一种用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置与方法与流程

1.本发明涉及一种属于生物医学领域的用于肿瘤相关成纤维细胞提取及培养的工具组件与方法，具体地，涉及一种用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置与方法。


背景技术：

2.据《中国卫生和计划生育统计年鉴2019》所述，我国恶性肿瘤发病率整体呈现上升的态势，导致恶性肿瘤发病的因素有多种，主要包括老龄化率的提升、环境污染加重、抽烟熬夜等不良生活习惯、生活压力大等。随着手术技术日趋成熟、生物制剂研发增速及新治疗手段的不断出现，我国肿瘤的临床治疗水平已有长足进步。
3.恶性肿瘤的发生、发展是一个肿瘤细胞与其微环境相互作用、共同演进的动态过程。肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast,caf)是其中极其重要的元素。与正常的成纤维细胞相比，caf可分泌多种生长因子、细胞因子和细胞外基质等。这些因子对促进肿瘤的发生、增殖、肿瘤血管生成、侵袭、转移起着至关重要的作用。caf在肿瘤中独特的代谢方式，为肿瘤的进展提供了能量。此外，caf分泌的多种细胞因子、生长因子和趋化因子，可以对化疗药物产生耐药性从而促进肿瘤的进展。还有研究表明caf与大部分肿瘤的预后相关。
4.目前，传统的提取肿瘤相关成纤维细胞的方式为：
①
组织块干贴壁法；
②
差速消化法。上述两种方法都费时、费力、易污染，且对操作的技术人员有一定专业要求。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于肿瘤相关成纤维细胞提取及培养的工具组件与方法，采用肿瘤相关成纤维细胞生物学特性及自然重力对初代成纤维细胞进行分选，节约时间、减少人力成本、避免繁琐步骤引起的污染，且方便易操作，学习成本低廉。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，其中，所述的装置包括培养皿和设置在培养皿中的样品架，以及上覆盖和下覆盖；样品架上设有若干垂直向下的样品孔，每个样品孔内的底部分别设有一个样品柱。
7.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，其中，所述的装置中，样品架的上部在样品孔外设有搁置条，通过将样品架周围的搁置条卡置在培养皿的侧壁外沿上，使样品孔悬浮在培养皿中，而不沉入培养皿底部。
8.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，其中，所述的装置中，样品柱为梯形圆台状，位于样品孔的底端；样品柱通过若干纤维丝与所在的样品孔连接，将样品柱粘合固定在样品孔内的底部中央位置，样品柱的底部与样品孔的内侧孔壁之间留有空隙；样品柱的梯形圆台上表面和侧壁上均匀地喷涂了减少细胞黏附的涂层。
9.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，其中，所述的装置中，在样品孔的底部周围设有环形的样品孔磁条。
10.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，其中，所述的装置中，上覆盖
扣置在培养皿的顶部，将培养皿和样品孔覆盖；下覆盖设置在培养皿的底部，下覆盖内镶嵌有环形的下覆盖磁条，与样品孔磁条的尺寸对应且磁力相斥。
11.本发明还提供了将上述的装置用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其中，该方法包含：步骤1，取肿瘤组织块，冰上分离筋膜、血管和腐败组织，用手术刀将组织切片，放入离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床进行洗涤；步骤2，使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床进行洗涤；步骤3，再使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入红细胞裂解液，通过水平脱色摇床洗涤，去除组织内造成污染的红细胞；步骤4，使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床洗涤，共洗涤3次；步骤5，将洗涤完成的组织块以最大表面积向下的方式，放入样品架的样品孔内的样品柱上，并贴合样品柱的平台表面，再将样品架放入培养箱内无血清培养20分钟；步骤6，在培养皿内加入含有抗生素的完全培养基，再将步骤5中的装有组织块并进行无血清培养后的、设有样品孔的样品架置入培养皿内，通过增加或减少培养基，以保证完全培养基浸没样品柱上的组织；步骤7，将插入样品孔的培养皿，放置在下覆盖上并旋转调整角度，以保证样品孔因磁力相斥而悬浮在培养皿内，然后进行培养。
