马铃薯StICE1基因及其在提高植物抗逆性中的应用

马铃薯stice1基因及其在提高植物抗逆性中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种从马铃薯中克隆得到的新基因及其应用，特别涉及从马铃薯中克隆得到的stice1基因及其在提高植物抗逆性中的应用。本发明属于生物技术领域。


背景技术：

2.马铃薯是全球第四大重要粮食作物，仅次于小麦、玉米与水稻，其具有生长周期短、适应性强、产量高，块茎生长没有限制等生产优势，具有很大的增产潜力，对粮食增产、维护粮食安全方面发挥重大作用。低温胁迫是限制马铃薯生产区域和产量的重要原因，目前生产上缺乏有效的选择标准和育种途径，使得马铃薯耐冻性优异新品种改良的进展趋于缓慢。
3.目前马铃薯生产上主要应用为四倍体马铃薯，因其基因组庞大，导致研究滞后，基因克隆进展远远落后于水稻、玉米等主要作物。我国马铃薯产区主要分布在陕、甘、宁、蒙、晋等西北及川、贵、云、渝等西南高纬度、高海拔区域，其种植面积全国的65％左右。挖掘和利用抗寒冷优良基因对于马铃薯种质资源遗传改良有着重要的理论意义和应用价值。我国现阶段马铃薯新品种选育还是以传统杂交育种为主，像分子标记育种、转基因育种、分子设计育种等分子育种手段虽取得了一定的进展，但相对于世界马铃薯育种水平还有不足，严重限制了马铃薯遗传育种的研究速度。
4.马铃薯生长极易受到低温胁迫影响。当温度低于5℃-7℃时，马铃薯植株就会停止生长；低于2℃时，马铃薯块茎上的芽眼就会受到损伤，进而导致无法萌发；在-0.5℃至-0.8℃时幼苗细胞膜受到损伤，叶片出现萎蔫；在-2℃时发生冻害，细胞内出现结晶，细胞无法存活，植株死亡，成株在-4℃时整株能够死亡。由此可见，寒冷严重影响马铃薯的经济效益和产业发展规模。探明马铃薯的抗寒机制，选育马铃薯优异抗寒种质材料和品种在农业生产上具有巨大的应用价值和意义。
5.本发明通过克隆马铃薯中拟南芥atice1同源基因stice1，构建基因过表达载体以及敲除突变体，通过农杆菌介导的方法侵染转化四倍体马铃薯以及二倍体马铃薯，经过组培筛选转基因阳性植株。研究预期对转化获得的基因编辑阳性材料进行低温条件处理下的表型实验：通过测定突变体与对照植株形态学、细胞生物学、生理生化、分子生物学等指标的差异表现，确定stice1基因在响应逆境胁迫过程中的生理功能；通过芯片、测序等技术检测stice1所调节的下游靶基因表达情况，并通过qrt-pcr实验进行验证。
6.结果表明，stice1在冷胁迫、盐胁迫信号级联反应过程中起至关重要的作用。创制马铃薯stice1基因过表达、基因编辑敲除阳性株系是对分子辅助育种筛选优异抗逆马铃薯新品种的一个重要手段。本发明的提出为马铃薯抵御非生物逆境胁迫的基础研究以及开拓马铃薯在高寒冷凉生产应用范围提供了理论依据以及技术手段。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一在于提供一种从马铃薯中克隆得到的新基因stice1；
8.本发明的目的之二在于提供所述的新基因stice1在提高植物抗逆性中的应用。
9.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
10.本发明发明人通过前期冷胁迫处理马铃薯四倍体品种底西芮材料进行rna-seq分析，获得一些表达差异明显的基因并进行克隆。其中成功获得马铃薯stice1基因序列并与数据库比对一致无突变。构建马铃薯stice1基因过表达载体，利用农杆菌介导马铃薯愈伤组织转化体系，创制其过表达阳性植株。对筛选出的阳性植株进行分子检测，并以底西芮作为野生型对照，观测它们在4℃冷胁迫和盐胁迫处理下的生长状态及农艺性状。结果表明，马铃薯stice1基因过表达阳性植株相对于野生型在冷胁迫或盐胁迫环境下呈现较强的抵御能力。
11.在上述研究的基础上，本发明提出了一种从马铃薯中克隆得到的基因，命名为stice1，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.含有所述的基因的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
13.进一步的，本发明还提出了所述的基因、所述的表达载体或所述的宿主细胞在提高植物抗逆性中的应用。
14.其中，优选的，所述的抗逆性包括抗冷胁迫以及抗盐胁迫。
15.其中，优选的，所述的植物为马铃薯。
16.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
17.马铃薯stice1基因是转录因子家族bhlh家族中的一个成员，在马铃薯抵御非生物逆境胁迫的过程以及植株生长发育过程中起重要作用。对其进行功能研究，证明stice1在冷胁迫、盐胁迫中起至关重要的作用。创制马铃薯stice1基因过表达阳性株系是对分子辅助育种筛选优异抗逆马铃薯新品种的一个重要手段。本发明的开展为马铃薯抵御非生物逆境胁迫的基础研究以及开拓马铃薯在高寒冷凉生产应用范围提供了理论依据以及可行性方案。对马铃薯stice1基因进行深入研究并利用其功能在抗寒新品种分子育种中，期望能够得到优异种质资源。
