通过向固体生长培养基直接添加荧光染料来检测微生物的方法与流程

本发明涉及微生物学领域，更具体来说涉及用于快速检测和任选地计数样品中感兴趣的微生物或成组微生物的方法。

背景技术：

1、微生物可能污染任何环境、任何被设计用于人类和动物消费或使用的产品，例如食品、饮料、医疗器械、药品或化妆品。这些微生物的存在不仅会导致所述产品的变质或腐败，而且如果被人类或动物食用或给药到人类或动物，还会导致疾病。为了确保这些产品的安全性，需要进行微生物测试以检查在正常使用条件下的污染风险，从而防止中毒或感染爆发。特别是对于医疗器械、药品或化妆品行业来说，对无菌的需要是非常重要的，并且在整个供应链中检测产品和原材料的微生物质量都是重要的，因为在产品的每个生产阶段都可能出现缺陷。

2、当然，微生物也可能感染人类或动物，并且在临床诊断中需要检测和/或定量造成感染的微生物。例如，尿路感染(uti)的诊断可以通过定量尿液培养来进行。传统上，认为尿液中存在1,000或更多个细菌/ml代表了显著的细菌尿，指示了uti。

3、对于所有这些行业和临床应用来说，污染阈值和使用的方法可能有所不同。然而，在尽可能早的阶段发现相关微生物的存在总是至关重要的。

4、自19世纪以来，在皮氏培养皿上培养，即路易·巴斯德的方法，一直是鉴定和计数微生物的最有效方法。到目前为止，在许多行业中这项技术仍然是检测和计数微生物的参考方法。所述方法简单：从样品中提取微生物，将它们放置在含有适合的培养基的专用皮氏培养皿上，并在菌落变得肉眼可见时对它们进行计数。尽管可靠，但这种方法时间长(根据目标微生物的不同，可以长达几天)。

5、为了缩短测定的时长，建议了使用指示剂例如产色底物、产荧光底物或荧光或放射性标记的抗体来检测较小尺寸的微菌落(例如国际专利申请wo 96/14431、wo 2013/050598、wo 2008/118400)。然而，对于大多数这些方法来说，生长和指示阶段必须分开才能获得最佳结果：生长阶段用于快速细胞生长，其中没有阻碍生长的有害指示剂，而指示阶段用于专门着色和鉴定，其有效地允许检测较小尺寸的微菌落。

6、多年来，已进行了许多其他尝试来减少测定所需的时间，特别是使用基于免疫学方法、核酸扩增方法或使用荧光抗体或产荧光底物进行标记的流式细胞术方法的不依赖于培养的方法。然而，这些方法仍然昂贵，工作流程不容易，需要高技能的专家和/或浓缩的样品，而且对大多数方法来说，很难区分活微生物和死微生物。

7、因此，对快速、灵敏、用户友好和成本效益高的用于检测和计数样品中的微生物的方法，仍存在着需求。

技术实现思路

1、本发明人在本文中提供了一种满足这种需求的方法。

2、第一方面，本发明涉及一种用于检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法，所述方法包括：

3、a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触；

4、b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间；和

5、c)检测或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落，

6、从而检测或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。

7、任选地，在步骤a)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上，并且在步骤a)中，将所述膜和微生物与所述固体生长培养基和所述至少一种荧光染料接触。

8、步骤a)可以包括

9、a1)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与至少一种荧光染料接触，和

10、a2)将所述样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基在容器中接触，

11、步骤a1)和a2)同时或以任何次序顺序进行。

12、优选地，步骤a1)在步骤a2)之前进行。

13、任选地，在步骤a2)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。具体而言，可以将所述样品在步骤a1)之前或之后，优选地在步骤a1)之后浓缩在膜滤器上。具体而言，在过滤所述样品之前或之后，可以将所述至少一种荧光染料在与所述样品相同的膜上过滤。可以在膜上过滤/浓缩之前将所述荧光染料添加到所述样品中，或者可以在过滤所述样品之前或之后，优选地在过滤所述样品之后将所述荧光染料过滤在同一个膜上。然后可以将所述膜滤器放置在所述生长培养基的表面上。

14、优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(mce)、聚偏氟乙烯(pvdf)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成，更优选地由mce或pvdf制成。

