一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用。


背景技术：

2.宫颈癌一直是威胁女性健康的“杀手”，在女性恶性肿瘤中，发病率仅次于乳腺癌，几乎所有(99.7％)的宫颈癌都是由于人乳头瘤病毒(hpv)持续感染所引起。hpv属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，是球形dna病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。宫颈癌的发生过程是由正常宫颈细胞感染高危型hpv病毒，然后从cin1到cin2到cin3，最后进展为宫颈浸润癌。在这个过程中，cin2后期和cin3，特定基因甲基化异常升高，因此，通过检测特定基因甲基化的异常变化，可以评估宫颈病变的进展风险。通过特定基因甲基化检测转化性病变(部分cin2与cin3)时，可知道癌症进展的风险，提示医生是否立即进行治疗介入或是保持观察追踪。
3.癌症基因检测已是世界趋势，早期诊断出癌症的风险与发生，提早介入与干预，能够大幅地提升癌症5年生存率与降低死亡率。全世界表观遗传学研究成为最先进癌症早期诊断的重要历程碑：肿瘤的特点之一是甲基化失衡，即癌变部位特定抑癌基因甲基化程度显著增高，表达下降甚至沉默，丧失抑癌功能，最终快速发展为癌症。因此特定基因甲基化状态可以被看做肿瘤发生与发展的重要指标。因此，基因甲基化检测是未来宫颈癌全分子检查的关键，评估在短期内进展为宫颈癌的风险。因此，急需寻找并开发一种高灵敏度、高特异性的检测宫颈癌的分子标志物甲基化检测试剂，为宫颈癌的早期诊断提供有力的帮助。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂。
5.本发明还提出一种含有上述检测试剂的试剂盒。
6.本发明还提出一种上述检测试剂、试剂盒的应用。
7.在本发明的第一方面，提出了一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂，所述检测试剂包括用于检测pax1基因甲基化的第一引物对和/或用于检测st6galnac5基因甲基化的第二引物对；
8.其中，所述第一引物对的核酸序列为序列如seq id no:1所示的正向引物和序列如seq id no:2所示的反向引物、序列如seq id no:4所示的正向引物和序列如seq id no:2所示的反向引物、或序列如seq id no:5所示的正向引物和序列如seq id no:6所示的反向引物；
9.所述第二引物对的核酸序列为序列如seq id no:8所示的正向引物和序列如seq id no:9所示的反向引物、或序列如seq id no:8所示的正向引物和序列如seq id no:11所
示的反向引物。
10.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂还包括核苷酸序列如seq id no:3、seq id no:7、和/或seq id no:10所示的荧光探针序列。
11.在本发明的一些实施方式中，所述seq id no:3所示的荧光探针序列为与如seq id no:1所示的正向引物和序列如seq id no:2所示的反向引物，或序列如seq id no:4所示的正向引物和序列如seq id no:2所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述seq id no:7所示的荧光探针序列为与如seq id no:5所示的正向引物和序列如seq id no:6所示的反向引物相匹配的荧光序列；所述seq id no:10所示的荧光探针序列为与如seq id no:8所示的正向引物和序列如seq id no:9所示的反向引物相匹配的荧光序列，或序列如seq id no:8所示的正向引物和序列如seq id no:11所示的反向引物相匹配的荧光序列。
12.在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团；所述荧光基团为vic、rox、fam、cy5、hex、tet、joe、ned或texasred；所述淬灭基团为tamra、bhq、mgb或dabcyl。
13.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂还包括内参引物对和内参探针，所述内参引物对的核苷酸序列分别如seq id no:12和seq id no:13所示，所述内参探针的核苷酸序列如seq id no:14所示。
14.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂用于检测pax1基因或st6galnac5基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使dna中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-mec基本上不受影响的试剂。
15.在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
16.在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐。
