Faecalibaculumrodentium菌在炎症性肠病中的用途

faecalibaculum rodentium菌在炎症性肠病中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种faecalibaculum rodentium菌在炎症性肠病中的用途。


背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)是在肠道发生的慢性复发性炎症性疾病，包括克罗恩氏病(cd，crohn’s disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)。目前多数研究认为环境因素、遗传易感性、肠道粘膜的异常免疫反应和肠道菌群的改变等多种因素参与ibd的发生发展。近年来，越来越多证据表明肠道菌群紊乱与ibd的发生密切相关。
3.完全性肠内营养(exclusive enteral nutrition，een)是cd患者重要的营养支持模式。多项随机对照临床研究表明，een不仅可有效促进cd患者的临床缓解，减少并发症发生，促进内镜下的粘膜愈合，甚至还可降低cd患者的术后复发。但是een是如何作用，以及其具体机制和涉及的作用因素等，目前还未得到完善的解释，若得以阐述een具体的缓解炎症性肠病机理，有望形成更为有效的炎症性肠病治疗方式、药物等。
4.调节肠道菌群是治疗肠炎的重要手段之一，补充益生菌可以通过调节宿主黏膜、系统免疫功能以及肠道内菌群平衡，以减少肠道炎的发生、发展。目前，对于通过该类治疗方式以实现治疗的产品，市面上主要包括以乳酸杆菌和双歧杆菌为主的益生菌活性制剂；该类制剂可修复肠黏膜屏障，对肠道炎症产生一定预防进而治疗作用。但是，仅目前的益生菌活性制剂而言，仍然是难以满足相应的预防、治疗需求，且我国从益生菌出发制备的治疗肠炎的药物较少，亟需发掘新型益生菌以及基于该菌形成的炎症性肠病治疗药物、策略，以进一步完善现有技术炎症性肠病治疗技术。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种faecalibaculum rodentium菌在诊断、预防或治疗炎症性肠病中的用途，基于在患病人群中丰度特异性减少的faecalibaculum rodentium菌，利于及时诊断患病人群，且通过提高faecalibaculum rodentium菌的量，能够有效缓解炎症性肠病，利于实现炎症性肠病的预防和治疗。
6.本发明的一个目的在于提供检测肠道中faecalibaculum rodentium菌丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断炎症性肠病的产品中的用途。在本发明的一个以上实施例中，与正常人群相比，炎症性肠病病人中faecalibaculum rodentium的相对丰度显著减少。而基于该特异性的丰度表现，能实现炎症性肠病的诊断，并应用于相应的诊断或辅助诊断产品上。进一步地，炎症性肠病包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病。
7.进一步地，试剂包括但不限于引物、探针、反义寡核苷酸、适配体、抗体。在本发明的一个以上实施例中，通过qpcr能够检测相应的faecalibaculum rodentium相对丰度，即通过相应的qpcr引物能实现faecalibaculum rodentium的检测。同样，现有技术发展较为
成熟的微生物检测方法也能实现相应的faecalibaculum rodentium相对丰度检测，包括通过探针、反义寡核苷酸、适配体和抗体以检测的方法。进一步地，qpcr引物包括：正义引物5
’‑
ccgggaatacgctctggaaa-3’；反义引物5
’‑
gccaaccaactaatgcaccg-3’。
8.进一步地，产品包括但不限于试剂盒、芯片、高通量测序平台。基于faecalibaculum rodentium丰度检测试剂，有利于构建系统、完善的试剂盒、芯片。除了应用以制备该类试剂产品外，对于基于测序而检测faecalibaculum rodentium相对丰度的方法而言，还可进一步应用以制备具有检测faecalibaculum rodentium相对丰度功能的高通量测序平台。
9.本发明的另一目的在于提供faecalibaculum rodentium菌在制备预防、治疗炎症性肠病的产品中的用途。在本发明的一个以上实施例中，增加faecalibaculum rodentium于胃肠内后，炎症因子显著降低、屏障因子显著上升，有效缓解了炎症性肠病。
10.进一步地，产品包括提高faecalibaculum rodentium菌丰度的试剂。在本发明的一个以上实施例中，通过直接灌胃faecalibaculum rodentium至动物模型以增加动物模型体内faecalibaculum rodentium丰度，且在增加该菌丰度后，肠炎得到有效缓解。进一步地，试剂包括含有faecalibaculum rodentium菌的制剂。
11.进一步地，产品包括但不限于食品、保健品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药、饲料添加剂。通过食品、保健品、场内营养剂、膳食补充剂等方式，均能通过增加faecalibaculum rodentium相对丰度以达到预防或治疗效果。同样的，对于畜牧养殖过程，可制备相应的兽药、饲料添加剂，以通过faecalibaculum rodentium预防或缓解动物炎症性肠病。
12.进一步地，炎症性肠病包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病。
13.本发明的再一目的在于提供一种炎症性肠病标志物，为丰度特异性减少的faecalibaculum rodentium菌。
14.本发明的再一目的在于提供一种预防或治疗炎症性肠病的药物制剂，含有faecalibaculum rodentium菌和/或其代谢产物。通过直接增加faecalibaculum rodentium菌，有利于直接提升faecalibaculum rodentium丰度，从而预防或治疗缓解炎症性肠病。同样的，对于faecalibaculum rodentium的代谢产物而言，其更可能是直接缓解炎症性肠病的原因，基于已确定的faecalibaculum rodentium菌，其含有该菌代谢产物的药物制剂也应具备预防或治疗炎症性肠病的功效。进一步地，炎症性肠病包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病。