15、所述固体生长培养基可以对所述微生物或成组微生物具有选择性。

16、所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料可以选自mb660r、吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、cy5.5(优选为sulfo-cy5.5)、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta 650、seta 375、setau 647、setau 488、alexa fluor 488、atto 647和dapi、其衍生物及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自mb660r-dbco、mb660r-酸、吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5酸、sulfo-cy5.5酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor488-酸、alexa fluor 488-dbco、atto 647-酸和dapi、其衍生物及其组合。

17、在某些实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料、基于呫吨的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自draq5tm、alexa fluortm350、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、bodipytm500/510、prodan、alexa fluortm405、setatm650、setautm647、mbtm660r、alexafluortm488、attotm647和dapi、其衍生物及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料是draq5tm、alexa fluortm350-nhs酯、sulfo-cy5酸、bodipytm500/510、prodan、alexafluortm405-dbco、setatm650-dbco、setautm647-马来酰亚胺、mbtm660r-酸、mbtm660r-dbco、alexa fluortm488-酸、alexa fluortm488-dbco、attotm647-酸和dapi及其组合。可选地，所述至少一种荧光染料可以选自draq5tm、alexa fluortm350、太平洋蓝tm、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、bodipytm500/510、prodan、alexa fluortm405、瀑布蓝tm、setatm650、setautm647、setau488、mbtm660r、alexa fluortm488、attotm647和dapi、其衍生物及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料是draq5tm、alexa fluortm350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5酸、bodipytm500/510、prodan、alexa fluortm405-dbco、瀑布蓝tm、setatm650-dbco、setau488-nhs、setautm647-马来酰亚胺、mbtm660r-酸、mbtm660r-dbco、alexa fluortm488-酸、alexafluortm488-dbco、attotm647-酸和dapi及其组合。

18、可选地，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自mb660r、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、cy5.5(优选为sulfo-cy5.5)、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta 650、seta375、setau 647、setau488、alexa fluor 488和atto 647、其衍生物及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自mb660r-dbco、mb660r-酸、draq5、cytrak橙、alexa fluor350nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5酸、sulfo-cy5.5酸、bodipy 500/510、prodan、alexafluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco和atto 647-酸、其衍生物及其组合。

19、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以

20、-属于嗜热嗜酸细菌，并且优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus cycloheptanicus)、alicyclobacillus hesperidum、alicyclobacillus herbarius和alicyclobacillus contaminans及其组合；和/或

21、-属于醋酸菌，并且优选地选自属于醋杆菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter)和亚细亚菌属(asaia)的细菌及其组合；和/或

22、-属于乳酸菌，并且优选地选自属于乳杆菌属(lactobacillus)和魏斯氏菌属(weissellas)的细菌及其组合；和/或

23、-属于厌氧细菌，并且优选地选自梭状芽孢杆菌属(clostridium)和丙酸杆菌属(cutibacterium)细菌及其组合，和/或

24、-属于好氧中温细菌，并且优选地选自甲基杆菌属(methylobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、葡萄球菌属(staphylococcus)、不动杆菌属(acinetobacter)、克罗诺杆菌属(cronobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、沙门氏菌属(salmonella)、肠球菌属(enterococcus)、listeria、志贺氏菌属(shigella)、考克氏菌属(kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)及其组合，和/或

25、-属于革兰氏阴性细菌，并且优选地选自埃希氏杆菌属(escherichia)和假单胞菌属(pseudomonas)及其组合，和/或

26、-属于酵母和霉菌，并且优选地选自假丝酵母属(candida)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、酵母属(saccharomyces)、地霉属(geotrichum)和青霉属(penicillium)及其组合，和/或

27、-属于异养细菌，优选地选自属于不动杆菌属(acinetobacter)、气单胞菌属(aeromonas)、短波单胞菌属(brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、爱德华氏菌属(edwardsiella)、肠杆菌属(enterobacter)、埃希氏杆菌属(escherichia)、苍白杆菌属(ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、甲基杆菌属(methylobacterium)、莫拉氏菌属(moraxella)、泛菌属(pantoea)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、罗尔斯通菌属(ralstonia)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)、志贺氏菌属(shigella)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、弧菌属(vibrio)、耶尔森氏菌属(yersinia)、芽孢杆菌属(bacillus)、肠球菌属(enterococcus)、微球菌属(micrococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)的细菌及其组合。

