技术特征：
1.hiscript ii反转录酶在进行rna病毒核酸的闭管可视化检测中的应用。2.一种用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于其步骤包括：(1)在反应管中加入反转录反应、核酸扩增反应偶联核酸侵入反应、纳米金探针杂交显色反应的所有组分，并加入靶核酸rna；(2)将反应温度调至低于纳米金探针杂交显色反应的反应温度，进行反转录反应；(3)将反应温度调高进行核酸扩增反应，同时将核酸扩增反应中的退火温度设置为核酸侵入反应的反应温度，使核酸扩增反应和核酸侵入反应同时进行；或者将反应温度调高进行核酸扩增反应，然后降温进行核酸侵入反应；(4)降低反应温度至纳米金探针杂交显色温度，进行纳米金探针的杂交显色反应，通过肉眼观察颜色变化判断结果；所述反转录反应使用的反转录酶是hiscript ii反转录酶。3.根据权利要求2所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于其中所述的核酸侵入反应包括针对靶核酸特异性的上游探针和下游探针、5’flap外切酶或5’flap内切酶、以及一个发卡探针；上游探针的3’端含有一个侵入碱基，并且tm值高于核酸侵入反应的温度，可以与靶核酸稳定结合；下游探针5
‘
端含有翘起的flap片段，并且tm值接近核酸侵入反应的温度，上游探针、下游探针和靶核酸形成可被5’flap外切酶或5’flap内切酶识别并切割的三碱基重叠结构，并将flap片段切割下来；发卡探针5’端和3’端分别含有一段序列可以与纳米金颗粒表面修饰的两种核酸探针结合，中间部分还含有与flap片段互补的序列，与切割下的flap片段形成可被5’flap外切酶或5’flap内切酶识别并切割的三碱基重叠结构；其中所述的纳米金探针杂交显色反应采用的纳米金颗粒表面通过巯基修饰有两种核酸探针，并对纳米金颗粒未修饰探针的部分进行封堵。4.根据权利要求2所述的反转录反应的最高温度低于纳米金探针杂交显色反应的反应温度至少5℃。5.根据权利要求2所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述纳米金颗粒表面采用硅烷化试剂、peg或寡肽进行封堵。6.根据权利要求2所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述核酸侵入反应中的下游探针和发卡探针3’端进行封闭修饰。7.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述核酸扩增反应中的退火温度为60-63℃。8.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述核酸扩增反应中的pcr引物tm值不低于65℃。9.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述核酸扩增反应指的是聚合酶链式反应pcr、切刻内切酶辅助核酸扩增neaa、环介导等温扩增反应lamp或连接扩增反应lcr。10.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述核酸扩增反应使用的酶是taq dna聚合酶、tth dna聚合酶或pfu dna聚合酶。11.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述5’flap外切酶或5’flap内切酶指的是afu fen、mth fen或pfu fen。
12.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：反转录反应的温度为35-45℃。13.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：纳米金探针杂交显色反应的温度为53-58℃。14.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：纳米金颗粒表面修饰的两种核酸探针分别与发卡探针的5’端片段和发卡探针的3’端片段结合，当待测样本中存在靶核酸序列时，发卡探针的5’端片段被切割，然后进行纳米金探针杂交显色反应，使纳米金探针呈分散状态，否则呈聚集状态。15.根据权利要求2-6中任一项所述的用于rna病毒核酸的闭管可视化检测方法，其特征在于：所述反应体系包含5-30mm tris,4-10mm镁离子和20-80mm钠离子。
技术总结
本发明公开一种用于RNA病毒核酸的闭管可视化检测新方法，整个检测包括三个部分：反转录反应(将靶RNA反转录成cDNA)、核酸扩增反应偶联核酸侵入反应(将产物检测转化为核酸片段检测)及纳米金探针杂交显色反应(将核酸片段检测转化为可视化检测)，通过控制温度所有反应可在单个封闭体系中依次进行，无需其他额外操作，实现“样本进，结果出”的核酸可视化检测。本发明方法操作简便、成本低廉、具有高灵敏度和高特异性等特点，不依赖荧光检测设备，可通过肉眼直接判读结果，适用于多种病原体核酸的可视化检测，在现场即时检测中具有良好的应用前景。前景。前景。
技术研发人员：周国华 单靖雯 武海萍
受保护的技术使用者：中国人民解放军东部战区总医院
技术研发日：2022.12.21
技术公布日：2023/3/16