17.在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。。
18.在本发明的一些实施方式中，所述水为无菌无酶水。
19.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂针对的检测样本选自宫颈癌组织、血液、血清或血浆。
20.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。
21.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因或者pax1基因和/或st6galnac5基因的启动子区域。
22.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因的cg富集区域或非cg富集区域。
23.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因的cg富集区域。
24.在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂所针对pax1基因的检测区域为如seq id no:17、seq id no:19或seq id no:20所示的序列；所述检测试剂所针对st6galnac5基
因的检测区域为如seq id no:18或seq id no:21所示的序列。检测区域的选择会对肿瘤的检测效能产生影响，根据不同cg富集区域设计的引物对检测结果有明显的差异。
25.在本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂。
26.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr反应液，所述pcr反应液为taqman mμltiplex qpcr master mix。
27.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为siha细胞株、caski细胞株、me-180细胞株等(所述细胞株为经sanger测序验证在本发明检测的基因区域发生高度甲基化的细胞株)的gdna，所述阴性对照为hek293或c-33a细胞株等(经sanger测序验证在本发明检测的基因区域未发生甲基化或甲基化程度很低的细胞株)的gdna。
28.在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为me-180细胞株的gdna，所述阴性对照为hek293细胞株的gdna。
29.在本发明的第三方面提供了上述检测试剂或试剂盒的应用，所述应用为在制备宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品中的应用。
30.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品用于检测pax1和/或st6galnac5基因经转化试剂修饰后的序列；所述转化试剂是指使dna中未发生甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，同时使5-mec基本上不受影响的试剂。
31.在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
32.在本发明的一些实施方式中，所述转化试剂为重亚硫酸氢盐试剂。
33.在本发明的一些实施方式中，本发明实施例中的重亚硫酸盐转化包括但不限于使用商用试剂盒转化、采用自制或购买得到的重亚硫酸盐进行转化。
34.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品用于检测经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。
35.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因或者其启动子区域。
36.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因的cg富集区域或非cg富集区域。
37.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品所针对的检测区域为pax1基因和/或st6galnac5基因的cg富集区域。
38.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品所针对pax1基因的检测区域为如seq id no:17、seq id no:19或seq id no:20所示的序列；所述检测试剂所针对st6galnac5基因的检测区域为如seq id no:18或seq id no:21所示的序列。
39.在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌或宫颈癌癌前诊断产品的使用方法包括以下步骤：
40.s1、将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测
样品；