28、优选地，在本发明的方法中，

29、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于嗜热嗜酸细菌的微生物，优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus cycloheptanicus)、alicyclobacillus hesperidum、alicyclobacillus herbarius和alicyclobacilluscontaminans及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自mb660r和衍生物，更优选地选自mb660r-酸和mb660r-dbco，甚至更优选为mb660r-dbco；和/或

30、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于醋酸菌(aab)的微生物，优选地选自属于醋杆菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter)和亚细亚菌属(asaia)的细菌及其组合，更优选地选自醋酸醋杆菌(acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(asaia siamensis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和dapi及其组合，优选地选自alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexafluor488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自mb660r和atto647及其衍生物和组合，优选地选自mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合，更优选地选自mb660r-酸和atto647-酸及其组合；和/或

31、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于乳酸菌(lab)的微生物，优选地选自属于乳杆菌属(lactobacillus)和魏斯氏菌属(weissellas)的细菌及其组合，并且更优选地选自干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和融合魏斯氏菌(weissellas confusa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和dapi及其组合，优选地选自alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自alexa fluor 488、mb660r和dapi及其衍生物和组合，特别是选自alexa fluor488-酸、mb660r-酸和dapi及其组合，优选地选自基于呫吨的染料，更优选地选自alexa fluor 488-酸和mb660r-酸及其组合，甚至更优选为mb660r-酸；和/或

32、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于厌氧细菌的微生物，优选地选自梭状芽孢杆菌属(clostridium)和丙酸杆菌属(cutibacterium)细菌及其组合，更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(cutibacteriumacnes)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和dapi及其组合，优选地选自mb660r、cy5tm(优选为sulfo-cy5)和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自mb660r-dbco、sulfo-cy5酸和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料，优选地选自mb660r和cy5(优选为sulfo-cy5)及其衍生物和组合，更优选地选自mb660r-dbco和sulfo-cy5酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料包括mb660r-dbco和sulfo-cy5酸；和/或

33、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(amb)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(methylobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、葡萄球菌属(staphylococcus)、不动杆菌属(acinetobacter)、克罗诺杆菌属(cronobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、沙门氏菌属(salmonella)、肠球菌属(enterococcus)、李斯特菌属(listeria)、志贺氏菌属(shigella)、考克氏菌属(kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(listeria grayi)、宋内志贺氏菌(shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自draq5tm、alexafluortm350、太平洋蓝tm、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、bodipytm染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluortm405、瀑布蓝tm、seta染料(优选为seta 650)、setau染料(优选为setau 647和setau 488)、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自draq5tm、alexa fluortm350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy500/510、prodan、alexa fluortm405-dbco、瀑布蓝tm、seta 650-dbco、setau 488-nhs、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合；和/或

34、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(amb)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(methylobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、葡萄球菌属(staphylococcus)、不动杆菌属(acinetobacter)、克罗诺杆菌属(cronobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、沙门氏菌属(salmonella)、肠球菌属(enterococcus)、志贺氏菌属(shigella)、考克氏菌属(kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、bodipy染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料(优选为seta650或seta 375)、setau染料(优选为setau 647或setau 488)、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexafluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexafluor405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、bodipy染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料(优选为seta 650或seta 375)、setau染料(优选为setau 647或setau 488)、alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合，更优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自mb660r及其衍生物和组合，任选地与选自基于花青的染料的荧光染料、优选为cy5、特别是sulfo-cy5组合，更优选为mb660r-dbco，任选地与sulfo-cy5-酸组合；和/或

35、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(escherichia)、变形杆菌属(proteus)和假单胞菌属(pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和dapi及其组合，优选地选自cy5(优选为sulfo-cy5)、mb660r和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和dapi及其组合，优选地选自cy5tm(优选为sulfo-cy5)、mb660r、dapi及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合；和/或

36、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(escherichia)和假单胞菌属(pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于芘的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料和dapi及其组合，优选地选自cy5(优选为sulfo-cy5)、alexa fluor 350、alexa fluor 405、mb660r和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸、alexa fluor 350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco、mb660r-dbco和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于芘的染料、基于香豆素的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自cy5(优选为sulfo-cy5)、alexa fluor 350、alexa fluor 405和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸、alexa fluor 350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco和mb660r-dbco及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于芘的染料、基于香豆素的染料及其组合，优选地选自alexa fluor 350和alexa fluor 405及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco及其组合。甚至更优选地，所述至少一种荧光染料是alexa fluor 350-nhs酯与alexa fluor 405-dbco的组合；和/或

