一种高产草欧菌素A的成团泛菌发酵培养基及发酵方法

一种高产草欧菌素a的成团泛菌发酵培养基及发酵方法
技术领域
1.本发明涉及微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种高产草欧菌素a的成团泛菌发酵培养基及发酵方法。


背景技术：

2.目前，农业生产过程中主要通过化学农药对作物病虫害进行防治，但化学药剂的大量长期使用不但引起环境污染、农药残留、病原菌产生抗药性等问题，甚至还会造成食品安全问题，对人畜健康都造成重大威胁。近年来，随着人们环保意识的加强以及对食品安全的重视，生物防治策略逐渐受到关注。利用生物农药进行病害防治是生物防治的一种重要途径。一般通过利用生物活体、生物代谢产物或生物特定基因而制成的农药，如农用抗生素、微生物农药、植物源农药等，均可归为生物农药。
3.草欧菌素a(herbicolin a)是一种含有八个氨基酸的脂肽类物质，由winkelmann等于1980年首次从草生欧文氏菌erwinia herbicola a111发酵液中分离而得。研究表明，草欧菌素a对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢等植物病原真菌以及白色念珠菌、烟曲霉等人体条件致病菌均具有抑制效果。草欧菌素a具有独特的抑菌机制，其可通过结合禾谷镰刀菌细胞膜上的麦角甾醇，破坏膜上脂筏的结构，从而发挥抑菌活性，可作为良好的生物源农药用于生物防治。
[0004][0005]
目前，对草欧菌素a的合成途径已经研究清楚，但是其发酵产量仍然较低(仅为30mg/l左右)，与工业化生产水平差距较大，为了提高草欧菌素a产量，一方面提升菌株zju23的生防效果，另一方面促进草欧菌素a在农业和医学上的应用。有必要进一步优化其发酵工艺，改进发酵条件，充分发挥菌株的潜在生产能力，从而为后续研究草欧菌素a在农业和医学上的应用奠定基础。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种高产草欧菌素a的成团泛菌发酵培养基及发酵方法，提高草欧菌素a的产量，为后续研究草欧菌素a在农业和医学上的应用奠定基础。
[0007]
具体技术方案如下：
[0008]
本发明提供了一种高产草欧菌素a的成团泛菌发酵培养基，所述发酵培养基包含：10～20g/l玉米浆，8～12g/l甘油，8～12mm氯化钙，12～17mm苏氨酸，初始ph为4.0～6.0。
[0009]
进一步地，所述发酵培养基为：15g/l玉米浆，10g/l甘油，10mm氯化钙，15mm苏氨酸，初始ph为5.0。
[0010]
本发明还提供了一种高产草欧菌素a的发酵方法，包括：将成团泛菌接种至发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基如上所述；发酵温度为18～25℃，发酵时间为50～75h。
[0011]
进一步地，所述成团泛菌为成团泛菌(pantoea agglomerans)zju23，菌株保藏编号为cgmcc no.16174，保藏日期为2018年7月30日。
[0012]
进一步地，所述成团泛菌的接种量为1
×
108cfu。
[0013]
更进一步地，所述发酵温度为20℃，发酵时间为72h。
[0014]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0015]
本发明在原始培养基的基础上，通过重新筛选基础发酵培养基，进行单因素试验、plackett-burman试验、box-benhnken design试验及响应面法等实验设计方法，优化了草欧菌素a的新型发酵培养基及培养条件，优化后的培养基原料丰富，利用该培养基对成团泛菌zju23进行发酵，草欧菌素a的产量能够达到211.1mg/l，比原始发酵条件提高了542％。
附图说明
[0016]
图1为草欧菌素a浓度与吸收峰面积间的标准曲线。
[0017]
图2为不同培养基中草欧菌素a的产量；
[0018]