41.s2、利用上述检测试剂对步骤s1经修饰的待测样品进行pax1基因和/或st6galnac5基因甲基化情况检测。
42.在本发明的一些实施方式中，所述步骤s2中的检测采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行。
43.在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为：
44.92-97℃8-12min
45.92-97℃13-17s40-50cycles
46.56-64℃(收集荧光)0.5-1.5min40-50cycles
47.16-22℃0.5-1.5min。
48.在本发明的一些实施方式中，所述实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应的扩增程序为；
49.95℃10min
50.95℃15s45cycles
51.60℃(收集荧光)1min45cycles
52.20℃1min。
53.在本发明的一些实施方式中，当采用所述pax1基因进行甲基化情况检测，判断标准为当
△
ct≤9.5时为阳性，当
△
ct》9.5时为阴性。
54.在本发明的一些实施方式中，当采用所述st6galnac5基因进行甲基化情况检测，判断标准为当
△
ct≤10时为阳性，当
△
ct》10时为阴性。
55.在本发明的一些实施方式中，当采用所述pax1基因和st6galnac5基因进行甲基化情况检测，判断标准为当pax1基因检测的
△
ct≤8.5或当st6galnac5基因检测的
△
ct≤6.5时为阳性，当pax1基因检测的
△
ct＞8.5且st6galnac5基因检测的
△
ct＞6.5时为阴性。
56.根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案制备得到的用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂，扩增得到的目标序列短，扩增效率高；本发明提供的检测试剂对宫颈高级别病变和宫颈癌的检测敏感度高，特异性好，且可准确检出200ngdna背景下0.5％的甲基化比率，操作简单、快捷、低成本，适用于临床检测。
附图说明
57.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
58.图1为本发明实施例2中的pax1基因和内参基因引物扩增效率的检测结果图；
59.图2为本发明实施例2中的pax1基因和内参基因引物扩增效率一致性分析结果图；
60.图3为本发明实施例2中的st6galnac5基因和内参基因引物扩增效率的检测结果图；
61.图4为本发明实施例2中的st6galnac5基因和内参基因引物扩增效率一致性分析结果图；
62.图5为本发明实施例2中的pax1基因、st6galnac5基因和内参基因引物扩增效率的检测结果图；
63.图6为本发明实施例2中的pax1基因、st6galnac5基因和内参基因引物扩增效率一致性分析结果图。
具体实施方式
64.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
65.实施例1一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂
66.通过对癌症基因组图谱数据库(the cancer genome atlas，tcga)宫颈癌的甲基化数据和基因表达数据进行生物信息分析和挖掘，设置90％宫颈癌组织甲基化beta value＞0.5，正常组织甲基化beta value＜0.2做数据初筛，然后挑选宫颈癌组织和正常组织中差异大的位点，寻找在宫颈癌组织和正常组织中甲基化水平有显著差异的cpg位点，经过分析筛选，挑选得到多个差异显著的甲基化位点；采用亚硫酸盐处理后的sanger测序技术对宫颈癌细胞株me-180、siha以及15例宫颈癌阳性样本和30正常人群的样本进行验证这些甲基化位点的情况，发现经重亚硫酸盐转化后的pax1基因位于区域chr20:21686201-21686359的cpg位点和st6galnac5基因位于区域chr1:77332991-77333259在宫颈癌阳性细胞株或者样本中高度甲基化，但在正常人群的样本中，上述cpg位点未甲基化或少部分cpg位点低程度的甲基化。
67.pax1基因高度甲基化区域chr20:21686201-21686359的原始序列如下(5
’‑3’
)：
68.ggggaggggggcgctggggcgcagtgacgggaaccaatgagctgccaactcgcgcgtctccggcgtgactgccgagattgacgtggaggacacgtcaaattgattcccgcacgctgcagcctcccggtcagacgaatttctcccaatcggatgaagttc(seq id no:15)。
69.st6galnac5基因高度甲基化区域chr1:77332991-77333259的原始序列如下：