37、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阳性细菌的微生物，优选地选自属于葡萄球菌属(staphylococcus)和肠球菌属(enterococcus)的细菌及其组合，更优选地选自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和粪肠球菌(enterococcusfaecalis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和dapi及其组合，优选地选自cy5tm(优选为sulfo-cy5)、mb660r、dapi及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自cy5(优选为sulfo-cy5)和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合；和/或

38、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(acinetobacter)、气单胞菌属(aeromonas)、短波单胞菌属(brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、爱德华氏菌属(edwardsiella)、肠杆菌属(enterobacter)、埃希氏杆菌属(escherichia)、苍白杆菌属(ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、甲基杆菌属(methylobacterium)、莫拉氏菌属(moraxella)、泛菌属(pantoea)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、罗尔斯通菌属(ralstonia)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)、志贺氏菌属(shigella)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、弧菌属(vibrio)、耶尔森氏菌属(yersinia)、芽孢杆菌属(bacillus)、肠球菌属(enterococcus)、微球菌属(micrococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumanii)、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(brevundimonasdiminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、人苍白杆菌(ochrobactrumanthropic)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(moraxella osloensis)、成团泛菌(pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、滕黄微球菌(micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料和基于呫吨的染料及其组合，优选地选自alexa fluortm350、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、alexa fluortm405和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluortm350-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluortm405-dbco和mb660r-dbco及其组合，甚至更优选地选自(i)mb660r与sulfo-cy5、优选地mb660r-dbco与sulfo-cy5-酸的混合物，和(ii)alexa fluortm350与alexa fluortm405、优选地alexafluortm350-nhs酯与alexa fluortm405-dbco的混合物；和/或

39、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(acinetobacter)、气单胞菌属(aeromonas)、短波单胞菌属(brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、爱德华氏菌属(edwardsiella)、肠杆菌属(enterobacter)、埃希氏杆菌属(escherichia)、苍白杆菌属(ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、甲基杆菌属(methylobacterium)、莫拉氏菌属(moraxella)、泛菌属(pantoea)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、罗尔斯通菌属(ralstonia)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)、志贺氏菌属(shigella)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(yersinia)、芽孢杆菌属(bacillus)、肠球菌属(enterococcus)、微球菌属(micrococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、人苍白杆菌(ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(moraxella osloensis)、成团泛菌(pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、黏质沙雷氏菌(serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(micrococcusluteus)(嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、cy5.5(优选为sulfo-cy5.5)、bodipy染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料(优选为seta 650或seta 375)、setau染料(优选为setau 647或setau 488)、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、sulfo-cy5.5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、cy5.5(优选为sulfo-cy5.5)、bodipy染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluor405、瀑布蓝、seta染料(优选为seta 650或seta 375)、setau染料(优选为setau 647或setau 488)、alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合，更优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、sulfo-cy5.5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合；和/或

40、-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(candida)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、酵母属(saccharomyces)、地霉属(geotrichum)和青霉属(penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(candida albicans)、拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、白地霉(geotrichum candidum)、宛氏青霉(penicilliumvariotii)、产黄青霉(penicillium chrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自吖啶橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、prodan、alexa fluor405、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta染料(优选为seta 650)、setau染料(优选为setau 647或setau488)、alexa fluor 488、mb660r和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自alexafluortm350、太平洋蓝tm、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、prodan、alexa fluortm405、瀑布蓝tm、seta染料(优选为seta 650)、setau染料(优选为setau 647和setau 488)、alexa fluor488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluortm350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5-酸、prodan、alexa fluortm405-dbco、瀑布蓝tm、seta 650-dbco、setau 488-nhs、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自mb660r及其衍生物和组合，优选为mb660r-dbco；和/或

41、-所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(tab)、醋酸菌(aab)、乳酸菌(lab)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自alexa fluortm350、太平洋蓝tm、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、alexa fluortm405、瀑布蓝tm、seta染料(优选为seta 650)、setau染料(优选为setau 647和setau 488)、alexa fluor 488和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluortm350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluortm405-dbco、瀑布蓝tm、seta 650-dbco、setau 488-nhs、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合，甚至更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