15.进一步地，还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
16.本发明的再一目的在于提供一种试剂盒，包括检测faecalibaculum rodentium菌相对丰度的试剂。
17.本发明的再一目的在于提供一种faecalibaculum rodentium检测系统，包括数据处理模块，所述数据处理模块用于将faecalibaculum rodentium菌丰度转换为炎症性肠病的判断结果。所述数据处理模块可以是计算机系统或高通量测序平台的一部分，在获取检测样本中faecalibaculum rodentium相对丰度后，即结合其相对丰度水平而检测、诊断炎症性肠病。
18.本发明的再一目的在于提供一种een在制备调节faecalibaculum rodentium菌丰度的试剂中的用途。在本发明的一个以上实施例中证实，faecalibaculum rodentium在een作用下相对丰度提高，即een可应用于调节faecalibaculum rodentium相对丰度的试剂中，尤其是增加faecalibaculum rodentium丰度的试剂中。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于在患病人群中相对丰度少的faecalibaculum rodentium菌，利于及时诊断患病人群；通过提高faecalibaculum rodentium菌的量，能够有效缓解炎症性肠病，利于实现炎症性肠病的预防和治疗。基于该菌的标志物作用，便于实现相应的检测产品，包括试剂和装置，以便炎症性肠病尽早得到诊断，从而获得有效治疗。基于faecalibaculum rodentium作用于个体后的治疗效果，有利于临床基于该菌进行炎症性肠病患者的治疗或提供基于该菌特性的治疗药物，完善现有技术中炎症性肠病的治疗产品、技术和方案。
附图说明
20.图1显示实施例1中een能够缓解小鼠的自发性肠炎；
21.图2显示实施例2中een的粪菌移植可缓解dss诱导的肠炎；
22.图3显示实施例3中een可明显改变肠道菌群结构，起到缓解肠道炎症的作用；
23.图4显示实施例4中faecalibaculum rodentium受een调控且是在een缓解炎症过程中起重要作用的细菌；
24.图5显示实施例5中faecalibaculum rodentium中起到缓解肠道炎症的作用；
25.图6显示实施例6中faecalibaculum rodentium在cd与正常人群中的相对丰度；
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
28.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
29.具体的，下述实施例涉及的疾病活动性评分(disease activity index)标准如表1所示，四联抗生素水配方如表2所示，qpcr引物序列如表3所示。
30.表1疾病活动性评分(disease activity index)标准
[0031][0031][0032]
表2四联抗生素水配方
[0033]
抗生素浓度盐酸万古霉素100mg/l甲硝唑200mg/l氨苄青霉素200mg/l硫酸新霉素200mg/l
[0034]
表3qpcr引物序列
[0035]
实施例1
[0036]
een治疗对小鼠自发性肠炎的影响
[0037]
将16-18周spf级il-10-/-小鼠随机分为对照组(control组)和处理组(een组)，对照组每天正常饮水，处理组每天以16.8g/200ml een自由饮水；本实施例及以下实施例中，将肠内营养粉剂(tp，安素，购自雅培)溶于水制备获得een。两组均自由饮用28天，脱臼处死小鼠并解剖。用组织rna提取试剂盒提取对照组(control组)和处理组(een组)小鼠小肠组织rna，并用逆转录试剂盒逆转录所提取的rna，检测小鼠小肠组织炎症因子与屏障分子的基因表达。
[0038]
结果表明，een能够缓解小鼠自发性肠炎。结果如图1所示，与对照组相比，een组中小肠表达il-1β、tnf-α、cxcl1、il-6显著降低(p《0.05)，小肠表达zo-1和claudin显著增加(p《0.05)，提示een对小肠屏障完整性具有保护作用，缓解结肠炎症。实施例2
[0039]
粪菌移植对een缓解dss诱导肠炎作用的影响
[0040]
将4-6周spf级c57bl/6小鼠随机分为对照组(control组)和处理组(een组)，实验开始后，对照组正常饮水，处理组以16.8g/200ml een自由饮水。两组均自由饮水三周后，从
第四周开始每天收集粪便，并进行粪菌移植到对应的fmt-een组和fmt-control组小鼠中。两组均饮用3％dss水一周，每天记录小鼠体重，并按照表1疾病活动性评分标准进行评分。停用3％dss水后两天，脱臼处死小鼠并解剖，测量小鼠结肠长度(cm)。用组织rna提取试剂盒提取fmt-een组和fmt-control组小鼠小肠组织rna，并用逆转录试剂盒逆转录所提取的rna，检测小鼠小肠组织炎症因子与屏障分子的基因表达。
[0041]
结果表明，通过移植小鼠肠道菌群后，een缓解dss诱导肠炎的作用。结果如图2所示，两组都进行dss处理，与fmt-control组相比，接受处理组的粪菌移植的小鼠体重没有显著下降(p《0.01)，小鼠疾病活动性评分没有显著升高(p《0.01)，小鼠结肠长度没有显著缩短(p《0.01)，小肠表达il-1β、tnf-α、cxcl1显著降低(p《0.05)，小肠表达muc2、zo-1和ocluddin显著增加(p《0.05)，提示接受处理组的粪菌移植对结肠屏障完整性具有保护作用，缓解结肠炎症。如图2所示。实施例3
[0042]
een对小鼠肠道菌群结构的影响
[0043]