70.cgcggaccaagaagtgggtacactggctcggttaactctctctccccagaaatttcactactgaaaagattattatttgggggcggggaaggggatgtagaggtctttaggacccagcaggcggcggcaggcggcagttgtgtagatcgctgagagactacgagggtccggttcagttttaattctgtctctaatctctgcaacagccgcgcttcccgggtcccgcggctcccgcgcgcgatctgccgcggccggctgctgggcaaaaa(seq id no:16)。
71.1、检测区域的选择
72.由于同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，发明人经过反复的研究和比较后，筛选得到pax1基因高度甲基化区域chr20:21686201-21686359和st6galnac5基因高度甲基化区域chr1:77332991-77333259，再从pax1基因高度甲基化区域chr20:21686201-21686359筛选得到检测pax1基因甲基化最好的3个靶区域序列(区域1-3)，从st6galnac5基因高度甲基化区域chr1:77332991-77333259筛选得到检测st6galnac5基因甲基化最好的2个靶区域序列(区域4和区域5)，具体序列如表1所示：
73.表1
[0074][0075][0076]
2.引物探针序列的设计与选择
[0077]
针对上述两个基因区域经重亚硫酸盐处理后的序列作为模板，分析不同检测区域的扩增产物长度、退火温度、特异性等一系列参数，设计筛选得到针对区域1的正向引物r2f-mf1，反向引物r2f-mr1，探针序列r2f-mp1，设计筛选得到针对区域2的正向引物r2f-mf2，反向引物r2f-mr1，探针序列r2f-mp1，设计筛选得到针对区域3的正向引物r2r-mf1，反向引物r2r-mr1，探针序列r2r-mp1，设计筛选得到针对区域4的正向引物r7f-mf1，反向引物r7f-mr1，探针序列r7f-mp1，设计筛选得到针对区域5的正向引物r7f-mf1，反向引物r7f-mr2，探针序列r7f-mp1，以及针对内参基因actb设计得到的的正向引物bs-act-f，反向引物bs-act-r、探针bs-act-p，序列如表2所示。所设计的引物探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0078]
表2甲基化检测的引物、探针序列
[0079]
[0080]
[0081][0082]
针对表2中不同的引物探针组合，采用细胞株me-180、siha和c-33a(细胞株均购自中国上海中科院细胞库)以及1例正常人群宫颈脱落细胞(样本编号rd001，样本来自人和未来医检所)的gdna进行重亚硫酸氢盐处理后作为模板，以无菌水作为阴参(ntc)进行筛选测试，采用表1中针对不同区域设计得到的引物探针组合分别进行扩增，扩增体系为：1
×
taqman probe qpcr mix(购自菲鹏生物)12.5μl、靶标基因的引物探针(表1中不同区域设计得到的引物探针组合)的终浓度为0.2μm、待测的gdna20ng，补无菌水至总体积25μl。扩增程序为：95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min(收集荧光)，45cycles；20℃，1min。检测的具体结果如表3所示。
[0083]
表3不同的pax1基因组合和st6galnac5基因组合检测细胞株的ct值
[0084][0085]
注：检测结果为noct时，判为阴性。
[0086]
从表3中不同引物探针组合的检测结果分析，pax1组合2对阳性细胞株的敏感度更高，因此后续优选pax1组合2进行本发明的多重荧光试剂盒研究；同时，st6galnac5组合1对阳性细胞株的敏感度更高，因此后续优选st6galnac5组合1进行本发明的多重荧光试剂盒研究。其余组合在效果上虽未达到优选组合的效果，但也能对宫颈癌样本进行一定程度的区分，本技术领域的技术人员在本发明的基础上所作的等同替代或变换，均在本发明范围之内。
[0087]
实施例2多重荧光pcr检测体系的建立
[0088]
1、pax1基因甲基化检测的双重荧光pcr体系建立
[0089]
引物的扩增效率是pcr检测性能的重要指标，也是评估靶基因甲基化水平的重要参数，因此，对双重荧光pcr体系中靶基因pax1和内参基因actb的扩增效率进行分析，以pax1组合2为例。具体的操作是：在扩增体系(总体积为25μl)中，包含1
×
taqman probe qpcr mix(购自菲鹏生物)12.5μl、终浓度分别为0.2μm的靶标基因的引物探针(pax1组合2)和内参基因actb的引物探针，分别加入50ng、25ng、12.5ng、2.5ng、1.25ng的经重亚硫酸氢盐处理后的gdna模板量。扩增程序为：95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min(收集荧光)，
45cycles；20℃，1min，根据taqman探针的荧光标记选择对应的检测通道。qpcr扩增完毕后，分析pcr反应中pax1基因和actb基因的扩增效率。
[0090]
引物扩增效率的检测结果如图1所示，以模板量的log值作为横坐标，ct值作为纵坐标，分别计算内参基因actb和靶基因(pax1)的扩增斜率，通过扩增斜率计算各自的扩增效率，扩增效率e＝10-1/a