42、在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(tab)、醋酸菌(aab)、乳酸菌(lab)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5(优选为sulfo-cy5)、alexa fluor 405、瀑布蓝tm、seta染料(优选为seta 650或seta 375)、setau染料(优选为setau 647和setau488)、alexa fluor 488和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluor405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 488-nhs、setau647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合，甚至更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

43、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含属于好氧中温细菌(amb)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(methylobacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、葡萄球菌属(staphylococcus)、不动杆菌属(acinetobacter)、克罗诺杆菌属(cronobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、沙门氏菌属(salmonella)、肠球菌属(enterococcus)、李斯特菌属(listeria)、志贺氏菌属(shigella)、考克氏菌属(kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(listeria grayi)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自draq5tm、alexa fluortm350、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、bodipytm染料(优选为bodipy 500/510)、prodan、alexa fluortm405、seta染料(优选为seta650)、setau染料(优选为setau647)、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自draq5tm、alexa fluortm350-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluortm405-dbco、seta 650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。

44、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或可以包含属于酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(candida)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、酵母属(saccharomyces)、地霉属(geotrichum)和青霉属(penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(candida albicans)、拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、白地霉(geotrichum candidum)、宛氏青霉(penicilliumvariotii)、产黄青霉(penicillium chrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合，优选地选自alexafluortm350、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、prodan、alexa fluortm405、seta染料、setau染料、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合，更优选地选自alexafluortm350-nhs酯、sulfo-cy5-酸、prodan、alexa fluortm405-dbco、seta650-dbco、setau647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。

45、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或可以包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(escherichia)和假单胞菌属(pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自cy5tm(优选为sulfo-cy5)、mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

46、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(tab)、醋酸菌(aab)、乳酸菌(lab)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自alexa fluortm350、cy5tm(优选为sulfo-cy5)、alexa fluortm405、seta染料(优选为seta 650)、setau染料(优选为setau647)、alexa fluor 488和mb660r及其衍生物和组合，更优选地选自alexa fluortm350-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluortm405-dbco、seta 650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、alexafluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合，甚至更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

47、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于嗜热嗜酸细菌，并且所述至少一种荧光染料可以包含选自基于呫吨的染料，优选地选自mbtm660r及其衍生物的染料，更优选为mbtm660r dbco。

48、具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含选自巴西曲霉(aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(candida albicans)和大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)及其组合的微生物，并且所述至少一种荧光染料选自bodipy 500/510；alexa fluor 350或其衍生物，优选为alexa fluor 350-nhs酯；太平洋蓝或其衍生物，优选为太平洋蓝-nhs酯；prodan；alexa fluor 405或其衍生物，优选为alexa fluor405-dbco；瀑布蓝；seta 650或其衍生物，优选为seta 650-dbco；setau 488或其衍生物，优选为setau 488-nhs；setau 647或其衍生物，优选为setau 647-马来酰亚胺，及其任何组合。

49、在其中在步骤a)或步骤a2)之前将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上的实施方式中，可以在步骤b)之后并且在步骤c)之前将所述膜滤器从所述固体生长培养基上取下，并且可以在步骤c)中检测和/或计数其上的微菌落。可选地，可以将所述膜滤器保持在所述固体生长培养基上来进行步骤c)。

50、优选地，在步骤c)中，使用荧光显微镜或固相细胞仪检测和/或计数发射对应于所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落。

51、另一方面，本发明还涉及本发明的方法用于确定样品是否含有至少一种感兴趣的微生物，用于确定样品是否无菌，或用于确定样品的生物负载的用途。

52、另一方面，本发明还涉及一种试剂盒用于根据本发明的方法检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的用途，所述试剂盒包含：

53、(i)-至少一种荧光染料，其优选地如上所定义，

54、和任选的

55、-至少一个膜滤器，其优选地如上所定义，和/或

56、-至少一个容器，其包含含有支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，和/或

57、-提供所述试剂盒的使用说明的小册子，或

58、(ii)-至少一个容器，其包含含有优选地如上所定义的至少一种荧光染料和支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，

59、和任选的

60、-至少一个膜滤器，其优选地如上所定义，和/或

61、-提供所述试剂盒的使用说明的小册子。