素a、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的培养基中培养,并且其中每约24小时将所述培养基用新鲜培养基替换。

133.根据权利要求127-132中任一项所述的方法,其中所述第一时间段为约24小时。

134.根据权利要求127-133中任一项所述的方法,其中所述第二时间段为约5或6天。

135.根据权利要求127-134中任一项所述的方法,其中将所述imelc在包含所述fgf2、糖原合酶激酶-3抑制剂和rock抑制剂的培养基中培养第一时间段,并且其中在所述第一时间段后,将所述培养基的一部分用包含fgf2和糖原合酶激酶-3抑制剂但不包含rock抑制剂的培养基替换。

136.根据权利要求135所述的方法,其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80%。

137.根据权利要求135或136所述的方法,其中所述方法进一步包括在所述第二时间段期间,每约48小时替换所述培养基的第二部分。

138.根据权利要求137所述的方法,其中所述培养基的第二部分为所述培养基的约80%。

139.根据权利要求127-138中任一项所述的方法,其中将所述中间中胚层细胞培养约5-7天的时间段。

140.根据权利要求127-139中任一项所述的方法,其中将所述中间中胚层细胞在包含卵泡抑素、bmp4、fgf2和rock抑制剂的培养基中培养,并且其中每约24至48小时将所述培养基的一部分用新鲜培养基替换。

141.根据权利要求127-140中任一项所述的方法,其中所述imelc表达brachyury。

142.根据权利要求127-139中任一项所述的方法,其中所述中间中胚层细胞表达osr1、pax2和lhx1。

143.根据权利要求127-142中任一项所述的方法,其中所述颗粒细胞表达foxl2和连接蛋白43。

144.根据权利要求127-143中任一项所述的方法,其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。

145.一种群,所述群包含通过根据权利要求127-144中任一项所述的方法产生的颗粒细胞。

146.根据权利要求1-145中任一项所述的方法或群,其中:

147.根据权利要求1-146中任一项所述的方法或群,其中所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养。

148.根据权利要求1-147中任一项所述的方法或群,其中所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。

149.一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群,所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达foxl2的细胞、表达nr2f2的细胞和/或表达krt-19的细胞,任选地其中所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。

150.根据权利要求149所述的性腺体细胞群,其中所述群至少包含表达foxl2的第一细胞类型、表达nr2f2的第二细胞类型和表达krt-19的第三细胞类型。

151.根据权利要求149或150所述的性腺体细胞群,其中:

152.根据权利要求149-151中任一项所述的性腺体细胞群,其中所述性腺细胞群的至少90%是foxl2阳性细胞、nr2f2阳性细胞、和/或krt-19阳性细胞;任选地其中:

153.根据权利要求151或152所述的性腺体细胞群,其中所述foxl2阳性细胞包括颗粒细胞;其中所述nr2f2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞;并且其中所述krt-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。

154.根据权利要求149-153中任一项所述的性腺体细胞群,其中所述细胞群是在包括以下的方法中衍生的:


技术总结
本文提供了从多能干细胞产生性腺细胞群诸如卵巢体细胞的方法。还包括性腺细胞群以及其中产生的中间细胞群。

技术研发人员:R·巴尔盖杰,K·B·塞雷斯,P·乌尔塔多-冈萨雷斯,A·米勒
受保护的技术使用者:概念生物科学公司
技术研发日:
技术公布日:2024/1/14
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