12.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其中，所述的方法中，洗涤液的用量为25mg组织块加入500μl洗涤液；红细胞裂解液的用量与洗涤液的用量相同。
13.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其中，所述的步骤1中，组织切片的大小为2mm
×
2mm
×
1mm的薄片。
14.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其中，所述的步骤1和2中的洗涤，都采用水平脱色摇床，以90rpm洗涤10分钟；步骤3中是采用水平脱色摇床，以90rpm洗涤15分钟；步骤4中则是采用水平脱色摇床，每次以90rpm洗涤5分钟，共洗涤3次。
15.上述的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其中，所述的步骤6中，完全培养基是采用dmem培养基，并按质量百分比计加入10％的胎牛血清。
16.本发明提供的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置与方法具有以下优点：
17.本发明通过结构设计改变，提高了肿瘤相关成纤维细胞的提取效率，具有基础研究以及临床药物应用前景。本发明建立了更加高效、便捷、省时、减少污染的肿瘤相关成纤维细胞培养与维持等关键技术环节的改进方法，包括多方面简化肿瘤相关成纤维细胞提取的操作步骤和方法，最终成功建立肿瘤相关成纤维细胞提取装置。
18.相比于现有技术，本发明的成功率明显提高，且操作更简便，对操作人员的技术要求则降低，缩短整体提取时间，为肿瘤相关成纤维细胞在临床和科研中研究及应用开拓了可靠的技术应用，节约了时间成本及人员成本，同时增加了临床、实验动物样本的使用效率。
附图说明
19.图1为本发明的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置的结构示意图。
20.图2为本发明的装置中样品孔的示意图。
21.图3为本发明的装置中样品柱与涂层的示意图。
22.图4为本发明的装置的使用过程示意图。
23.图5为本发明的装置中样品孔磁条和下覆盖磁条的作用示意图。
24.其中：1、上覆盖；2、样品架；3、样品孔；4、搁置条；5、样品柱；6、样品孔磁条；7、培养皿；8、下覆盖；9、下覆盖磁条；10、涂层；11、纤维丝。
具体实施方式
25.以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
26.本发明提供的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，该装置包括培养皿7和设置在培养皿7中的样品架2，以及上覆盖1和下覆盖8；样品架2上设有若干垂直向下的样品孔3，每个样品孔3内的底部分别设有一个样品柱5。
27.优选地，样品架2的上部在样品孔3外设有一圈搁置条4，通过将样品架2周围的搁置条4卡置在培养皿7的侧壁外沿上，使样品孔3悬浮在培养皿7中，而不沉入培养皿7底部。样品孔3在样品架2上可以沿环形均匀设置。
28.样品柱5为截面是等腰梯形的圆台状，位于样品孔3的底端；样品柱5通过若干纤维丝11与所在的样品孔3连接，将样品柱5粘合固定在样品孔3内的底部中央位置，样品柱5的底部与样品孔3的内侧孔壁之间留有足够大的空隙；优选地采用3根纤维丝11。
29.样品柱5的梯形圆台上表面和侧壁上均匀地喷涂了减少细胞黏附的涂层10。
30.在样品柱5上放置组织块，细胞游离后顺着样品柱5的梯形圆台表面，从样品柱5与样品孔3底部的空隙，能够顺利滑入下方的培养皿7内。
31.在样品孔3的底部周围，设有一圈围绕样品架2的环形的样品孔磁条6。
32.上覆盖1扣置在培养皿7的顶部，将培养皿7和样品孔3覆盖；下覆盖8设置在培养皿7的底部，下覆盖8内镶嵌有环形的下覆盖磁条9，与样品孔磁条6的尺寸、位置相对应且磁力相斥。