附图说明
18.图1为马铃薯stice1基因克隆电泳图；
19.图2为pmdc85载体图；
20.图3为底西芮农杆菌介导愈伤组织诱导转化体系；
21.图4为马铃薯stice1过表达阳性植株的获得与鉴定；
22.图5为马铃薯stice1过表达阳性植株4℃生长表型；
23.图6为马铃薯stice1过表达阳性植株(oe2、oe8、oe16)与野生型des4℃处理生长差异比较；
24.图7为马铃薯stice1过表达阳性植株(oe2、oe8、oe16)与野生型des盐处理生长表型；
25.图8为马铃薯stice1过表达阳性植株(oe2、oe8、oe16)与野生型des盐胁迫处理生长差异比较。
具体实施方式
26.本发明将通过以下实施例作进一步说明。实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。
27.实施例1马铃薯stice1基因序列比对及克隆
28.通过网站https://phytozome-next.jgi.doe.gov/数据库分析马铃薯stice1基因序列，并以四倍体马铃薯品种底西芮作为模板对其进行克隆。底西芮，马铃薯品种，椭圆形，薯皮红色，薯肉浅黄色，抗马铃薯x病毒病，中抗马铃薯y病毒病，由农业部从荷兰引入。在世界上组培应用广泛，被公认是马铃薯中的模式基因型。
29.在0.2mlpcr管中加样体系(表1)；短暂离心，混匀样品。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，50～65℃(不同的引物组合需要摸索其最适退火温度)退火30s，72℃延伸20s～5min(根据目的片段长度做相应的调整)，30～35个循环；72℃延伸5min。取5～10μl产物，用1％～2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，克隆基因大小为1,593bp(图1)，序列如seq id no.1所示。
30.表1pcr反应体系
[0031][0032]
实施例2马铃薯stice1基因在提高植物抗逆性中的应用
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1、过表达与基因编辑敲除载体构建
[0034]
构建过表达载体：利用dnaman对马铃薯stice1基因序列进行分析比对，采用pmdc85作为目的载体。以马铃薯品种底西芮脱毒组培苗作为实验材料，提取叶片总rna，反转录成cdna。以cdna作为模板，用pcr技术扩增目的片段，再将目的片段连接到t载体进行测序，确保没有碱基发生突变以用于下一步过表达载体的构建。选择saci和asci作为酶切连接位点，最终将目的基因片段连接到过表达载体pmdc85上，得到的重组载体命名为pmdc85-stice1。
[0035]
构建载体所需要设计的引物如下表2：
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表2过表达与基因编辑敲除载体构建及检测引物序列
[0037][0038]
[0039]
pmdc85载体图如图2所示。
[0040]
2、农杆菌介导马铃薯转化愈伤组织
[0041]
目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统，外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术。
[0042]
农杆菌介导法具有材料范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点。发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)含有ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其ri质粒上的t-dna插入到宿主植物基因组中，这一点与ti质粒相类似。转移机制也类似，所不同的是vir区和t-dna区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上，vira的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活virg的产物。t-dna区的tl区具有较高的稳定性，tr区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。tr区可进行改造，这样ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使t-dna整合到植物基因组中。t-dna整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最关键的步骤。t-dna在寄主细胞染色体上的整合是随机的，但对转录活化区域有所偏好。t-dna通过与事先断裂的寄主dna双链(dsb)发生重组来完成整合，进而进行表达。