其中，ta为ta培养基，lb为luria-bertani培养基，kb为king’s b培养基，tsb为胰酪大豆胨培养基，nb为营养肉汤，wa为warkingsman培养基。
[0019]
图3为不同氮源(a)、碳源(b)、无机盐(c)、氨基酸(d)对草欧菌素a产量的影响。
[0020]
图4为不同培养基成分添加量及不同培养条件对草欧菌素a产量的影响；
[0021]
其中，a为不同浓度玉米浆对草欧菌素a产量的影响，b为不同浓度甘油对草欧菌素a产量的影响，c为不同浓度氯化钙对草欧菌素a产量的影响，d为不同浓度苏氨酸对草欧菌素a产量的影响，e为不同发酵时间对草欧菌素a产量的影响，f为不同发酵温度对草欧菌素a产量的影响，g为不同初始ph值对草欧菌素a产量的影响，h为不同菌株接种量对草欧菌素a产量的影响。
[0022]
图5为plackett-burman实验设计结果分析；
[0023]
其中，(a)为正态概率图；(b)为标准化效应的半正态图；(c)为帕累托图。
[0024]
图6为响应面分析不同因子对草欧菌素a产量的影响；
[0025]
其中，a为玉米浆和初始ph值交互作用的等高线图，b为玉米浆和初始ph值交互作用的响应曲面图，c为玉米浆和温度交互作用的等高线图，d为玉米浆和温度交互作用的响应曲面图，e为温度和初始ph值交互作用的等高线图，f为温度和初始ph值交互作用的响应曲面图。
[0026]
图7为ta培养基与本发明的发酵培养基中草欧菌素a的产量变化。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
[0028]
实施例1
[0029]
一种高产草欧菌素a的发酵方法，利用minitab17及design expert 12软件，通过单因素试验筛选新的培养基原料，分析不同的原料使用量及发酵参数对草欧菌素a产量的影响，以此确定plackett-burman试验的水平。该发酵培养基包含：15g/l玉米浆，10g/l甘油，10mm氯化钙，15mm苏氨酸，初始ph为5.0。本实施例所述的成团泛菌为成团泛菌(pantoea agglomerans)zju23，菌株保藏编号为cgmcc no.16174，保藏日期为2018年7月30日。
[0030]
以成团泛菌zju23发酵产草欧菌素a的产量作为响应值，对8个影响因素进行评价，筛选出主效应因子，将主效应因子作为响应面设计的因素，建立响应值与各因素之间的数学模型，依据模型预测草欧菌素a的最高产量。
[0031]
具体包括以下步骤：
[0032]
(1)本发明中草欧菌素a的检测方法：本实施例中使用高效液相色谱法(hplc)对发酵液中的草欧菌素a产量进行测定。发酵液离心上清去初步处理后，用于hplc测定。使用zorbax rx c-18 250x4.6mm柱子进行试验，柱温为40℃，进样量为10μl，紫外吸收峰为210nm。流动相为：a液(含有0.1％甲酸的甲醇)，b液(0.1％磷酸的去离子水)。进样程序为：0-30min，30％a-90％a；30-40min，90％a-100％a，溶液a和溶液b总比例为100％，流速为1ml/min。
[0033]
标准曲线的制备：以草欧菌素a标准品进行hplc，绘制标准曲线(图1)。标准曲线方程为：y＝7.5214x，y为对应的峰面积，x为对应的草欧菌素a浓度。r2＝0.9988。
[0034]
(2)基础培养基筛选
[0035]
过夜摇培获得种子液，将其od值调整为1.0，按照1:1000进行接种，25℃、180rpm下培养72h，每组试验设三个重复。通过高效液相色谱法测定发酵液上清中的草欧菌素a的含量。测试的6中培养基成分如表1所示。
[0036]
表1培养基配方(用于基础培养基筛选)
[0037]
[0038]
如图2所示，在这6种培养基中，king’s b培养基的草欧菌素a产量最高，达到87.42mg/l。因此，以king’s b培养基作为继续优化的基础培养基。
[0039]
(3)单因素试验确定plackett-burman试验的水平
[0040]
以king’s b培养基作为基础培养基，即10g/l蛋白胨、15g/l甘油、1.5g/l磷酸氢二钾、6g/l硫酸镁，在此基础上，替换相应的考察对象，其他不变，测定成团泛菌zju23的草欧菌素a发酵产量。每组实验设三个重复。