33.本发明还提供了将该装置用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，其包含：步骤1，取肿瘤组织块，冰上分离筋膜、血管和腐败组织，用手术刀将组织切片，放入离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床进行洗涤；步骤2，使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床进行洗涤；步骤3，再使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入红细胞裂解液，通过水平脱色摇床洗涤，去除组织内造成污染的红细胞；步骤4，使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液，通过水平脱色摇床洗涤，共洗涤3次；步骤5，将洗涤完成的组织块以最大表面积向下的方式，放入样品架2的样品孔3内的样品柱5上，并贴合样品柱5的平台表面，再将样品架2放入培养箱内无血清培养20分钟；步骤6，在培养皿7内加入含有抗生素的完全培养基，再将步骤5中的装有组织块并进行无血清培养后的、设有样品孔3的样品架2置入培养皿7内，通过增加或减少培养基，以保证完全培养基正好浸没样品柱5上的组织；步骤7，将插入样品孔3的培养皿7，放置在下覆盖8上并旋转调整角度，以保证样品孔3因磁力相斥而悬浮在培养皿7内，然后进行培养。
34.优选地，该方法中洗涤液的用量为25mg组织块加入500μl洗涤液；红细胞裂解液的用量与洗涤液的用量相同。
35.红细胞裂解液(red blood cell lysis buffer，或称ack lysis buffer)采用现有的配方。红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用裂解液裂解红细胞，它
既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。
36.洗涤液可以采用pbs(磷酸缓冲盐溶液)。抗生素可以采用按质量百分比计为1％的青霉素/链霉素。
37.步骤1中，组织切片的大小为2mm
×
2mm
×
1mm的薄片。
38.步骤1和2中的洗涤，都采用水平脱色摇床，以90rpm洗涤10分钟；步骤3中是采用水平脱色摇床，以90rpm洗涤15分钟；步骤4中则是采用水平脱色摇床，每次以90rpm洗涤5分钟，共洗涤3次。
39.步骤6中，完全培养基是采用dmem培养基，并按质量百分比计加入10％的胎牛血清。
40.dmem培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在mem培养基的基础上研制的。dmem是dulbecco's modified eagle medium的缩写，与mem比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/l)和低糖型(低于1000mg/l)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
41.胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)是一种取自牛胚胎的血清,常用于配置动物细胞的培养基。
42.下面结合实施例对本发明提供的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置与方法做更进一步描述。
43.需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
44.除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
45.实施例1
46.本实施例提供的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置，是一种采用上覆盖1、样品架2、样品孔3、搁置条4、样品柱5、样品孔磁条6、培养皿7、下覆盖8以及下覆盖磁条9等结构组成的新型培养系统。参见图1所示。
47.上覆盖1的作用是避免空气中微生物对培养细胞的污染，同时起到调节组织块在培养基中的高度及浸入培养基的过程。
48.培养皿7是放置培养基及收集游离肿瘤相关成纤维细胞的组件，因肿瘤相关成纤维细胞的贴附能力很强，所以培养皿7的底部添加低吸附材料，方便肿瘤相关成纤维细胞的后续处理，如消化、收集等。培养皿7内也可以事先放置琼脂糖、水凝胶等人工基质用作3d立体培养。
49.样品架2上在样品孔3外设有搁置条4，可以卡住培养皿7的外沿，防止样品孔3沉入培养皿7底部，从而影响肿瘤相关成纤维细胞的游离。