，a为扩增曲线的斜率，将扩增效率用百分率表示，即每个循环扩增模板的百分比，将扩增效率e转换成百分率为：效率％＝(e-1)
×
100％。从图1中可以看出，actb的扩增效率为101.11％，pax1的扩增效率为97.41％。两者的扩增效率均在90～110％之间，可进行下一步测试。
[0091]
对内参基因actb和靶基因pax1检测引物的扩增效率进行一致性分析，分析方法是分别计算目的基因不同检测模板量的
△
ct值(
△
ct＝ct
目的基因-ct
内参基因
)。然后，以检测模板量为横坐标，
△
ct值为纵坐标，绘制曲线且计算曲线斜率。引物扩增效率一致性分析结果如图2所示，从图中可以看出，曲线斜率为0.002，接近0，可确定该检测体系的组分和扩增条件可用于后续检测。
[0092]
2、st6galnac5基因甲基化检测双重pcr体系建立
[0093]
st6galnac5基因甲基化检测双重pcr体系建立的具体方法同pax1基因甲基化检测的双重荧光pcr体系一致，区别在于扩增体系中的靶基因检测引物探针组合为实施例1中的st6galnac5组合1，扩增效率的检测结果如图3所示，从图中可以看出，在该双重荧光pcr反应体系中，actb的扩增效率为99.67％，靶基因st6galnac5的引物扩增效率为92.49％。引物扩增效率一致性分析结果如图4所示，从图中可以看出，
△
ct的一致性较好，曲线斜率为0.006(接近0)，可确定该检测体系的组分和扩增条件可用于后续检测。
[0094]
3、pax1、st6galnac5双标志物甲基化检测三重荧光pcr体系的建立
[0095]
pax1、st6galnac5双标志物甲基化检测三重荧光pcr体系的建立的具体方法同pax1基因甲基化检测的双重荧光pcr体系一致，区别在于扩增体系中同时加入pax1和st6galnac5靶基因检测引物探针组合，分别为实施例1中优选的pax1组合2和st6galnac5组合1，扩增效率的检测结果如图5所示，从图中可以看出，在该双重荧光pcr反应体系中，actb的扩增效率为109.17％，靶基因st6galnac5的引物扩增效率为107.85％，靶基因st6galnac5的引物扩增效率为101.43％。引物扩增效率一致性分析结果如图6所示，从图中可以看出，各靶标与内参基因
△
ct的一致性较好，曲线斜率分别为0.005和0.001(接近0)，可确定该检测体系的组分和扩增条件可用于后续检测。
[0096]
实施例3
[0097]
1阳性和阴性参考品的筛选
[0098]
阳性参考品采用细胞株me-180和siha(均购自湖南丰晖生物)，其均经过qpcr和sanger测序验证，结果均表明这两个细胞株在pax1和st6galnac5基因的目标区域内存在高度甲基化情况，因此，后续可以选择me-180和siha作为多重荧光试剂盒的阳性参考品，本发明方案首选me-180作为后续试剂盒阳性参考品，定义me-180在pax1和st6galnac5基因的目标区域内甲基化水平为100％。
[0099]
阴性参考品的筛选：采用三重荧光定量pcr的方式先对细胞株gse-1、sv-huc-1、hek293(均购自湖南丰晖生物)进行初筛，三重荧光定量pcr体系和扩增程序同实施例2中的pax1、st6galnac5双标志物甲基化检测三重荧光pcr体系的建立一致，区别在于体系中的模
板分别为上述3个细胞株经重亚硫酸盐处理的gdna，qpcr模板投入量均为50ng，初筛结果见表4。
[0100]
表4三重荧光定量pcr对细胞株gse-1、sv-huc-1、hek293的检测结果
[0101][0102]
结果如表4所示，从表4的结果可以看出，优选细胞株hek293的靶区域pcr产物进行sanger测序验证，sanger验证结果与三重荧光pcr结果相符，在pax1和st6galnac5的靶区域内均无甲基化。因此，后续选择hek293作为pax1和st6galnac5靶区域的阴性参考品，定义hek293在两个靶区域甲基化为0％。
[0103]
2三个多重荧光pcr试剂盒的制备
[0104]
本发明在上述实施例的基础上，提供了三个用于宫颈高级别病变及宫颈癌筛查的多种荧光pcr试剂盒，三个多重荧光pcr试剂盒分别包括表5中的主要组分。
[0105]
表5三个多重荧光pcr试剂盒主要组分
[0106]
reagent盖好8联管并做好标记，涡旋震荡混匀，瞬时离心。
[0127]
(2)将8联管放入pcr仪中，pcr程序如表6所示。
[0128]
表6
[0129]
温度时间98℃10min64℃3h4℃hold
[0130]
(3)准备1.5ml离心管，加入600μl m-binding buffer和10μl磁珠悬液(使用前充分涡旋震荡混匀)。将步骤(2)反应好的样本从pcr仪上取出，并将管中液体按照编号转移至对应的1.5ml离心管中，涡旋混匀30s，室温静置5min。
[0131]
(4)瞬离，置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。
[0132]
(5)加入400μl m-wash buffer(使用前轻轻摇匀)，涡旋混匀30s，瞬离。置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。
[0133]