[0041]
氮源的筛选：选取玉米浆、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、酪蛋白水解物、氯化铵、硝酸铵、尿素9种原料作为氮源，替换蛋白胨，测定其对草欧菌素a的影响。如图3a所示，以玉米浆作为氮源时，草欧菌素a的含量最高，达到109.21mg/l，其次是大豆蛋白胨，而当使用无机氮源，如氯化铵、硝酸铵、尿素时，hplc未能检测到草欧菌素a的产生。因此，选用玉米浆作为新的氮源。
[0042]
碳源的筛选：选取8中不同碳源(淀粉、甘露醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖)替换甘油作为培养基原料，测定其对草欧菌素a产量的影响。如图3b所示，以甘油作为碳源时，发酵液中草欧菌素a的含量最高，达到89.90mg/l，其次是果糖，乳糖及麦芽糖，分别达到70.73mg/l,66.68mg/l，66.06mg/l.因此，选用甘油作为新发酵培养基的碳源。
[0043]
无机盐的筛选：分别使用硫酸锰、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铜加入培养基，替换king’sb培养基中原有的硫酸镁和磷酸氢二钾，终浓度均为1mm，测定不同盐粒子对草欧菌素a合成的影响，以不添加无机盐作为对照。结果如图3c所示，添加氯化钙、氯化钾、硫酸镁时草欧菌素a的产量最高，分别为153.65mg/l、150.82mg/l、151.58mg/l，三者相差不大，而当添加硫酸锌、氯化钴、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铜集中无机盐时，菌株不能很好地生长，且未能检测到发酵液中的草欧菌素a。最终，选用氯化钙作为新的培养基原料。
[0044]
外源氨基酸的筛选：探究了20种常见的氨基酸对草欧菌素a产量的影响，添加后终浓度为10mm。结果如图3d所示，添加苏氨酸对草欧菌素a的产量提升最大，达到146.74mg/l，部分氨基酸对草欧菌素a的合成具有抑制效果。因此，选用苏氨酸作为新的培养基原料。
[0045]
最终确定新的培养基原料为：甘油、玉米浆、氯化钙、苏氨酸。
[0046]
根据新的培养基配方，以甘油10g/l，玉米浆15g/l，氯化钙1mm，苏氨酸10mm，ph 7.0作为本次试验用的基础培养基，考察不同含量的培养基原料，以及不同参数的发酵条件，如发酵时间、发酵温度、发酵初始ph、发酵种子液接种量对成团泛菌zju23中草欧菌素a产量的影响，结果如图4所示。
[0047]
根据得到的结果，确定了plackett-burman试验的水平，如表2所示。
[0048]
表2 plackett-burman试验设计中的因素与水平
[0049][0050]
(4)plackett-burman试验确定主效应因子
[0051]
plackett-burman试验是一种两水平的实验设计方法，用于从多个影响因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。在单因素试验的基础上，确定了plackett-burman实验的水平，使用minitab 17软件确定试验设计。选用n＝12的pb试验设计模块，对玉米浆(a)、甘油(b)、氯化钙(c)、苏氨酸(d)、发酵时间(e)、发酵温度(f)、初始ph(g)、菌株接种量(h)8个因素进行评价，筛选出对草欧菌素a产量影响较为显著的几个因素。试验设计结果件表3。数据分析结果见表4及图5。可以看出，玉米浆(a)、发酵温度(f)、初始ph(g)3个因素影响较为显著(p《0.05)，作为主效因素进行后续的响应面优化。
[0052]
表3 plackett-burman试验设计表及结果
[0053][0054]
表4 8个因子对草欧菌素a产量影响的方差分析
[0055]
[0056][0057]