采用dneasy blood&tissue试剂盒(qiagen,germantown,md)提取实施例2对照组小鼠(control)和处理组(een组)粪便的基因组dna，进行16s rrna基因测序。采用双条形码引物pcr扩增v4可变区，扩增子使用ampure xp(beckman coulter)进行纯化，使用quantum-it picogreen ds dna assay kit(thermo fisher scientific)进行定量。使用high sensitivity dna kit(agilent)和kapa library quantification kit for illumina(kapa biosystems)在bioanalyzer 2100上对扩增子进行进一步的鉴定和定量。将变性扩增子与20％phix control v.3混合，在hiseq(illumina，2
×
250-bp paired-end reads)上测序。根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用flash(v1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/flash/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(raw tags)；拼接得到的raw tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(clean tags)。clean tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effective tags)。对所有样本的全部effective tags进行聚类，使用quantitative insights into microbial ecology(qiime)软件，采用推荐参数进行多路复用和质量过滤，将相似度为》97％的16s v4序列聚类到otus中。采用基于greengene数据库的uclust3算法对otu分类单元进行分类。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的alpha多样性分析和beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
[0044]
使用qiime软件(version 1.9.1)计算chao1，shannon指数，使用r软件(version 2.15.3)进行alpha多样性指数组间差异分析；alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，统计方法选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。用qiime软件计算unifrac距离、构建upgma样本聚类树。使用r软件绘制pca图，并使用r软件的ade4包和ggplot2软件包进行pca分析。使用r软件进行beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，使用tukey检验和agricolae包的wilcox检验进行统计分析。
[0045]
结果如图3所示，een处理后小鼠粪便中的菌群丰度显著性低于对照组，菌群多样性显著地低于对照组，主成分分析结果表明，een处理后与对照组相比，肠道菌群结构存在显著性差异，提示een可明显改变肠道菌群结构，从而起到缓解肠道炎症的作用。实施例4
[0046]
een对faecalibaculum rodentium的影响
[0047]
用粪便dna小量提取试剂盒提取前述实施例control组、een组和fmt-control组、fmt-een组小鼠粪便dna，进行qpcr，以16s基因为内参，检测其中faecalibaculum rodentium的相对丰度。
[0048]
结果如图4所示，与control组相比，een组小鼠faecalibaculum rodentium相对丰度显著增加，提示een能够富集faecalibaculum rodentium。与fmt-control组相比，fmt-een组小鼠faecalibaculum rodentium相对丰度显著增加，提示faecalibaculum rodentium能够通过粪菌移植进行作用。如图4所示(不同组的faecalibaculum rodentium相对丰度)。实施例5
[0049]
faecalibaculum rodentium缓解小鼠自发性肠炎的影响
[0050]
将16-18周spf级il-10-/-小鼠随机分为,control组、faecalibaculum rodentium组和dh5α组，control组灌胃200ul pbs、faecalibaculum rodentium组和dh5α组分别以10^8cfu/200ul灌胃，一周灌胃三次。四周后，脱臼处死小鼠并解剖，并按照表1病理评分标准进行评分。用组织rna提取试剂盒提取三组小鼠小肠组织rna，并用逆转录试剂盒逆转录所提取的rna，检测小鼠小肠组织炎症因子与屏障分子的基因表达。
[0051]
结果如图5所示，与control和dh5α组相比，faecalibaculum rodentium组减缓小鼠病理评分上升(p＝0.072)，小肠表达il-1β、il-6、tnf-α、cxcl1显著降低(p《0.05)，小肠表达muc2、zo-1和claudin显著增加(p《0.05)，提示faecalibaculum rodentium对结肠屏障完整性具有保护作用，缓解结肠炎症。实施例6
[0052]
faecalibaculum rodentium在cd与正常人群中的相对丰度
[0053]
正常人群和克罗恩氏病人(cd)的宏基因组数据从european nucleotide archive(ena)(era701286)中下载，使用humann2平台分析不同样本中faecalibaculum rodentium的相对丰度。
[0054]
结果如图6所示，与正常人群相比，cd病人中faecalibaculum rodentium的相对丰度显著减少。
[0055]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。