50.下覆盖8内镶嵌下覆盖磁条9，与样品孔磁条6磁力相斥，从而进一步保证样品孔3不沉入培养皿7内。
51.样品孔3用于放置不同组织块、在肿瘤相关成纤维细胞的提取过程中，组织块的大小对其游离的时间和数量至关重要。
52.样品柱5位于样品孔3底端，为圆形等腰梯台状(上表面的圆形直径小于下表面的圆形直径)。样品柱5与样品孔3之间由3条纤维丝11固定，可以支撑组织块不与培养基完全
接触，这是本装置中重要的组成本分，也是顺利提取的关键。
53.样品孔3内与样品柱5的连接方式如图2所示，为3根纤维丝11粘合固定样品柱5于样品孔3底部中央位置。
54.样品柱5的结构及涂层10布局如图3所示，其梯形的上表面和侧壁表面通过喷涂超低黏附涂层10，从而减少细胞黏附，从而使肿瘤相关成纤维细胞游离后可顺利滑入下层培养皿7内。样品柱5的使用过程参见图4所示。
55.样品孔磁条6及下覆盖磁条9结构为环形，镶嵌于样品孔3或下覆盖8内，通过磁铁同极相斥的原理保持组织块进入完全培养基的深度，同时保证了肿瘤相关成纤维细胞在培养皿7内的生长空间。
56.样品孔磁条6与下覆盖磁条9磁力相斥，从而保证样品孔3不沉入培养皿7内。参见图5所示。
57.实施例2
58.本实施例提供了将实施例1的装置用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的方法，过程如下。
59.a)取肿瘤组织块，冰上分离筋膜、血管和腐败组织，用手术刀将组织切片，大小为2mm
×
2mm
×
1mm的薄片，放入离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液内，水平脱色摇床，90rpm洗涤10分钟；洗涤液的加入比例以25mg组织块加入500μl洗涤液来进行。
60.b)使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液内，水平脱色摇床，90rpm洗涤10分钟；
61.c)使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入红细胞裂解液(用量与洗涤液相同)，水平脱色摇床，90rpm洗涤15分钟以去除组织内可能造成污染的红细胞；
62.d)使用移液器吸取组织块，转入新的离心管内，加入含抗生素且预冷的洗涤液内，水平脱色摇床，90rpm洗涤5分钟，共洗涤3次；
63.e)将洗涤完成的组织块最大表面积向下放入样品孔3内的样品柱5上，尽量贴合样品柱5平台表面，放入培养箱内无血清培养20分钟；
64.f)在培养皿7内加入含有抗生素的完全培养基(dmem+10％fbs)，将样品孔3置入培养皿7内，并增加或减少培养基，以保证完全培养基正好浸没组织；
65.g)将插入样品孔3的培养皿7，置于下覆盖8上，并旋转调整角度，以保证样品孔3因磁力相斥而悬浮在培养皿7内。
66.实施例3
67.以llc经尾静脉注射复制的llc肺转移小鼠模型为例，操作过程如下。
68.(1).注射2％水合氯醛麻醉小鼠，剖开胸腔后，使用预装预冷pbs的注射器扎入小鼠右心房(心尖位置)，注入pbs约1ml后，剪去小鼠左心耳，继续注入pbs至流出的血液逐渐变澄清。
69.(2).小心游离小鼠肺组织，放入遇冷的dmem培养基中，移入超净台内。
70.(3).用眼科剪、眼科镊小心分离小鼠血管、筋膜、肺组织表面粘液，包膜等，在肿瘤边提取1mm
×
1mm的癌旁组织。进行洗涤。
71.(4).将洗涤完成的组织块，放入样品孔3内，将上覆盖1盖上，放入培养箱静置3h，带组织表面水分蒸发，进入下一步。
72.(5).在培养皿7内加入含三抗的完全培养基，使用上覆盖1将样品孔3压入完全培养基液面以下，根据组织块大小调整压入深度，一般组织块沉入完全培养基1mm便可停止，此时组织块会高出培养基液面，这样做的目的是诱导肿瘤相关成纤维细胞移动至含有完全培养基的下层。
73.(6).正常细胞培养2d后，倒置显微镜下观察，如肿瘤相关成纤维细胞已经贴满培养皿7底部，则弃去样品孔3及样品孔3内的组织块，更换新鲜培养基，
74.(7).继续正常细胞培养2d后，使用胰蛋白酶消化、收集细胞。
75.本发明提供的用于肿瘤相关成纤维细胞提取和培养的装置与方法，采用肿瘤相关成纤维细胞生物学特性及自然重力对初代成纤维细胞进行分选，能够简单、高效提取肿瘤相关成纤维细胞，从而达到节约时间、减少人力成本、避免繁琐步骤引起的污染的效果，且方便易操作，学习成本低廉。
76.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。