一种抗降钙素原的Fab抗体及其制备方法与应用与流程

本发明属于抗体领域，具体涉及一种抗降钙素原的fab抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、降钙素原(procalcitonin，pct)是一种无激素活性的糖蛋白，为降钙素(calcitonin，ct)的前体，临床上pct作为一个高灵敏度和特异性的指标用于严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、系统炎性反应综合症(sirs)、多器官功能衰竭综合症(mds)等方面的诊断。一般情况下pct在人体血液中的含量很低，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，在内毒素和炎性细胞因子的刺激下，pct在血浆中的水平升高，而在非感染性炎症状态、局部有限的细菌感染、轻微的感染或者慢性炎症时，pct水平一般不会升高。因此pct可以作为一个指标不仅可以用来诊断早期细菌性和非细菌性感染和炎症，同时对有高感染风险或重症监护的患者的细菌感染或脓毒症的诊断，严重炎症性疾病的预后评估及治疗监测等均有重要参考价值。

2、目前常用的降钙素原测定方法有荧光免疫层析法、elisa法、化学发光免疫分析法免疫比浊法等。检测样本通常为人体全血、血清或血浆样本，检测过程中常因检测方法、样本处理、试剂组分等因素的影响，比如包被抗体的特异性差，样本中干扰物质的非特异性结合，最终检测结果出现假阳性或者背景过高等情况。为降低干扰，通常需要耗费大量时间和精力来筛选特异性高和抗干扰能力强的抗体；或者在检测前对检测样本和抗体原料进行预处理，在进行大规模的临床检验时，样本的预处理环节会增加试剂的消耗，增加工作量，进而增加检测时间，不利于快速诊断。

3、检测方法中常用的抗体igg在木瓜蛋白酶的作用下可以被降解为两个抗原结合片段(fab片段)及一个可结晶片段(fc片段)。fab的构成包括轻链可变区(vl)、轻链恒定区(cl)、重链可变区(vh)和第一个重链恒定区(ch1)。fc段决定抗体的效应功能，可以和巨噬细胞、nk细胞等细胞表面的fc受体(如fcrn)，以及血清中的补体结合。在临床检测中，fc段还可以与人抗鼠抗体(hamas)、类风湿因子(rf)和葡萄球菌a蛋白(spa)等干扰物质非特异性结合，影响抗体检测的特异性和准确度。而fab片段由于同时包含抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备了原来全抗体一样的抗体-抗原亲和力，而且其分子体积更小，组织穿透力更强；由于不含fc区域，减少与fc受体等干扰物的非特异性结合，在临床诊断上具有巨大的作用。

4、fab抗体可以用木瓜蛋白酶降解全单抗后纯化得到，该方法快速简单，但是所需要的单抗原料成本较高，同时经过酶降解和纯化等工序后得到的fab抗体可能会损失一定的免疫反应性。同时fab抗体由于不包含fc端，所以不需要翻译后修饰和糖基化，不仅可以在哺乳动物系统中表达，也可以在原核系统中表达。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点，但抗体表达量较低，容易形成包涵体，复性后活性难保证。而在哺乳动物细胞中表达可以正确折叠，更接近天然fab结构，活性也更高，表达量也能满足需求。目前常用的fab纯化方法主要有离子交换层析，疏水层析等，但都不能同时兼顾抗体回收率，抗体纯度，大规模生产，纯化时间，成本等问题，因此有一定的局限性。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗降钙素原的fab抗体。

2、本发明还提出一种编码上述抗体的核酸分子。

3、本发明还提出含有上述核苷酸序列的表达载体和转基因细胞系。

4、本发明还提出含有上述fab抗体、核酸分子或表达载体或转基因细胞系的检测试剂盒。

5、本发明还提出一种上述fab抗体的生产方法。

6、本发明还提出一种上述fab抗体、核酸分子或表达载体或转基因细胞系的应用。

7、在本发明的一个方面，提出了一种抗降钙素原的fab抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3，其中，cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seq idno.3所示；所述轻链的轻链可变区中具有3个互补决定区cdr1’、cdr2’和cdr3’，其中，cdr1’的氨基酸序列如seq id no.4所示，cdr2’的氨基酸序列如seq id no.5所示，cdr3’的氨基酸序列如seq id no.6所示。