(5)响应面试验设计：依据plackett-burman试验结果，选取玉米浆(a)、发酵温度(f)、初始ph(g)3个因素为自变量，以草欧菌素a产量为响应值，利用design-expert 12软件根据box-behnken原理进行响应面设计，优化成团泛菌zju23发酵工艺，提升草欧菌素a产量。以-1、0、1分别代表自变量的三个水平，每个组合重复试验3次，取其平均值作为草欧菌素a产量的结果，试验设计方案及结果分析见表5、表6。
[0058]
表5 box-behnken实验设计表及结果
[0059][0060][0061]
表6 box-behnken实验设计结果的方差分析
[0062][0063]
回归模型的建立及方差分析：每个组合重复试验3次，取其平均值作为草欧菌素a产量的结果。通过软件对试验数据进行回归拟合并对方程做显著性检验及方差分析，获得草欧菌素a产量对玉米浆(a)、发酵温度(f)和初始ph(g)的多元二次回归方程为：y＝170.9+2 8.4a-24.3b-12.5c-14ab-6.9ac+20bc-25a
2-26.3b
2-21.53c2，r2＝0.9830，表明该模型对试验拟合度较好，可用该模型对实验结果进行预测。试验结果表明：3个因素对zju23中草欧菌素a产量的影响大小依次为：初始ph》玉米浆》发酵温度；由检验回归方程系数显著性可知：a、b、c、a2、b2、c2为极其显著(p《0.01)，ab为显著(p《0.05)，其余均为不显著。
[0064]
响应面最优条件的确定与验证：图6直观地给出了各个因子交互作用的响应面分析图。从响应面中可以确定最佳因素的水平范围。通过对回归模型的分析，可以确定成团泛菌zju23发酵产草欧菌素a的最优条件为：玉米浆,14.9g/l；甘油,10g/l；氯化钙,1mm；苏氨酸,15mm；发酵时间,60h；发酵温度,20.3℃；初始ph,5.0；菌株接种量,1
×
108cfu，此时模型能够取得最大值，为204.5mg/l。
[0065]
实施例2
[0066]
为了检验该模型的有效性，按照上述最优发酵条件在摇瓶中进行重复试验，具体步骤如下：
[0067]
成团泛菌zju23种子液的获得：采用接种环接菌至种子培养基中，培养温度为30℃，15ml试管中装液量为5ml，摇床转速180rpm，培养时间为10h。本实施例中所用的种子培养基组成：胰蛋白胨，10g/l；酵母提取物，5g/l；氯化钠，10g/l，ph调至7.2。
[0068]
成团泛菌zju23发酵液的获得：使用250ml三角瓶进行发酵，将种子液接种至100ml发酵培养基中，接种量为1
×
108cfu；发酵温度为20℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为72h。发酵培养基组成为：玉米浆,14.9g/l；甘油,10g/l；氯化钙,1mm；苏氨酸,15mm；初始ph,5.0。
[0069]
发酵完成后，对发酵液进行离心收取上清。
[0070]
使用ta培养基为对照，ta培养基为以前报道的草欧菌素a的发酵培养基。该培养基包含：磷酸氢二钾，8g/l；硫酸铵，2g/l；二水合柠檬酸钠盐，0.5g/l；七水合硫酸镁，0.1g/l；葡萄糖，20g/l(单独灭菌)；三羟甲基氨基甲烷，24.2g/l，ph调至6.8。对应的发酵方法为：使用250ml三角瓶进行发酵，将种子液接种至100ml ta培养基中，接种量为1
×
108cfu；发酵温度为25℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为72h。发酵完成后对发酵液进行离心收取上清。
[0071]
最终获得草欧菌素a实际产量为211.1mg/l，与理论预测值相接近，表明该模型十分可靠，能够很好地预测实际发酵情况，对于今后的大规模发酵生产有一定指导意义。采用本发明发酵方法，草欧菌素a产量是初始发酵条件下的约6.4倍。
[0072]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，依据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。