[0043]
经过前期摸索，目前采用的转化体系如下：
[0044]
(1)将马铃薯四倍体品种底西芮幼苗进行扩繁培养，选择生长周期为28天至42天长势良好的无菌苗作为实验材料。
[0045]
(2)分别剪取一定大小的马铃薯无菌苗的茎段和叶片，作为转化的外植体。
[0046]
(3)外植体置于预培养基上，在25℃，16小时/8小时光照/暗条件下预培养，培养时间为2天。
[0047]
(4)将转化pmdc85-stice1的农杆菌菌液用ms液体培养基稀释到od
600
为0.5-0.6，外植体与菌液混合后浸染10分钟。用滤纸吸干外植体上的菌液，置于共培养基上，28℃黑暗条件下培养2天。
[0048]
(5)将茎段外植体转移到愈伤诱导培养基上，25℃，16小时光照条件下培养。
[0049]
(6)待愈伤组织生成后，将茎段外植体转移到芽诱导培养基上，每10天更换一次培养基，诱导芽的分化。
[0050]
(7)待诱导的芽生长到2至3厘米时，将其剪下置于生根培养基上(如图3、图4)。
[0051]
3、马铃薯stice1基因过表达阳性株系逆境胁迫表型分析
[0052]
对突变体材料进行低温胁迫以及盐胁迫下的生长表型实验，观察马铃薯stice1过表达阳性植株与野生型品种底西芮在各个胁迫环境下幼苗的生长形态，比较它们之间的区别，初步确定stice1功能作用。
[0053]
3.1马铃薯阳性株系在冷胁迫处理下表型分析
[0054]
温度是影响植物生长发育各个阶段的重要因素，植物可以在一定的温度范围保持正常的生长状态。低温胁迫会使植物受到冷害和冻害，冷害是冰点以上低温对植物的危害，相对的植物对冷害的适应能力称为抗冷性植物受到冷害较直接的表现形式是，叶片失绿、萎蔫、死苗、籽粒空瘪、表皮变色、局部坏死等。间接表现为膜透性增加选择透性减弱、膜内
大量溶质外渗；吸水能力和蒸腾速率都明显下降，水分代谢失调；原生质流动减慢或停止；叶绿体分解加速，叶绿素含量下降等。冻害是指植物受到冰点以下的低温伤害，相对的植物对冻害的适应能力称为抗冻性。植物受到冻害就比较严重了，如叶片的组织因细胞失去膨压而变软，颜色变为褐色，随时可能死亡。冻害的机理表现为胞间结冰环境温度随时间缓慢下降，细胞间隙结冰，引起胞质水分亏缺；胞内结冰环境温度骤然下降、质外体与共质体全都结冰，冰在形成过程中会对亚细胞精细结构的机械伤害。
[0055]
本发明将马铃薯stice1过表达阳性植株与野生型底西芮生长状态一致的无菌组培苗含有侧芽的茎段同时扦插到ms培养基上，放入4℃光照培养箱中进行培养。生长约60天时，对各自幼苗进行农艺性状分析，马铃薯stice1过表达阳性植株相对于野生型具有明显的抵御冷害胁迫能力(如图5)。
[0056]
将各个幼苗从ms培养基中取出，冲洗清理残余的培养基，测量野生型与各个阳性植株的农艺形状指标，包括地上地下部分的长度、称取整株幼苗的重量、统计侧根数量与长度等(如图6)。
[0057]
3.2马铃薯阳性株系在盐胁迫处理下表型分析
[0058]
盐胁迫是指土壤中盐离子浓度过高从而对植株的生长发育产生胁迫，产生大量危害。
[0059]
(1)生理干旱：土壤中可溶性盐类过多，由于渗透势增高而使土壤水势降低，根据水从高水势向低水势流动的原理，根细胞的水势必须低于周围介质的水势才能吸水，所以土壤盐分愈多根吸水愈困难，甚至植株体内水分有外渗的危险。因而盐害的通常表现实际上是旱害，尤其在大气相对湿度低的情况下，随蒸腾作用加强，盐害更为严重，一般作物在湿季耐盐性增强。
[0060]
(2)离子的毒害作用：在盐分过多的土壤中植物生长不良的原因，不完全是生理干旱或吸水困难，而是由于吸收某种盐类过多而排斥了对另一些营养元素的吸收，产生了类似单盐毒害的作用。
[0061]
(3)破坏正常代谢：盐分过多对光合作用、呼吸作用和蛋白质代谢影响很大。盐分过多会抑制叶绿素生物合成和各种酶的产生，尤其是影响叶绿素-蛋白复合体的形成。盐分过多对呼吸的影响，多数情况下表现为呼吸作用降低，也有些植物增加盐分具有提高呼吸的效应。
[0062]
本发明将马铃薯stice1过表达阳性植株与野生型底西芮生长状态一致的无菌组培苗含有侧芽的茎段同时扦插到含有100mmolnacl的ms培养基上，于温室中进行培养。生长约60天时，对各自幼苗进行农艺性状分析，马铃薯stice1过表达阳性植株相对于野生型具有明显的抵御盐胁迫能力(如图7)。
[0063]
将各个幼苗从ms培养基中取出，冲洗清理残余的培养基，测量野生型与各个阳性植株的农艺形状指标，包括地上地下部分的长度、称取整株幼苗的重量、统计侧根数量与长度等(如图8)。