(6)加入200μl m-desulphontion buffer，涡旋混匀30s，涡旋混匀30s，室温放置15min(期间颠倒混匀)，瞬离，置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。
[0134]
(7)加入400μl m-wash buffer，涡旋混匀30s，瞬离。置于磁力架上吸附至澄清，弃上清。
[0135]
(8)重复步骤(7)一次，需要吸弃残液。
[0136]
(9)金属浴55℃孵育5min(开盖)，至干燥。
[0137]
(10)加入50μl m-elution buffer，悬浮磁珠后，金属浴55℃孵育4min(不开盖)，瞬离，置于磁力架上吸附至澄清，将上清转移至新的1.5ml离心管中，收集的上清即为bs-dna溶液，用于后续的pcr检测，若需长期保存，则置于-80℃。
[0138]
4 pcr检测
[0139]
本发明使用的荧光定量pcr仪器为宏石全自动医用pcr分析系统(slan-96s)，pcr扩增体系及程序如下：
[0140]
pcr扩增体系如表7所示。
[0141]
表7
[0142]
成分反应体积(μl)pcr反应液a12.5μlpcr反应液b/c/d7.5μlbs-dna模板5μl
[0143]
上机检测按照各荧光pcr以说明书进行操作，设置pcr程序。
[0144]
pcr反应程序如表8所示。
[0145]
表8
[0146][0147]
5结果判读
[0148]
阈值划定：fam、hex阈值均划定为0.12。
[0149]
结果判读(pax1：
△
ct＝fam ct-hex ct；st6galnac5：
△
ct＝rox ct-hex ct)如表9所示。
[0150]
表9
[0151][0152][0153]
6宫颈病变、宫颈癌样本和阴性样本在pax1基因和st6galnac5基因的甲基化检测分布状况
[0154]
使用上述方法和引物探针组检测宫颈病变、宫颈癌样本和阴性样本，结果如表10所示。结果显示：多重荧光pcr试剂盒1(即单靶标pax1)在93例阴道镜阴性样本中检出7例(特异性为86/93，约92.47％)，63例宫颈癌样本全部检出，54例hsil样本中检出36例，81例lsil样本中检出22例；多重荧光pcr试剂盒2(即单靶标st6galnac5)在93例阴道镜阴性样本中检出13例(特异性为80/93，约86.02％)，63例宫颈癌样本中检出58例，54例hsil样本中检出40例，81例lsil样本中检出30例；多重荧光pcr试剂盒3(即双靶标pax1和st6galnac5)在
93例阴道镜阴性样本中检出5例(特异性为88/93，约94.62％)，63例宫颈癌样本中检出63例，54例hsil样本中检出43例，81例lsil样本中检出24例。同时，pax1和st6galnac5基因的甲基化比例随着宫颈癌病程的加重而升高，单靶标pax1对宫颈癌的敏感度为100％，对hsil的敏感度为66.67％，lsil的敏感度为27.16％，对于阴性样本的特异性为92.47％；单靶标st6galnac5对宫颈癌的敏感度为92.06％，对hsil的敏感度为74.07％，对lsil的敏感度为37.04％，对阴性样本的特异性为86.02％；双靶标pax1和st6galnac5对宫颈癌的敏感度为100％，对hsil的敏感度为79.63％，对lsil的敏感度为29.63％，对阴性样本的特异性为94.62％。由此可见，双靶标pax1和st6galnac5的试剂盒更有利于癌前病变hsil的检测，试剂盒性能明显优于单靶标pax1和单靶标st6galnac5的试剂盒。
[0155]
表10宫颈病变及宫颈癌样本和阴性样本在不同试剂盒中的检测统计结果
[0156][0157][0158]
实施例5敏感度测试
[0159]
采用本发明实施例3中制备的试剂盒3对200ngdna背景下不同比例的甲基化率进行检测，评估本发明的试剂盒在200ngdna背景下检测的甲基化敏感度。
[0160]
本发明选择细胞株me-180(购自中国上海中科院细胞库)作为100％甲基化样本，细胞株hek293(购自湖南丰晖生物)作为0％甲基化样本。细胞株dna的提取详细步骤见实施例4的步骤2，提取的dna经qubit 2.0荧光定量仪(购自thermofisher scientific)测定dna浓度。将me-180和hek293先稀释成10ng/μl的溶液，再按照不同的比例进行倍比稀释成不同甲基化比率的参考品，具体甲基化比率参考品配制如表11所示。
[0161]
表11
[0162][0163][0164]
不同比例甲基化比率参考品dna重亚硫酸盐转化的步骤见实施例4的步骤3，dna投入量按照200ng dna投入。
[0165]
转化后的bs-dna作为模板，按照实施例3中的步骤4进行pcr检测。参考实施例4中的结果判读方法进行结果分析和判读，具体的检测结果如表12所示：
[0166]
表12不同甲基化比率参考品的检测ct值及判读
[0167][0168]
注：fam通道检测结果为noct时，表示
△
ct＞8.5，rox通道检测结果为noct时，表示
△
ct＞6.5，判为阴性。
[0169]
甲基化敏感度实验结果如表12所示，从表中可以看出，本发明试剂盒可准确检测出200ng dna背景下0.5％的甲基化比率。
[0170]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。