8、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq idno.7所示。

9、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno.8所示。

10、在本发明的一些实施方式中，所述重链的重链恒定区的氨基酸序列如seq idno.9所示。

11、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如seq idno.10所示。

12、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的重链的氨基酸序列如seq id no.11所示。

13、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no.12所示。

14、在本发明的一些实施方式中，所述重链的c端还融合有两段标签序列。

15、在本发明的一些实施方式中，所述标签序列包括his、ha、flag和twin-strep。

16、在本发明的一些实施方式中，所述标签序列间通过连接肽进行连接。

17、在本发明的一些实施方式中，所述连接肽为[ggggs]n，其中，n为1-3的整数。

18、在本发明的一些实施方式中，所述连接肽为[ggggs]。

19、在本发明的第二方面，提出了编码上述抗体的核酸分子。

20、在本发明的一些实施方式中，所述编码所述抗体的重链可变区的核苷酸序列如seq id no.13所示，编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.14所示。

21、在本发明的一些实施方式中，所述编码所述抗体的重链恒定区的核苷酸序列如seq id no.15所示，编码所述抗体的轻链恒定区的核苷酸序列如seq id no.16所示。

22、在本发明的一些实施方式中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.17所示，编码所述抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.18所示。

23、在本发明的第三方面，提出了一种包括上述核酸分子、表达盒、表达载体或转基因细胞系。

24、在本发明的一些实施方式中，所述转基因细胞系包括大肠杆菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞的转基因细胞系。

25、在本发明的第四方面，提出了一种检测试剂盒，包括上述fab抗体、核酸分子或表达载体或转基因细胞系。

26、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为igg单抗。

27、在本发明的一些实施方式中，所述igg单抗包括鼠源或人源pct igg单抗。

28、在本发明的一些实施方式中，所述igg单抗为杂交瘤细胞株migg-6a2所产生的抗体，所述杂交瘤细胞株migg-6a2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2017143。

29、在本发明的第五方面，提出了一种上述fab抗体的生产方法，包括培养上述的转基因细胞系表达抗降钙素原fab抗体的步骤。

30、在本发明的一些实施方式中，所述转基因细胞系为真核细胞。真核表达的fab抗体比原核表达的fab抗体灵敏度更高。

31、在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括纯化的步骤，所述纯化的步骤是将转基因细胞系表达抗降钙素原fab抗体过滤后，在所述抗体的重链的c端添加两段标签序列，所述标签序列间通过连接肽进行连接，得到融合抗体，将所述融合抗体分别过ni-nta亲和层析和strep-tactin亲和层析，得到纯化后的抗降钙素原fab抗体。本发明运用ni-nta和strep-tactin双标签两步亲和层析进行纯化，可以获得高回收率和高纯度的fab抗体，整个纯化过程操作简便，产出高，纯化时间短，适用于大规模生产。

32、在本发明的一些实施方式中，所述标签序列包括his、ha、flag和strep。

33、在本发明的一些实施方式中，所述标签序列为his和strep。

34、在本发明的一些实施方式中，所述连接肽包括[ggggs]n，其中，n为1-3的整数。

35、在本发明的一些实施方式中，所述连接肽为[ggggs]。

36、在本发明的一些实施方式中，所述融合抗体的连接方式包括fab抗体-his-strep、fab抗体-连接肽-his-strep、fab抗体-his-连接肽-strep、fab抗体-连接肽-his-连接肽-strep。

37、在本发明的第六方面，提出了上述抗降钙素原的fab抗体、编码上述抗体的核酸分子、上述核酸分子表达盒、表达载体或转基因细胞系、检测试剂盒的应用，所述应用在免疫测定方法中的应用。

38、在本发明的一些实施方式中，所述免疫测定方法包括流式细胞技术、elisa免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法和免疫组化染色测定法。

39、在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备降钙素原检测试剂中的应用。

40、根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案提供的抗降钙素原的fab抗体为全人源基因工程抗体，可以有效用于检测降钙素原，同时可以作为标记抗体与其他鼠pct igg单抗组成配对抗体用于临床检测中，具有特异性强，灵敏度高，成本低，抗干扰能力强等特点。本发明方案得到的抗体制备简单，高效，为elisa、化学发光、荧光免疫层析等诊断方法提供了重要的特异性原材料，为临床诊断试剂盒的开发打下良好的基础。