一种猪塞内卡病毒VP2结构蛋白及其间接ELISA抗体检测试剂盒的制作方法

本发明涉及，具体涉及一种猪塞内卡病毒vp2结构蛋白及其间接elisa抗体检测试剂盒。

背景技术：

1、塞内卡病毒病是由a型塞内卡病毒(seneca virus a,sva)引起的一种外来高度接触性传染病，近年来我国多个省份都已报告了sva疫情，sva已经对我国养殖业健康发展产生了严重隐患。sva主要引起猪只口鼻和蹄部的水疱性症状，临床上与其他水疱性疾病难以区分，仔猪感染可导致急性死亡，尤其是4日龄以内的仔猪死亡率可高达70％，而国内市场尚无sva商品化疫苗，因此加强sva流行病学监测和生物防控显得尤为重要。目前可以通过病毒分离、核酸检测、血清学检测方法进行诊断，血清学检测方法在临床诊断中应用广泛，其中elisa检测方法操作简便，成本低廉，可以快速对大量临床样品进行检测，常被作为临床首选的诊断方法。在检测血清抗体的elisa方法中，灭活病毒和单体蛋白常被用作包被抗原，使用完整的病毒颗粒作为包被抗原可能会带来安全风险，因此，一种既安全又具有高度免疫原性的重组蛋白作为诊断抗原对新诊断技术的发展至关重要。

2、此外，sva感染后的临床表现在临床上与其他水疱性病毒引起的疾病，包括fmdv、vsv、vesv和svdv非常相似，较难区分。而口蹄疫已被世界动物卫生组织(worldorganization for animal health,oie)列入法定传染病名单，对于口蹄疫阴性的国家来说，发现口蹄疫病例将产生严重的经济后果，包括生产损失、贸易限制和恢复无口蹄疫状态的成本高昂。因此建立快速准确、敏感高效的检测方法对sva感染进行鉴别诊断，迅速采取防疫措施控制疫病进一步流行传播至关重要。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种猪塞内卡病毒vp2结构蛋白。

2、本发明另一目的提供了一种具有高特异性、高敏感性、高准确度、重复性能良好、操作简单的塞内卡病毒间接elisa抗体检测试剂盒，以实现对猪塞内卡病毒感染高效、便捷的检测。

3、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、本发明一方面提供了，一种塞内卡病毒vp2蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明中编码塞内卡病毒vp2蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明另一方面提供了，一种间接elisa抗体检测试剂盒，包括包含seq id no.1所示的塞内卡病毒vp2蛋白的包被抗原，酶标板、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、sva阳性血清、阴性血清、hrp标记羊抗兔igg、酶标二抗、底物显色液、终止液。

7、本发明的一实施例中，所述洗涤液为pbst洗涤液；所述稀释液与封闭液均采用bas封闭液；所述底物显色液为tmb显色液；所述终止液为1mol/l的硫酸溶液。

8、本发明的一实施例中，所述hrp标记羊抗兔igg通过封闭液按1:10000比例稀释。

9、本发明的一实施例中，所述包被抗原通过包被液调整浓度为4μg/ml。

10、本发明的一实施例中，所述包被抗原按照以下方法制备：通过基因合成法得到塞内卡病毒vp2蛋白基因；利用合成的特异性引物对塞内卡病毒vp2蛋白基因进行扩增，并在其目的基因两端添加酶切点；扩增产物进行pcr电泳，回收产物；将扩增的目的基因片段与pet32a(+)载体使用ecor i和hind iii进行双酶切；回收的载体片段pet32a(+)和目的基因片段，并通过连接酶对回收片段进行连接；将连接产物转化至e.coli dh5α感受态细胞；使用质粒小提试剂盒提取重组质粒；iptg诱导后表达的目的蛋白采用sds-page电泳鉴定与western-blot鉴定；透析法分离纯化得到目的蛋白。

11、本发明的一实施例中，所述特异性引物包括序列表seq id no.2和seq id no.3的碱基序列。

12、本发明的一实施例中，iptg诱导时，采用0.6mm的iptg诱导剂，并将其置于30℃的环境温度中进行诱导表达，控制诱导时间为3h。

13、本发明的有益效果体现在：

14、本发明成功将vp2基因片段连入了pet32a(+)表达载体，构建了重组质粒pet32a(+)-sva-vp2；并通过iptg成功诱导了(sva)塞内卡病毒vp2蛋白的原核表达，且vp2蛋白主要以包涵体形式表达，经溶解复性后重组蛋白具有良好的免疫原性；且本发明基于表达的蛋白作为包被抗原制作了一种用于便捷检测的elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒具备高特异性、高敏感性、高准确度、重复性能良好、操作简单等功能，能够精准的鉴别诊断出猪塞内开病毒的微量感染；适于早期对于猪塞内卡病毒隐性感染时期的监测和干预。

技术特征：

1.一种塞内卡病毒vp2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.编码权利要求1所述的塞内卡病毒vp2蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

3.一种间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，包括包含权利要求1所述的塞内卡病毒vp2蛋白的包被抗原，酶标板、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、sva阳性血清、阴性血清、hrp标记羊抗兔igg、酶标二抗、底物显色液、终止液。

4.根据权利要求2所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为pbst洗涤液；所述稀释液与封闭液均采用bas封闭液；所述底物显色液为tmb显色液；所述终止液为1mol/l的硫酸溶液。

5.根据权利要求2所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述hrp标记羊抗兔igg通过封闭液按1:10000比例稀释。

6.根据权利要求2所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原通过包被液调整浓度为4μg/ml。

7.根据权利要求2所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原按照以下方法制备：

8.根据权利要求7所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物包括序列表seq id no.3和seq id no.4的碱基序列。

9.根据权利要求7所述间接elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，iptg诱导时，采用0.6mm的iptg诱导剂，并将其置于30℃的环境温度中进行诱导表达，控制诱导时间为3h。

技术总结
本发明公开了一种猪塞内卡病毒VP2结构蛋白及其间接ELISA抗体检测试剂盒，塞内卡病毒VP2结构蛋白的所述其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了间接ELISA抗体检测试剂盒，包括包含权利要求1所述的塞内卡病毒VP2蛋白的预报被板、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、SVA阳性血清、阴性血清、HRP标记羊抗兔IgG、酶标二抗、底物显色液、终止液；该试剂盒具备高特异性、高敏感性、高准确度、重复性能良好、操作简单等特性。

技术研发人员：刘骁
受保护的技术使用者：刘骁
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12